Artigo de método

Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química

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DOI:

10.3791/63677

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28 de abril de 2022

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1Department of Chemistry, Purdue University

Neste artigo

Resumo

Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.

Resumo

A dispersão estimulada de Raman (SRS) e a microscopia de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) são as tecnologias de imagem de dispersão raman mais amplamente utilizadas. As imagens hiperespectrais SRS e CARS oferecem informações espectrais de Raman a cada pixel, o que permite uma melhor separação de diferentes composições químicas. Embora ambas as técnicas exijam dois lasers de excitação, seus esquemas de detecção de sinal e propriedades espectrais são bem diferentes. O objetivo deste protocolo é realizar imagens de SRS hiperespectrais e CARS em uma única plataforma e comparar as duas técnicas de microscopia para imagens de diferentes amostras biológicas. O método de foco espectral é empregado para adquirir informações espectrais usando lasers femtosegundos. Utilizando amostras químicas padrão, a sensibilidade, resolução espacial e resolução espectral de SRS e CARS nas mesmas condições de excitação (ou seja, energia na amostra, tempo de moradia dos pixels, lente objetiva, energia de pulso) são comparadas. Os contrastes de imagem de CARROS e SRS para amostras biológicas são justtaposed e comparados. A comparação direta dos desempenhos de CARROS e SRS permitiria a seleção ideal da modalidade para imagem química.

Introdução

O fenômeno de dispersão de Raman foi observado pela primeira vez em 1928 por C. V. Raman1. Quando um fóton incidente está interagindo com uma amostra, um evento de dispersão inelástica pode ocorrer espontaneamente, no qual a mudança de energia do fóton corresponde a uma transição vibracional das espécies químicas analisadas. Este processo não requer o uso de uma etiqueta química, tornando-a uma ferramenta versátil e livre de rótulos para análise química, minimizando a perturbação da amostra. Apesar de suas vantagens, a dispersão espontânea de Raman sofre de uma seção transversal de baixa dispersão (tipicamente 1011 menor que a seção transversal de absorção infravermelha [IR]), o que requer longos tempos de aquisição para análise2. Assim, a busca pelo aumento da sensibilidade do processo de dispersão de Raman é essencial para impulsionar as tecnologias Raman para imagens em tempo real.

Uma maneira eficaz de aumentar muito a sensibilidade da dispersão de Raman é através de processos coerentes de dispersão de Raman (CRS), para os quais dois pulsos de laser são tipicamente usados para excitar transições vibracionais moleculares 3,4. Quando a diferença de energia de fótons entre os dois lasers corresponde aos modos vibracionais das moléculas de amostra, fortes sinais raman serão gerados. Os dois processos de CRS mais usados para imagem são a dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) e a dispersão de Raman estimulada (SRS)5. Nas últimas duas décadas, os desenvolvimentos tecnológicos avançaram nas técnicas de microscopia de CARROS e SRS para se tornarem ferramentas poderosas para quantificação sem rótulos e elucidação de alterações químicas em amostras biológicas.

A imagem química por microscopia CARS pode ser datada de 1982 quando a varredura a laser foi aplicada pela primeira vez para adquirir imagens CARS, demonstradas por Duncan et al6. A modernização da microscopia CARS foi bastante acelerada após as amplas aplicações da microscopia de fluorescência multifotona laser 7. Os primeiros trabalhos do grupo Xie usando lasers de alta taxa de repetição tornaram-se uma plataforma de imagem química de alta velocidade, sem rótulos, para a caracterização de moléculas em amostras biológicas 8,9,10. Um dos principais problemas para a imagem cars é a presença de um fundo não ressonante, que reduz o contraste da imagem e distorce o espectro Raman. Muitos esforços foram feitos para reduzir o fundo não ressonante 11,12,13,14,15 ou para extrair sinais raman ressonantes do espectro CARS 16,17. Outro avanço que tem avançado muito o campo é a imagem de CARS hiperespectral, que permite o mapeamento espectral em cada pixel de imagem com melhor seletividade química 18,19,20,21.

A dispersão de Raman Estimulada (SRS) é uma tecnologia de imagem mais jovem do que cars, embora tenha sido descoberta anteriormenteaos 22 anos. Em 2007, a microscopia SRS foi relatada usando uma baixa taxa de repetição da fonte laser23. Logo, vários grupos demonstraram imagens de SRS de alta velocidade usando lasers de alta taxa de repetição 24,25,26. Uma das principais vantagens da microscopia SRS sobre carros é a ausência do fundo não ressonante27, embora outros fundos como modulação transversal (XPM), absorção transitória (TA), absorção de dois fótons (TPA) e efeito fototermal (PT), possam ocorrer com o SRS28. Além disso, o sinal SRS e a concentração amostral têm relações lineares, ao contrário dos CARS, que tem uma dependência quadrática de concentração de sinal29. Isso simplifica a quantificação química e o descompramento espectral. A SRS multicolorida e hiperespectral evoluiu de diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, com foco espectral sendo uma das abordagens mais populares para a imagem química 37,38.

Tanto os CARROS quanto o SRS requerem o foco da bomba e os raios laser de Stokes na amostra para combinar com a transição vibracional das moléculas para excitação de sinal. Os microscópios CARS e SRS também compartilham muito em comum. No entanto, a física subjacente a esses dois processos, e as detecções de sinais envolvidas nessas tecnologias de microscopia têm disparidades 3,39. CARS é um processo paramétrico que não tem acoplamento de energia net fóton-molécula3. O SRS, no entanto, é um processo não paramétrico, e contribui para a transferência de energia entre fótons e sistemas moleculares27. Em CARS, um novo sinal na frequência anti-Stokes é gerado, enquanto o SRS se manifesta como a transferência de energia entre a bomba e os raios laser stokes.

O sinal CARS satisfaz eq (1)28.

figure-introduction-1 (1)

Enquanto isso, o sinal SRS pode ser escrito como Eq (2)28.

figure-introduction-2(2)

Aqui, eup, is, ICARS, e ΔISRS são as intensidades do feixe de bomba, feixe de Stokes, sinal CARS e sinais SRS, respectivamente. Χ(3) é a suscetibilidade óptica não linear de terceira ordem da amostra, e é um valor complexo composto de partes reais e imaginárias.

Essas equações expressam os perfis espectrais e a dependência de concentração de sinais de CARROS e SRS. Diferenças na física resultam em esquemas de detecção diferentes para essas duas tecnologias de microscopia. A detecção de sinal em CARROS geralmente envolve a separação espectral de fótons recém-gerados e a detecção usando um tubo fotomultiplier (PMT) ou dispositivo acoplado por carga (CCD); para SRS, a troca de energia entre a bomba e os feixes de Stokes é geralmente medida pela modulação de alta velocidade de intensidade usando um modulador óptico e desmodulação usando um fotodiodo (PD) emparelhado com um amplificador de travamento.

Embora muitos desenvolvimentos tecnológicos e aplicações tenham sido publicados nos últimos anos nos campos de CARROS e SRS, não foram realizadas comparações sistemáticas das duas técnicas de CRS na mesma plataforma, especialmente para carros hiperespectrais e microscopia SRS. Comparações diretas em sensibilidade, resolução espacial, resolução espectral e capacidades de separação química permitiriam aos biólogos selecionar a melhor modalidade de quantificação química. Neste protocolo, são fornecidas etapas detalhadas para a construção de uma plataforma de imagem multimodal com as modalidades CARROS hiperespectrais e SRS baseadas em um sistema laser femtosegundo e foco espectral. As duas técnicas foram comparadas na direção para resolução espectral, sensibilidade à detecção, resolução espacial e contrastes de imagem das células.

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Protocolo

1. Configuração instrumental para imagens de CRS hiperespectrais

NOTA: A geração de sinal CRS requer o uso de lasers de alta potência (ou seja, classe 3B ou classe 4). Os protocolos de segurança devem ser abordados e os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados devem ser usados em todos os momentos quando se trabalha em potências de pico tão altas. Consulte a documentação adequada antes da experimentação. Este protocolo se concentra em projetar o caminho do feixe, chiar os pulsos femtosegundos e otimizar as condições de imagem. Um layout óptico geral deste microscópio CRS hiperespectral é mostrado na Figura 1. A configuração mostrada aqui é uma das muitas configurações existentes para microscopia CRS. O sistema de microscopia CRS usado neste protocolo é construído sobre uma fonte de laser femtosegundo de dupla saída e um microscópio de varredura a laser.

  1. Certifique-se de que a fonte laser fornece dois trens de pulso femtosegundos (120 fs de largura) com uma taxa de repetição de 80 MHz, incluindo um comprimento de onda fixo a 1.045 nm usado como feixe de Stokes, e um comprimento de onda incapaz de 680 a 1.300 nm usado como bomba. Sincronize os pulsos de saída com uma diferença de atraso óptico. Use um quadro de microscópio para construir a plataforma de imagem.
  2. Projetando o caminho do feixe
    1. Para controlar a potência do laser na amostra, use uma combinação de placa de meia onda e divisor de feixe de polarização (PBS) para cada feixe de laser.
    2. Instale um modulador acousto-óptico (AOM) no caminho do raio laser stokes. Concentre o feixe com uma lente de distância focal de 150 mm no AOM e recolima a saída de0ª ordem com uma lente de distância focal de 400 mm.
    3. Use o mesmo par de lentes (comprimentos focais de 150 mm e 400 mm) para expandir o feixe da bomba para combinar o tamanho do raio laser com os Stokes.
    4. Coloque as lentes de distância focal de 400 mm nos caminhos da bomba e do feixe stokes em estágios de tradução unidimensionais separados para ajustar a divergência do feixe e otimizar o tamanho do feixe antes de entrar no microscópio.
    5. Direcione o feixe da bomba com um espelho reto refletindo montado em um estágio de tradução motorizado para ajuste óptico de atraso. Se o feixe stokes precisar de atraso óptico, coloque esses componentes em seu caminho de feixe.
    6. Permita que ambos os feixes sejam combinados em um espelhodicróico com um comprimento de onda de corte a ~1.000 nm (entre os comprimentos de onda da bomba e stokes), de modo que o feixe de Stokes transmita através do espelhodicróico enquanto o feixe da bomba é refletido pelo espelhodicróico. Envie os feixes laser quase combinados para o microscópio.
    7. Para chirp a bomba e as vigas stokes, coloque barras de vidro em seus caminhos de vigas. Veja o passo 1.5 para mais detalhes.
    8. Para confirmar o alinhamento adequado e o tamanho do feixe, use diafragmas de íris após o espelhodicrómico e antes do microscópio. Especificamente, instale um em uma posição próxima e a outra a uma distância do espelhodicróico para confirmar um bom alinhamento e sobreposição do feixe. Use um cartão de visualização IR ou visualizador IR para visualizar o feixe durante o alinhamento.
    9. Use um PD rápido e um osciloscópio para medir aproximadamente o atraso óptico entre os pulsos da bomba e stokes. Acione o osciloscópio amostrando o trem de pulso laser.
    10. Bloqueie o feixe da bomba e prove o feixe de Stokes. Aproxime-se de um dos pulsos e coloque um cursor vertical nele para marcar sua localização temporal no osciloscópio.
    11. Desbloqueie o feixe da bomba e bloqueie o feixe de Stokes. Traduza o estágio de atraso até que a bomba da amostra pulsar temporalmente alinhada com a posição marcada.
  3. O microscópio de varredura a laser
    1. Para uma configuração de microscópio vertical, envie os feixes de laser combinados através de um periscópio para subir a um nível apropriado antes de alcançar os espelhos de varredura de galvo 2D.
    2. Meça o tamanho do raio laser antes do microscópio, e configure o par de lentes adequada após os espelhos de galvo para expandir o raio laser para melhor corresponder ao tamanho da pupila de entrada da lente objetiva.
    3. Construa um sistema 4 f usando as duas lentes, com a abertura traseira da lente objetiva e o centro dos dois espelhos galvo sendo planos conjugados. Alternativamente, use dois espelhos galvo 1D separados com dois sistemas de lentes 4 f para escaneamento a laser.
    4. Depois do condensador, projete um espelho 2 em flip para refletir os raios laser para coleta de sinal. Posicione uma lente com 2 de diâmetro no feixe transmitido para coletar e concentrar totalmente os sinais de transmissão nos detectores.
    5. Direcione os sinais cars para o PMT com um espelho dicroico com um corte de 776 nm, e permita que os sinais SRS transmitidos sejam detectados pelo PD. Use um filtro de bandpass (655/30 nm) antes do PMT para rejeitar pulsos de laser de excitação residual. Use um filtro de passagem curta (passe curto de 980 nm) antes que o PD bloqueie a entrada do feixe de Stokes no detector.
    6. Para detecção de sinal CARS, conecte um pré-amplificador e um conversor de tensão de corrente após o PMT e antes de enviar o sinal para o sistema de aquisição de dados. Ajuste a tensão pmt para otimizar o contraste de sinal e imagem.
    7. Use um gerador de função para modular o AOM a 1-10 MHz e use a mesma frequência que a referência para a demodulação de lock-in. Use um amplificador de travamento para extrair sinais SRS antes da aquisição de dados.
  4. Aquisição e exibição de dados
    1. Realize a aquisição de dados usando um cartão de aquisição de dados digitais (DAQ) em conjunto com um bloco terminal.
    2. Use as saídas analógicas do DAQ para controlar os espelhos galvo e as entradas analógicas para aquisição de sinal.
    3. Use software escrito em lab com base no LabVIEW que tenha uma tela multicanal simultânea para visualização em tempo real e economia de imagens (consulte Arquivo Suplementar).
  5. Chirping a fonte femtosegundo e medindo a resolução espectral
    NOTA: Para obter uma boa resolução espectral usando foco espectral, as hastes de vidro são usadas para introduzir dispersões e pulsos de laser de chirp do femtosegundo ao picosegundo. Para obter a melhor resolução espectral, a taxa de chirp do feixe de bomba precisa ser igual à do feixe de Stokes. Para este sistema de laser, a melhor resolução espectral pode ser alcançada com o chiar os pulsos laser de saída de ~120 fs para 3,4 ps para a bomba e 1,8 ps para os Stokes. Esta chirping é alcançada usando uma combinação 4+1 (quatro no feixe combinado, um apenas no feixe stokes) de 150 mm de haste de vidro (SF-57), como descrito abaixo, e deve alcançar uma resolução espectral de 15 cm-1 . A duração do pulso pode ser medida usando um autocorrelador.
    1. Insira uma haste de vidro de 150 mm apenas no caminho do feixe stokes.
    2. Insira duas hastes de vidro de 150 mm no caminho combinado do feixe da bomba/Stokes após o divisor de feixedicrómico. Para aumentar o brilho, deixe que os raios laser combinados passem duas vezes as duas hastes de vidro colocando um espelho dielétrico em uma extremidade das hastes.
    3. Para medir a resolução espectral, prepare uma amostra química padrão (por exemplo, sulfóxido de dimetil [DMSO]) pressionada entre duas tampas de vidro e escaneie o estágio de atraso até que o sinal máximo seja alcançado.
    4. Mova o atraso óptico de 1.000 μm na direção de mudança vermelha. Em seguida, execute 200 quadros a 10 μm/passo em direção à direção blueshift para coletar a pilha de imagens hiperespectrais.
    5. Para converter os números de quadros em números de ondas, realize uma regressão linear utilizando o simétrico (2.913 cm-1) e assimétrico (2.994 cm-1) C-H esticando-se do DMSO e seus números de quadrocorrespondentes 40.
    6. Use o sinal XPM para medir o perfil de intensidade de foco espectral. Feche metade o diafragma no condensador e mova o foco para um deslizamento em branco. Colete o mesmo número de passos que para SRS hiperespectral. Para medir o fundo CARS não ressonante, concentre-se no deslizamento de tampa de vidro e colete o mesmo número de passos para as medidas cars hiperespectrais.
  6. Otimizando a relação sinal-ruído (SNR) das imagens
    1. Prepare uma amostra química para alinhamento do sistema. Siga o procedimento descrito na etapa 3.1 para preparação da amostra.
      NOTA: O DMSO é uma boa escolha porque é um produto químico de laboratório comum com sinais raman fortes e picos simétricos e assimétricos bem separados.
    2. Coloque a amostra no estágio do microscópio e adicione água ou óleo de imersão, se necessário, para a lente objetiva ou condensador. Mova corretamente a borda da gotícula DMSO no campo de visão e ajuste a lente objetiva para o melhor foco. Centralizar o condensador usando o método de iluminação Köhler41. Abra totalmente o diafragma no condensador.
    3. Sintonize o comprimento de onda do feixe de bomba até 800 nm (1.045 nm Stokes) para atingir o pico de 2.913 cm-1 CH3 . Ajuste a potência da bomba e do feixe de Stokes para ~30 mW antes do microscópio, ajustando a placa de meia onda (~10 mW de potência no plano de amostra).
    4. Para SRS, defina o ganho do amplificador de travamento para ~10 com uma constante de tempo de 7 μs (ao usar um tempo de mora de 10 μs pixel). Certifique-se de que a constante de tempo é menor do que o tempo de moradia dos pixels. Use Demod R para a saída AUX para sinais SRS.
    5. Para CARROS, envie a saída pmt para o pré-amplificador e conversor de tensão de corrente. Use o DAQ para adquirir a saída do conversor.
    6. Defina os parâmetros de aquisição de imagens no software de aquisição. Use um número de pixel de 200 x 200 com um tamanho de varredura de ~100 x 100 μm2. Certifique-se de que a imagem contém tanto a gota DMSO quanto uma área vazia.
    7. Escaneie a amostra e verifique a imagem na tela do computador. Escaneie o estágio de atraso motorizado no feixe de Stokes/bomba enquanto monitora as imagens em tempo real. Escaneie o atraso até que o sinal seja maximizado.
    8. Mova a gota DMSO para cobrir todo o campo de visão e verifique se a máxima do sinal DC está centrada na imagem (o sinal é dependente do feixe de bomba). Ajuste a posição do feixe da bomba através de um espelho ou o deslocamento de tensão no software de imagem.
    9. Após a otimização do DC, ajuste os espelhos do feixe de Stokes até que o sinal CA seja maximizado ajustando o valor do limiar para exibir ~50% de saturação. Verifique se a saturação está centrada na imagem. Se não, ajuste os espelhos apenas na viga stokes. Monitore o sinal durante o alinhamento como feedback em tempo real sobre a qualidade do alinhamento.
    10. Para determinar o SNR, selecione uma pequena região da imagem DMSO e meça o valor médio. Para o ruído, selecione uma pequena área na região vazia da imagem e determine tanto o valor médio médio quanto o desvio padrão. Subtrair o valor médio de ruído do valor médio do sinal e dividir os resultados pelo desvio padrão da região vazia.
    11. Se o SNR calculado não for alto o suficiente (tipicamente 800-1.000 para SRS e >10.000 para carros a uma tensão PMT de 0,4 V com esta combinação de energia), verifique e reoptimize a sobreposição do feixe, tamanhos de feixe e posição de estágio de atraso, ajuste fino do AOM e altere a frequência de modulação do gerador de funções até que o SNR esperado seja obtido.

2. Análise de imagens e processamento de dados

  1. Análise SNR
    1. Abra o software ImageJ. Para importar o arquivo .txt de amostra DMSO salvo, clique em | de Arquivo | de importação | de imagem de texto Abra.
    2. Uma vez que a imagem é importada, pressione CTRL+shift+C para trazer à tona a função de brilho e contraste (B&C). Para encontrar o sinal máximo da amostra, pressione o botão automático no B&C até que uma região da amostra DMSO pareça saturada.
    3. Clique na ferramenta de seleção oval na interface ImageJ e destaque uma pequena área da região Saturada DMSO. Uma vez destacado, pressione M para medir a média e o desvio padrão da área selecionada.
    4. Para medir o fundo, ajuste as barras na função B&C até que o sinal da região vazia possa ser observado. Clique na seleção oval e destaque uma região de fundo do mesmo tamanho da etapa 2.1.3. Certifique-se de que a região selecionada não contém DMSO. Pressione M para medir as estatísticas da área selecionada.
    5. Calcule o SNR de acordo com a etapa 1.6.10.
  2. Processamento de imagens crs hiperespectrais
    1. Importar o arquivo .txt de acordo com a etapa 2.1.1. Uma vez importado, clique em Imagem | Pilhas | Ferramentas | Montagem para Stack... para converter o arquivo em uma pilha de imagens.
    2. Role a montagem até que o primeiro pico DMSO esteja visível. Selecione uma região no DMSO e clique em Imagem | Empilhar | Plote O perfil do eixo Z para traçar o espectro intensidade versus número de quadros. Para extrair os dados espectrais brutos, clique na lista e copie os dados do perfil.
    3. Para converter o espectro recuperado em unidades de número de ondas, realize uma regressão linear conforme descrito na etapa 1.5.5.
  3. Adequado para medir a resolução espectral
    NOTA: As funções lorentzianas são usadas para se adequar ao espectro SRS e CARS28.
    1. Abra o software de montagem e, em seguida, copie e cole os dados de regressão linear no programa. Para ajustar os dados srs, destaque os dados e, em seguida, plote os dados como um gráfico de dispersão.
    2. Puxe o plano de dispersão. Clique em Análise | Picos e | de linha de base Vários | de pico de pico Abra o Diálogo para trazer o analisador de pico. Quando for puxado para cima, verifique se a entrada é o enredo atual e mude a função de pico para Lorentzian (Lorentz).
    3. Clique duas vezes em cada um dos dois picos de DMSO no gráfico para destacar as regiões a serem instaladas. Em seguida, clique em Open NLfit para trazer a janela de montagem . Clique no botão Fit até convergência e, em seguida, OK, para ver um resumo tabulado dos coeficientes de montagem (ver Eq (3)).
      NOTA: A equação abaixo mostra o formato de função Lorentzian no software. Um1/2 são as amplitudes dos picos de montagem, w1/2 são as larguras dos picos montados, e os valores x01/02 são os centros dos picos instalados. A variável independente é x e a variável dependente é y.
      figure-protocol-1 (3)
    4. Para encaixe espectral de CARROS, clique em Análise | Montagem | Ajuste de curva não linear | Diálogo Aberto. Selecione categoria: nova para definir uma nova função para CARROS. Use uma função de encaixe CARS de dois picos definida abaixo (ver Eq (4)) para encaixe espectral cars.
      figure-protocol-2 (4)
  4. Determinando a resolução espacial
    NOTA: Antes desta etapa, é importante saber a conversão entre o tamanho do pixel em uma ampliação específica, número de pixel e o tamanho da etapa em μm. Isso pode ser realizado usando uma amostra de um diâmetro conhecido que é maior do que a resolução de imagem esperada, medindo seu perfil de linha e encaixando uma função gaussiana para determinar a largura total pela metade do valor máximo (FWHM). Podem ser utilizadas metas de resolução ou amostras uniformes, como contas poliméricas.
    1. Adquira uma imagem de células ou partículas de polímero com menos de 200 nm de diâmetro.
    2. Use ImageJ para desenhar uma linha através da menor partícula da imagem.
    3. Pressione K para traçar o perfil de intensidade.
    4. Clique na lista da janela pop-up e copie as informações para o software de montagem.
    5. Plote o perfil em software de montagem e use o encaixe gaussiano (clique em Análise | Montagem | Ajuste de curva não linear | | de diálogo aberto Categoria: Funções Básicas; Função: Gauss).
    6. Leia a largura do pico após o encaixe. Use o pixel para a conversão de tamanho para obter a resolução real do microscópio.

3. Preparação de amostras para imagens de CRS hiperespectral

  1. Preparação de slides de imagem e amostras químicas
    1. Coloque um pedaço de fita dupla face em um deslizamento de tampa e corte uma pequena forma retangular da fita do meio da fita colocada para criar uma área aberta para a amostra ser colocada.
    2. Pipeta 1-2 μL de DMSO puro e dispensar a gota no centro da vaga.
    3. Coloque cuidadosamente a tampa superior e pressione suavemente as bordas das tampas para selar a câmara, certificando-se de que a amostra DMSO não entre em contato com as bordas da fita.
    4. Para experimentos de sensibilidade, prepare diluições seriais de DMSO em óxido de deutério (D2O) para dar uma faixa de concentração de 50%-0%. Pegue 1-2 μL de cada solução e prepare amostras prensadas conforme descrito acima.
  2. Preparação celular
    1. Semente as células em um prato de fundo de vidro de 35 mm (ou maior) no Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
    2. Incubar as células em uma câmara de incubação a 37 °C com uma atmosfera de CO2 de 5% durante a noite ou mais até que ~50%-80% de confluência seja alcançada.
    3. Imagem das células vivas diretamente ou fixar as células com uma solução de 10% de formalina para imagem.

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Resultados

Comparações da resolução espectral
A Figura 2 compara a resolução espectral da microscopia hiperespectral SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizando uma amostra de DMSO. Para o espectro SRS, duas funções lorentzianas (ver protocolo passo 2.3) foram aplicadas para se adequar ao espectro, e uma resolução de 14,6 cm-1 foi obtida utilizando-se o pico de 2.913 cm-1 . Para carros, foi utilizada...

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Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve a construção de um microscópio CRS multimodal e a comparação direta entre carros e imagens SRS. Para a construção do microscópio, as etapas críticas são a sobreposição do feixe espacial e temporal e a otimização do tamanho do feixe. Recomenda-se o uso de uma amostra padrão como o DMSO antes da imagem biológica para otimizar o SNR e calibrar as mudanças de Raman. A comparação direta entre as imagens cars e srs revela que o CARS tem uma melhor resolução espacial, enquanto o SRS oferece...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startup do Departamento de Química da Universidade purdue.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Conjunto de scanner galvo 2DThorlabsGVS002
Modulador acústico-ópticoIsometM1205-P80L-0.5
AOM driverIsomet532B-2
Cartão de aquisição de dadosNational InstrumentsPCle 6363Filtro encomendado personalizado (980 sp)
Estágio de atrasoZaberX-LSM050A
Deutério óxidoMillipore Sigma151882-100G
Espelho dicróico para combinação de feixesThorlabsDMLP1000
Espelho dicróico para separação de sinalSemrockFF776-Di01-25x36
DMSOMiliporeSigma200-664-3
MIA PaCa 2 CélulasATCCCRL-1420
Sistema laser de femtossegundoEspectral FísicaInSightX3+
Filtro para CARSChromaAT655/30m
Filtro para SRSChromaET980sp
Gerador de funçõesRigolDG1022Z
Hastes de vidroLattice Electro OpticsSF-57
Placa de meia ondaNewport10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020National InstrumentsEste é o software de aquisição de imagem
Amplificador de bloqueioZurich InstrumentHF2LI
Caixa de microscópioOlympusBX51W1
Lente objetivaOlympusUPLSAPO60XW
Origin Pro 2019bOriginLab CorporationEste é o software de ajuste espectral
OsciloscópioTektronixTBS2204B
FotodiodoHamamatsuS3994-01
Detector PMTHamamatsuH7422P-40
PMTResearch Instrument Corp.PMT4V3
ThorlabsPBS255
Bloco de terminaisNational InstrumentsBNC-2110
Amplificador de tensão Advanced Cubo divisor de feixe de polarização

Referências

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  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
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