Este artigo compara diretamente os contrastes de resolução, sensibilidade e imagem da dispersão estimulada de Raman (SRS) e da dispersão coerente anti-Stokes Raman (CARS) integrada à mesma plataforma de microscópio. Os resultados mostram que o CARS tem uma melhor resolução espacial, o SRS dá melhores contrastes e resolução espectral, e ambos os métodos têm sensibilidade semelhante.
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Artigo de método
Comparação direta da dispersão de Raman estimulada hiperespectral e microscopia de dispersão de Raman coerente para imagem química
Neste artigo
Resumo
Resumo
A dispersão estimulada de Raman (SRS) e a microscopia de dispersão anti-Stokes Raman (CARS) são as tecnologias de imagem de dispersão raman mais amplamente utilizadas. As imagens hiperespectrais SRS e CARS oferecem informações espectrais de Raman a cada pixel, o que permite uma melhor separação de diferentes composições químicas. Embora ambas as técnicas exijam dois lasers de excitação, seus esquemas de detecção de sinal e propriedades espectrais são bem diferentes. O objetivo deste protocolo é realizar imagens de SRS hiperespectrais e CARS em uma única plataforma e comparar as duas técnicas de microscopia para imagens de diferentes amostras biológicas. O método de foco espectral é empregado para adquirir informações espectrais usando lasers femtosegundos. Utilizando amostras químicas padrão, a sensibilidade, resolução espacial e resolução espectral de SRS e CARS nas mesmas condições de excitação (ou seja, energia na amostra, tempo de moradia dos pixels, lente objetiva, energia de pulso) são comparadas. Os contrastes de imagem de CARROS e SRS para amostras biológicas são justtaposed e comparados. A comparação direta dos desempenhos de CARROS e SRS permitiria a seleção ideal da modalidade para imagem química.
Introdução
O fenômeno de dispersão de Raman foi observado pela primeira vez em 1928 por C. V. Raman1. Quando um fóton incidente está interagindo com uma amostra, um evento de dispersão inelástica pode ocorrer espontaneamente, no qual a mudança de energia do fóton corresponde a uma transição vibracional das espécies químicas analisadas. Este processo não requer o uso de uma etiqueta química, tornando-a uma ferramenta versátil e livre de rótulos para análise química, minimizando a perturbação da amostra. Apesar de suas vantagens, a dispersão espontânea de Raman sofre de uma seção transversal de baixa dispersão (tipicamente 1011
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Protocolo
1. Configuração instrumental para imagens de CRS hiperespectrais
NOTA: A geração de sinal CRS requer o uso de lasers de alta potência (ou seja, classe 3B ou classe 4). Os protocolos de segurança devem ser abordados e os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados devem ser usados em todos os momentos quando se trabalha em potências de pico tão altas. Consulte a documentação adequada antes da experimentação. Este protocolo se concentra em projetar o caminho do feixe, chiar os pulsos femtosegundos e otimizar as condições de imagem. Um layout óptico geral deste microscópio CRS hiperespectral é mostrado na
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Resultados
Comparações da resolução espectral
A Figura 2 compara a resolução espectral da microscopia hiperespectral SRS (Figura 2A) e CARS (Figura 2B) utilizando uma amostra de DMSO. Para o espectro SRS, duas funções lorentzianas (ver protocolo passo 2.3) foram aplicadas para se adequar ao espectro, e uma resolução de 14,6 cm-1 foi obtida utilizando-se o pico de 2.913 cm-1 . Para carros, foi utilizada.......
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Discussão
O protocolo aqui apresentado descreve a construção de um microscópio CRS multimodal e a comparação direta entre carros e imagens SRS. Para a construção do microscópio, as etapas críticas são a sobreposição do feixe espacial e temporal e a otimização do tamanho do feixe. Recomenda-se o uso de uma amostra padrão como o DMSO antes da imagem biológica para otimizar o SNR e calibrar as mudanças de Raman. A comparação direta entre as imagens cars e srs revela que o CARS tem uma melhor resolução espacial, enquanto o SRS oferece.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo de startup do Departamento de Química da Universidade purdue.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Conjunto de scanner galvo 2D | Thorlabs | GVS002 | |
| Modulador acústico-óptico | Isomet | M1205-P80L-0.5 | |
| AOM driver | Isomet | 532B-2 | |
| Cartão de aquisição de dados | National Instruments | PCle 6363 | Filtro encomendado personalizado (980 sp) |
| Estágio de atraso | Zaber | X-LSM050A | |
| Deutério óxido | Millipore Sigma | 151882-100G | |
| Espelho dicróico para combinação de feixes | Thorlabs | DMLP1000 | |
| Espelho dicróico para separação de sinal | Semrock | FF776-Di01-25x36 | |
| DMSO | MiliporeSigma | 200-664-3 | |
| MIA PaCa 2 Células | ATCC | CRL-1420 | |
| Sistema laser de femtossegundo | Espectral Física | InSightX3+ | |
| Filtro para CARS | Chroma | AT655/30m | |
| Filtro para SRS | Chroma | ET980sp | |
| Gerador de funções | Rigol | DG1022Z | |
| Hastes de vidro | Lattice Electro Optics | SF-57 | |
| Placa de meia onda | Newport | 10RP02-51; 10RP02-46 | |
| LabVIEW 2020 | National Instruments | Este é o software de aquisição de imagem | |
| Amplificador de bloqueio | Zurich Instrument | HF2LI | |
| Caixa de microscópio | Olympus | BX51W1 | |
| Lente objetiva | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Origin Pro 2019b | OriginLab Corporation | Este é o software de ajuste espectral | |
| Osciloscópio | Tektronix | TBS2204B | |
| Fotodiodo | Hamamatsu | S3994-01 | |
| Detector PMT | Hamamatsu | H7422P-40 | |
| PMT | Research Instrument Corp. | PMT4V3 | |
| Thorlabs | PBS255 | ||
| Bloco de terminais | National Instruments | BNC-2110 |
Referências
- Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619(1928).
- Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515(2020).
- Evans, C. L., Xie, X. S.
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Reimpressões e permissões
