Summary
Extracellulaire depletie van fluorescerend gelabelde glucose correleert met glucoseopname en kan worden gebruikt voor high-throughput screening van glucoseopname in weggesneden organen en celculturen.
Abstract
De aanhoudende wereldwijde epidemie van diabetes verhoogt de vraag naar de identificatie van omgevings-, voedings-, endocriene, genetische en epigenetische factoren die de opname van glucose beïnvloeden. De meting van intracellulaire fluorescentie is een veelgebruikte methode om de opname van fluorescerend gelabelde glucose (FD-glucose) in cellen in vitro te testen, of voor het in vivo in beeld brengen van glucose-consumerende weefsels. Deze test beoordeelt de opname van glucose op een gekozen tijdstip. De intracellulaire analyse gaat ervan uit dat het metabolisme van FD-glucose langzamer is dan dat van endogene glucose, dat deelneemt aan katabole en anabole reacties en signalering. Dynamisch glucosemetabolisme verandert echter ook opnamemechanismen, die kinetische metingen van glucoseopname vereisen als reactie op verschillende factoren. Dit artikel beschrijft een methode voor het meten van extracellulaire FD-glucosedepletie en valideert de correlatie met intracellulaire FD-glucoseopname in cellen en weefsels ex vivo. Extracellulaire glucosedepletie kan mogelijk toepasbaar zijn voor kinetische en dosisafhankelijke studies met hoge doorvoer, evenals het identificeren van verbindingen met glycemische activiteit en hun weefselspecifieke effecten.
Introduction
De vraag naar het meten van glucoseopname stijgt samen met de kritieke noodzaak om een epidemische toename van een groot aantal ziekten aan te pakken die afhankelijk zijn van het glucosemetabolisme. Onderliggende mechanismen van degeneratieve metabole ziekten, neurologische en cognitieveaandoeningen 1, ontsteking2 en infectieziekten3, kanker 4,5, evenals veroudering6, zijn afhankelijk van glucosemetabolisme voor energie en de opslag ervan, anabole processen, eiwit- en genmodificatie, signalering, regulatie van genen en nucleïnezuren synthese en replicatie 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM) is direct gerelateerd aan een storing in de glucose-opnameregulatie. DM is een spectrum van chronische ziekten zoals type-1, -2 en -3 diabetes mellitus, zwangerschapsdiabetes, volwassenheidsdiabetes van jongeren en andere soorten van deze ziekte veroorzaakt door omgevings- en / of genetische factoren. In 2016 toonde het eerste who global report on diabetes aan dat het aantal volwassenen met de meest wijdverspreide DM sinds 1980 bijna is verviervoudigd tot 422 miljoen volwassenen10, en dit aantal DM-patiënten is de afgelopen decennia exponentieel gestegen. Alleen al in 2019 werd een schatting van 1,5 miljoen sterfgevallen direct veroorzaakt door DM10. Deze dramatische stijging is te wijten aan de toename van type-2 DM en de omstandigheden die het veroorzaken, waaronder overgewicht en obesitas10. De COVID-19-pandemie onthulde een tweevoudige toename van de mortaliteit bij patiënten met DM in vergelijking met de algemene bevolking, wat de diepgaande maar slecht begrepen rol van glucosemetabolisme in de immuunafweer suggereert3. Preventie, vroege diagnose en behandeling van DM, obesitas en andere ziekten vereisen optimalisatie van metingen van glucoseopname door verschillende weefsels en identificatie vanomgevingsfactoren 11, voeding12, endocriene13, genetische 14 en epigenetische15 factoren die de glucoseopname beïnvloeden.
In onderzoek wordt intracellulaire en/of weefselopname van glucose gewoonlijk gemeten door fluorescerend gelabelde glucose (FD-glucose) in vitro 16,17,18 en in vivo19. FD-glucose werd een voorkeursmethode in vergelijking met nauwkeurigere methoden met behulp van radioactief gelabelde glucose20, analytische massaspectroscopieanalyse21, metabolomica22, nucleaire magnetische resonantiemethoden23 en positronemissietomografie / computertomografie (PET / CT) 5,24. In tegenstelling tot de opname van FD-glucose, kunnen analytische methoden die meer biologisch materiaal vereisen, een monstervoorbereiding in meerdere stappen, dure instrumenten en complexe gegevensanalyse omvatten. Effectieve en goedkope metingen van FD-glucoseopname in celculturen zijn gebruikt in proof-of-concept-experimenten en vereisen mogelijk validatie door andere methoden.
De basis van FD-glucosetoepassing voor glucoseopnamestudies is het verminderde metabolisme van FD-glucose in vergelijking met endogene glucose25. Niettemin zijn zowel endogene glucose als FD-glucose dynamisch verdeeld over alle cellulaire compartimenten voor gebruik in anabole, katabole en signaleringsprocessen. De compartimentering en tijdsafhankelijke verwerking25 van FD-glucose interfereren met de fluorescentiemetingen en vertegenwoordigen de belangrijkste beperkende factoren voor het gebruik van deze test in screeningexperimenten met hoge doorvoer, kinetische analyse, 3D-celkweek, coculturen en weefselexplantexplantexperimenten. Hier bieden we gegevens die een hoge correlatie aantonen tussen de extracellulaire depletie van FD-glucose en de intracellulaire opname ervan, wat de extracellulaire uitputting van FD-glucose suggereert als een surrogaatmeting voor intracellulaire glucoseopname. De meting van extracellulaire depletie van glucose werd toegepast om weefselspecifieke verschillen in glucoseopname te valideren bij muizen behandeld met insuline en een experimenteel medicijn18 om een proof-of-principle van deze methode te bieden.
Het huidige protocol beschrijft intracellulaire en extracellulaire (figuur 1) metingen van FD-glucoseopname in 3T3-L1-cellen. Protocol secties 1-7 verklaren de cultuur en groei van cellen gedurende 48 uur; celuithongering, stimulatie en baseline extracellulaire metingen; en poststimulatiemetingen van extracellulaire FD-glucose en intracellulaire metingen van FD-glucose en eiwit. Protocol sectie 8 beschrijft de ex vivo meting van extracellulaire opname van FD-glucose in weefsels ontleed van ob/ob muizen in de aan- en afwezigheid van insuline en aminozuurverbinding 2 (AAC2) elders beschreven18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierstudies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Ohio State University (OSU, protocol 2007A0262-R4).
OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast van klasse II met de blower aan en de lichten uit.
1. Voorbereiding van materialen
OPMERKING: Alle materialen staan vermeld in de materiaaltabel.
- Bereid Medium 1, centrifugatie Medium 2 en opslag- en werkoplossingen van fluorescerende 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose (2-NBDG of FD-glucose) volgens tabel 1 in een bioveiligheidskast van klasse II. Bescherm FD-glucose tegen licht tijdens het experiment door alle lichten onder de motorkap uit te schakelen.
- Gebruik gebruiksklare celkweekreagentia: Trypsine-EDTA, fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en glucosevrije en fenolrode Dulbecco's Modified Eagle Medium (hierna glucosevrije DMEM).
- Gebruik 20 ml radioimmunoprecipitatie assay (RIPA) lysis buffer.
OPMERKING: In de volgende rubrieken worden extracellulaire depletie en intracellulaire opname van verschillende FD-glucosedoses vergeleken in 3T3-L1 fibroblasten met en zonder insulinestimulatie (figuur 2).
2. 3T3-L1 celcultuur en onderhoud
- Kweek 3T3-L1 muis fibroblasten door 1 x 106 cellen verdund in 20 ml Medium 1 in twee 96-well platen te platen. Plaat 100 μL celsuspensie per put, waardoor de homogeniteit van deze suspensie behouden blijft door te mengen. Kweek cellen gedurende 48 uur in een incubator van 37 °C (5% CO2 en 95% vochtigheid) zonder media te veranderen tot ongeveer 70% -80% samenvloeiing.
- Houd cellen samenvloeiend en vastend door ze gedurende 48 uur in hetzelfde medium te kweken. Varieer de incubatietijd van 24-72 uur, afhankelijk van de gewenste nuchtere katabole toestand.
3. Uithongering van 3T3-L1 cellen
- Decanteer media uit cellen in de 96-well platen. Absorbeer de resterende vloeistof met steriele papieren handdoeken.
- Spoel de 96-well plaat af met 100 μL PBS per put en absorbeer de resterende vloeistof met steriele papieren handdoeken.
- Voeg 100 μL glucosevrije DMEM per putje toe en incubeer gedurende 40 minuten. Pas de incubatietijd aan, afhankelijk van het celtype, stimuli en het gewenste niveau van vasten.
OPMERKING: De tijd van incubatie kan optimalisatie vereisen, afhankelijk van het seizoen.
4. Bereiding van FD-glucoseoplossingen met verschillende concentraties
OPMERKING: Het experiment in figuur 2 onderzoekt extracellulaire en intercellulaire media met en zonder stimulatie met insuline.
- Gebruik acht replica's (één rij in een plaat met 96 putten) voor elke stimulatieconditie. Bereid daarom 1 ml voor elke stimulatieconditie (gespecificeerd in tabel 2 en lager).
- Gebruik acht stimulatiecondities zonder insuline: FD-glucose van 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,05 μg/ml en 0 μg/ml (controle zonder FD-glucose) in één 96-putplaat.
- Gebruik acht stimulatiecondities met insuline (10 μg/ml, eindconcentratie): FD-glucose van 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml, 0,05 μg/ml en 0 μg/ml (controle zonder FD-glucose) in een andere 96-well-plaat.
- Om de stimulatieomstandigheden voor te bereiden, verdunt u 1 μL van 5 mg/ml FD-glucose werkoplossing (tabel 1) in 999 μL glucosevrije DMEM om 1 ml werkvoorraadoplossing (1:1000 verdunning of 5 μg/ml) te verkrijgen.
- Bereid met deze werkvoorraadoplossing 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 en 1:100.000 verdunningen van FD-glucose om 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/ml en 0,05 μg/ml (tabel 2) te verkrijgen in 2 ml buizen vlak voor experimenten in een bioveiligheidskast zonder verlichting.
- Herhaal stap 4.4 en voeg 1 μL insuline (10 mg/ml, eindconcentratie) toe aan elk van de hierboven gespecificeerde omstandigheden.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie insuline in deze monsters is 10 μg / ml = 1,7 nmol / ml. Om homogenisatie te bereiken, voegt u insuline toe aan de buizen voordat u andere oplossingen toevoegt.
5. Behandeling van uitgehongerde 3T3-L1 cellen
- Decanteer na 40 minuten incubatie de glucosevrije DMEM uit elke put in 96-putplaten en absorbeer de resterende vloeistof met steriele papieren handdoeken.
- Voeg 100 μL (per put) elk van de verschillende hierboven beschreven behandelingsomstandigheden toe aan putten langs één kolom, en 100 μL (per put) van dezelfde behandelingsconditie aan de putten langs de rij (acht replicaties) in beide 96-putplaten. Label de platen die de omstandigheden met en zonder insuline gebruikten. Voeg alleen glucosevrije DMEM toe aan de controleputten (n = 8).
- Incubeer de plaat gedurende 40 minuten in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid) in het donker.
6. Extracellulaire en intercellulaire metingen voor gestimuleerde 3T3-L1 cellen
- Nadat de cellen gedurende 40 minuten zijn gestimuleerd, brengt u de stimulatiemedia van beide platen over naar nieuwe 96-well platen met behoud van dezelfde experimentele lay-out.
- Decanteer alle resterende oplossing van de oorspronkelijk gestimuleerde 96-well platen met cellen op steriele papieren handdoeken.
- Optioneel, wascellen met PBS. Verwijder PBS en decanteer de resterende oplossing op steriele papieren handdoeken.
- Voeg 100 μL van de RIPA-lysisbuffer toe aan elk putje. Voeg optioneel proteaseremmer toe aan de RIPA-buffer om eiwitten te beschermen. Plaats platen met RIPA in een shaker gedurende 30 min.
- Meet met behulp van een microplaatlezer (Materiaaltabel) fluorescentie bij excitatie (Ex) en emissie (Em) golflengten van respectievelijk 485 en 535 nm, eerst in het medium dat extracellulaire FD-glucose bevat, en vervolgens de plaat met RIPA-gelyseerde cellen aan het einde van 30 minuten incubatie (zie stap 6.4).
7. Op eiwitten gebaseerde normalisatie van intracellulaire glucoseopname
OPMERKING: Intracellulaire FD-glucoseopname is afhankelijk van het celnummer. Eiwitniveaus in cellulaire lysaten zijn evenredig met de celaantallen die het mogelijk maken om intracellulaire FD-glucosespiegels te normaliseren tot het aantal cellen in elke put.
- Voer de BCA-eiwittest uit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Kwantificeer de eiwitconcentraties in elke put die RIPA-lysed cellen bevat.
- Gebruik 10 μL van het RIPA-homogenaat en meet eiwitconcentraties in drievoud om de nauwkeurigheid van metingen in 96-well platen te verhogen.
- Kwantificeer eiwit op basis van eiwitstandaarden (0, 10, 20, 30, 40, 50 en 60 μg / ml eiwit) geanalyseerd samen met monsters op elke 96-well plaat.
- Meet de absorptie bij 562 nm en kwantificeer de eiwitconcentraties in elk monster op basis van de lineaire regressieformule die is verkregen voor de eiwitstandaard.
- Normaliseer de niveaus van intracellulaire FD-glucose door gebruik te maken van fluorescerende waarde / eiwitconcentratie in elke put. Extracellulaire FD-glucosedepletie vereist geen normalisatie.
- Gebruik eventueel de gemiddelde basislijnwaarden in controlemonsters voor extra normalisatie (100%).
8. Ex vivo meting van extracellulaire FD-glucosedepletie in organen
- Voorbehandeling muizen met verbindingen die het glucosemetabolisme stimuleren vóór de orgaandissectie, als volgt.
- Gebruik negen weken oude Lepob mannelijke muizen (n = 11). Voed alle muizen met een regelmatig chow-dieet vóór het experiment.
- Wijs muizen willekeurig toe aan drie groepen voor intraperitoneale (i.p.) injecties.
- Injecteer muizen uit de controle Lepob-groep met 0,1 ml steriele PBS (n = 4).
- Injecteer muizen uit de insuline Lepob-groep met 0,1 ml steriele PBS, met 12 IE humane insuline per gram lichaamsgewicht (n = 3).
- Injecteer muizen uit de AAC2 Lepob-groep met 0,1 ml steriel PBS, met 0,1 nmol AAC2 per gram lichaamsgewicht (bw) (n = 4).
- Na 15 minuten worden muizen onderworpen aan inademing van 5% isofluraan en exsanguinaatbloed door hartpunctie van de verdoofde dieren26.
- Dissecteer visceraal epidydimaal wit vetweefsel (200 mg), lever (200 mg) en hele hersenen van elk dier. Gebruik een klasse II bioveiligheidskap voor weefselbehandeling.
- Bereid FD-glucose (0,29 mM) werkoplossing in glucosevrije DMEM in een klasse II bioveiligheidskast zonder licht.
- Meet de fluorescentie van FD-glucose werkoplossing (0,29 mM) bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 485 en 535 nm met behulp van een microplaatlezer.
- Incubeer de geoogste weefsels/organen in een 6-well plaat met PBS gedurende 1 min. Behandel elk weefsel of orgaan in een aparte put.
- Leg na 1 min elk zakje op een steriele papieren handdoek om PBS te absorberen. Breng weefsels/organen over in een aparte 6-wells plaat met 4.000 μL glucosevrije DMEM en incubeer gedurende 2 min.
- Verwijder na 2 minuten de weefsels en breng ze over in putten van een 6-wellsplaat met 0,29 mM FD-glucose werkoplossing (1 ml / put). Incubeer de 6-well platen met weefsels in FD-glucose werkoplossing bij 37 °C (5% CO2 en 95% vochtigheid).
- Verzamel 100 μL FD-glucose werkoplossing uit elke put na 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 minuten incubatie, om de kinetiek van extracellulaire FD-glucosedepletie te analyseren. Schud voor en na het verzamelen.
- Breng 100 μL FD-glucose-werkoplossing over in 96-well platen om de fluorescentie te meten bij excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 485 en 535 nm met behulp van een microplaatlezer.
- Normaliseer fluorescentie tot de 0 min-waarde (100%) voor elk orgaan in elk dier (figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intracellulaire inname en extracellulaire glucosedepletie werden gemeten in 3T3-L1 preadipocyten, als reactie op verschillende concentraties FD-glucose (figuur 2) met en zonder insulinestimulatie. Figuur 2A toont een dosisafhankelijke toename van de intracellulaire opname van FD-glucose, die significant verhoogd was in aanwezigheid van insuline. De gelijktijdige afname van extracellulaire FD-glucose in dezelfde cellen wordt weergegeven in figuur 2B, waar insulinestimulatie leidde tot significant verlaagde extracellulaire FD-glucosespiegels in vergelijking met de monsters zonder insulinestimulatie. De intracellulaire inname van FD-glucose correleerde met de extracellulaire uitputting van FD-glucose op een dosisafhankelijke manier in monsters met en zonder insuline (figuur 2C). Extracellulaire depletie van FD-glucose kan dus een verandering in glucoseopname met vergelijkbare nauwkeurigheid (R2 = 0,99, P < 0,001) meten als intracellulaire FD-glucoseopname.
Vervolgens werd een experimentele setting ontwikkeld om de toepassing van extracellulaire FD-glucoseopname te valideren in kinetische studies waarbij verschillende weefsels werden onderzocht na stimulatie met canonische en experimentele inductoren van glucoseopname (figuur 3). We selecteerden het Lepob muismodel van insulineresistentie in perifere weefsels, waaronder visceraal wit vetweefsel27,28. De gevestigde reacties op insuline bij deze muizen werden vergeleken met effecten van nieuwe verbinding AAC2, die inwerkt op zowel perifere als nerveuze weefsels via leptinereceptor en glucosetransporter GLUT1-afhankelijke mechanismen18. Lepob muizen werden i.p. geïnjecteerd met insuline of AAC2. Organen werden 15 minuten na injectie ontleed. Vervolgens werd de kinetiek van extracellulaire FD-glucosedepletie ex vivo bestudeerd in visceraal vet, lever en hersenen (figuur 3). In overeenstemming met de gerapporteerde insulineresistentie in perifere weefsels, was extracellulaire FD-glucose niet uitgeput in niet-gestimuleerd controlevisceraal vet gedurende 120 minuten incubatie (figuur 3A). Daarentegen leidde voorbehandeling van muizen met insuline of AAC2 vóór de dissectie tot een significante uitputting van extracellulaire FD-glucose binnen een tijdsinterval van respectievelijk 30 minuten en 60 minuten.
Leveropname van glucose maakt gebruik van glucosetransporters, waaronder GLUT2, dat onafhankelijk is van insulinestimulatie29,30. Dienovereenkomstig was extracellulaire FD-glucose aanvankelijk niet uitgeput in insuline-gestimuleerde leverexplantaten in vergelijking met niet-gestimuleerde leverexplantaten (figuur 3B), hoewel significante uitputting van FD-glucose werd waargenomen na 120 minuten incubatie in leverexplant gestimuleerd met insuline in vergelijking met de initiële niveaus (0 min). Aan de andere kant was extracellulaire FD-glucose significant verlaagd op een tijdsafhankelijke manier in leverexplantaten voorbehandeld met AAC2.
In de hersenen is de belangrijkste transporter GLUT1 onder andere transporters31. De FD-glucosedepletiekinetiek was opvallend anders in de hersenen dan in ander weefsel (figuur 3C). De significante uitputting van glucose werd waargenomen in het extracellulaire medium dat de niet-behandelde hersenen bevat na 60 minuten incubatie (van 100% bij 0 min tot 78%). Het medium geïncubeerd met hersenen van met insuline behandelde Lepob-muizen heeft een matige maar significante lineaire afname van FD-glucose laten zien (van 100% bij 0 min tot 95%). AAC2-gestimuleerde hersenen leiden tot een diepgaande snelle afname van extracellulaire FD-glucose gedurende de eerste 20 minuten (van 100% na 0 min tot 67,4%). Samen ondersteunen metingen van extracellulaire glucosedepletie de eerder gemelde verschillen in glucoseopname in deze weefsels in vivo32.
Figuur 1: Principe van de extracellulaire FD-glucosedepletiesmethode. Cellen gekweekt in 96-well formaat zijn geschikt voor deze assay. Om te overleven nemen cellen glucose op en deze instroom verlaagt de niveaus van extracellulaire glucose. De vervanging van glucose door FD-glucose maakt monitoring van deze veranderingen mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Depletie van extracellulaire FD-glucose gecorreleerd met de intracellulaire opname in vitro. 3T3-L1 preadipocyten werden gedurende 40 minuten vóór incubatie geïncubeerd in een glucosevrij medium met verschillende concentraties FD-glucose met en zonder insuline (1,7 mM; 40 min incubatie). (A, B) Dosisafhankelijke opname van FD-glucose (A) en extracellulaire FD-glucosedepletie (B) onder controle (d.w.z. zonder insuline) (uitgekomen staven) en insuline-gestimuleerde cellen (zwarte balken). FD-glucose opname werd genormaliseerd door eiwitconcentraties. De gegevens worden weergegeven als % van de waarde gemeten in controle geïncubeerd zonder FD-glucose (gemiddelde SD, n = 8 per toestand). Significantie werd onderzocht door middel van ongepaarde t-test. (C) Correlatie tussen intracellulaire en extracellulaire FD-glucose (%) metingen met (vierkanten) of zonder (cirkels) insuline in experimenten beschreven in (A) en (B). Pearson correlatie, P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kinetiek van extracellulaire FD-glucosedepletie in verschillende organen ex vivo. (A-C) Lepob-muizen werden geïnjecteerd met vehikel (PBS, n = 4), insuline (12 IE/kg LICHAAMSGEWICHT, n = 3) en AAC2 (1 nmol/g BW, n = 3). Na 15 minuten werden weefsels ontleed en geïsoleerd. Explantaten van (A) visceraal vet, (B) lever en (C) hersenen werden geïncubeerd in FD-glucose (0,29 mM). De kinetiek van extracellulaire glucosedepletie werd gemeten in aliquots van het medium op verschillende tijdstippen. Gegevens (gemiddelde SD) worden weergegeven als % fluorescentie in elk orgaan na 0 min incubatie. Significantie P < 0,05, ongepaarde t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oplossing/Medium | Onderdelen |
| Ethanol: DMSO (1:1/v/v) | Ethanol (200 μL) en DMSO (200 μL) in een buis van 1-1,5 ml; gebruik ethanol van celkweekkwaliteit en DMSO |
| Gemiddeld 1 | DMEM (89 ml), penicilline/streptomycine (1%) (1 ml) en kalfsserum (10%) (10 ml) in steriele buis van 50 ml |
| Centrifugatie Medium 2 | DMEM (89 ml), penicilline/streptomycine (1%) (1 ml) en runderserum (10%) (10 ml) in steriele buis van 50 ml |
| Opslag FD-glucose oplossing 5 mg/ml (14,5 mM) | FD glucose (1 mg) en Ethanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) in een buis van 0,5 ml; bewaren bij -80 °C, bij voorkeur onder argon- of stikstofatmosfeer |
| Werkende FD-glucoseoplossing 5 μg/ml (14,5 mM) | Opslag FD glucoseoplossing 5 mg/ml (1 μL), glucosevrije DMEM (999 μl); bereid je voor onmiddellijk voor het experiment. |
Tabel 1: Bereiding van kweekmedia en FD-glucoseoplossingen.
| Verdunning | Beheersen | 01:2x103 | 01:5x103 | 01:1x104 | 01:2,5x104 | 01:5x104 | 1:1x105 |
| Concentratie (μg/ml) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| Glucosevrije DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glucose 5 μg/ml (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
Tabel 2: Bereiding van FD-glucoseoplossingen met verschillende concentraties voor experimenten weergegeven in figuur 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De directe vergelijking van extracellulaire FD-glucosedepletie met genormaliseerde intracellulaire glucoseopname in celkweek toonde een hoge correlatie, wat suggereert dat extracellulaire glucosedepletie een surrogaatmeting zou kunnen zijn voor de beoordeling van de glucoseopname. De meting van extracellulaire FD-glucose kan een breed scala aan FD-glucoseconcentraties gebruiken, ook 0,5-2,5 μg FD-glucose / ml lijkt het optimale bereik te bieden. Extracellulaire FD-glucose vereist geen normalisatie naar celaantal of eiwitconcentraties die nodig zijn voor intracellulaire FD-glucoseopname. De verwachte beperking van extracellulaire FD-glucosemetingen is het onderzoek naar reactieve zuurstofsoort-inducerende stoffen en de bloedsporen in explantaten die fluorescentie kunnen doven. Andere omgevingsfactoren die van invloed zijn op fluorescentie, zoals licht, moeten ook worden overwogen. Langdurige verwerkingstijd die nodig is tijdens het gebruik van meerdere weefselexplantaten kan de levensvatbaarheid van het weefsel en het glucosemetabolisme in gevaar brengen. Dit kan een extra beperking zijn. De weggesneden weefsels moeten zich in een klein formaatbereik (50-300 mg) bevinden om de doorlaatbaarheid van glucose in het weefsel mogelijk te maken. Gelijktijdige behandeling van weefsels door meerdere operators kan de verwerkingstijd verkorten. Hoewel we de glucoseopname in de weefselexplantaten niet hebben gemeten, suggereren de geaccumuleerde waarnemingen in gekweekte weefselexplantaten dat ze tot 17 dagen in het glucosebevattende medium overleven met het progressieve verlies van functionaliteit33. In dit protocol maakt de korte incubatietijd voor explantaten het mogelijk om het glucosemetabolisme in relatief functionele weefsels te controleren. In de weefsels met een complexe cellulaire organisatie, zoals de hersenen, presenteert de grootte een onoplosbare beperking, omdat de desintegratie van complex weefsel en de resulterende celdood de glucoseopname beïnvloedt. De incubatie van de hersenen gedurende 24 uur is echter eerder gebruikt voor de identificatie van het endogene regulerende mechanisme, ter ondersteuning van de relatieve fysiologische functionaliteit van weggesneden muizenhersenen in glucosebevattend medium34. Hoe dan ook, de vereenvoudigde procedure en gemakkelijke toegankelijkheid van extracellulaire FD-glucose kunnen het gebruik van deze test in een high-throughput formaat mogelijk maken. De vergelijking van basische en insuline-gestimuleerde extracellulaire FD-glucosedepletie suggereert dat deze test kan worden toegepast om humorale, nutritionele, pathogene, omgevingsfactoren of farmaceutische geneesmiddelen te identificeren die de glucoseopname reguleren. Hoewel deze test de ontdekking vereenvoudigt, vereisten de bevindingen validatie met de kwantitatieve radiolabeling20 analytische methoden 21,22,23 en / of beeldvormingsmethoden 5,24 voor rigoureuze mechanistische opheldering van de pathways.
De kritieke stappen in dit protocol omvatten optimalisatie van confluentie en vastentijd die zowel de basale als de gestimuleerde FD-glucoseopname beïnvloeden. Deze parameters kunnen ook worden beïnvloed door het seizoen op basis van de observaties van de auteurs. Bovendien gebruiken verschillende celtypen specifieke mechanismen voor glucoseopname, waaronder verschillende glucosetransporters en regulerende hormoon/ receptorinteracties 32,35,36. Daarom moeten andere positieve controles dan insuline in aanmerking worden genomen voor de celculturen die andere weefsels vertegenwoordigen dan spier- of vetweefsel dat wordt gereguleerd door insuline/GLUT4-assen. De probleemoplossing omvat ook het aanpassen van de celconfluentie en het optimaliseren van de tijd voor vasten / refeeding met FD-glucose. Bovendien kan de gevoeligheid van extracellulaire glucosemeting worden verbeterd door de niveaus van extracellulaire FD-glucose te verlagen, rekening houdend met de drempelniveaus die nodig zijn voor glucoseopname. Het experiment beschreven in figuur 2 kan onderzoekers helpen om deze test aan te passen voor gebruik met andere celculturen of probleemoplossing.
De intrinsieke variabiliteit van het glucosemetabolisme vereiste ook een hogere steekproefomvang (n = 5-8). Hoewel extracellulaire metingen van FD-glucoseverlies dezelfde nauwkeurigheid vertoonden als intracellulaire opname van FD-glucose genormaliseerd door eiwit, kan de normalisatie de testvariabiliteit verminderen. Naast het meten van eiwitconcentraties kan de meting van het DNA-gehalte in de cel een andere betrouwbare surrogaatbeoordeling van celnummer37 zijn.
Extracellulaire FD-glucose is toegankelijk voor kinetische metingen. Hier is een eenvoudige procedure van kinetische metingen van extracellulaire FD-glucose ontwikkeld om orgaanspecifieke reacties op mediatoren van glucoseopname te identificeren. Deze ex vitro studies kunnen de orgaanrespons op verschillende stimuli in vivo direct testen die wordt gecombineerd met de blootstelling van organen aan FD-glucose en ex vivo kinetische metingen, zoals weergegeven in figuur 3. Hoewel ex vivo studies niet volledig lijken op in vivo omstandigheden, hebben ze meerdere voordelen. Orgaanexplantaten behouden een complexe meercellige primaire celstructuur, in tegenstelling tot onsterfelijke celculturen die veranderde genexpressie vertonen. Moderne medicijnontwikkeling maakt gebruik van modelorganismen, indirecte beoordeling van glucoseopname op basis van transcriptoom of metaboloom22, uitgebreide insulineklemtechniek38 of dure beeldvorming32. Hoewel het meten van extracellulaire FD-glucose in geëxplanteerde organen deze technologieën niet zal vervangen, zal het een snelle beoordeling van verbindingen, metabolieten en genen opleveren om de ontdekking van nieuwe therapeutische doelen te vergemakkelijken die de glucoseopname op een weefselspecifieke manier reguleren. De ontwikkeling van veilige therapieën die het glucosemetabolisme in specifieke weefsels aanpakken, kan een oplossing bieden voor kanker, dementie, veroudering, diabetes, auto-immuunziekten, obesitas en andere gerelateerde toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen problemen om bekend te maken en hebben geen belangenconflict.
Acknowledgments
Het project werd ondersteund door Ralph en Marian Falk Medical Research Catalyst Award en Kathleen Kelly Award. Andere ondersteuningen waren het National Center for Research Resources UL1RR025755 en NCI P30CA16058 (OSUCCC), de NIH Roadmap for Medical Research. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de officiële standpunten van het National Center for Research Resources of de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization.
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
