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Artigo de método

Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1

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DOI:

10.3791/63696

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6 de outubro de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais combinacionais orais que suprimem com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados.

Resumo

A pandemia do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) continua a se espalhar incessantemente em todo o mundo e, atualmente, não há vacina disponível contra o HIV. Embora a terapia antirretroviral combinacional (cTARV) tenha sido bem-sucedida na supressão da replicação viral, ela não pode erradicar completamente o reservatório de indivíduos infectados pelo HIV. Uma estratégia de cura segura e eficaz para a infecção pelo HIV exigirá métodos multifacetados e, portanto, os avanços dos modelos animais para a infecção pelo HIV-1 são fundamentais para o desenvolvimento da pesquisa de cura do HIV. Camundongos humanizados recapitulam as principais características da infecção pelo HIV-1. O modelo de camundongo humanizado pode ser infectado pelo HIV-1 e a replicação viral pode ser controlada com regimes de cTARV. Além disso, a interrupção da cART resulta em um rápido rebote viral em camundongos humanizados. No entanto, a administração de cART ao animal pode ser ineficaz, difícil ou tóxica, e muitos regimes de cART clinicamente relevantes não podem ser utilizados de forma ideal. Além de ser potencialmente insegura para os pesquisadores, a administração de cART por um procedimento de injeção diária intensiva comumente usado induz o estresse pela contenção física do animal. O novo método de cART oral para tratar camundongos humanizados infectados pelo HIV-1 descrito neste artigo resultou na supressão da viremia abaixo do nível de detecção, aumento da taxa de restauração CD4+ e melhoria da saúde geral em camundongos humanizados infectados pelo HIV-1.

Introdução

A expectativa de vida de indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana crônica (HIV) melhorou significativamente com o tratamento antirretroviral combinatório (cTARV)1,2. A cTARV reduz com sucesso a replicação do HIV-1 e aumenta a contagem de células T CD4+ para a normalidade na maioria dos participantes cronicamente infectados pelo HIV-13, resultando em melhora da saúde geral e redução drástica da progressão da doença4. No entanto, o reservatório latente do HIV-1 é estabelecido mesmo quando a TARV é iniciada durante a infecção aguda 5,6,7. Os reservatórios persistem ao longo dos anos durante a TARV e o rápido rebote viral após a interrupção da TARV está bem documentado 8,9. Pessoas vivendo com HIV em TARV também estão predispostas a um maior risco de comorbidades como doenças cardiovasculares, câncer e distúrbios neurológicos10,11,12. Portanto, uma cura funcional para o HIV é necessária. Modelos animais para a infecção pelo HIV-1 oferecem vantagens óbvias no desenvolvimento e validação de novas estratégias de cura do HIV13,14,15. Camundongos humanizados, como modelo animal de pequeno porte, podem proporcionar reconstituição de células imunes humanas multilinhagem em diferentes tecidos, o que permite o estudo minucioso da infecção pelo HIV16,17,18,19. Dentre os modelos humanizados, o modelo humanizado de medula óssea-fígado-timo (BLT) recapitula com sucesso a infecção crônica pelo HIV-1, bem como as respostas imunes humanas funcionais à infecção pelo HIV-1 20,21,22,23,24. Portanto, o modelo humanizado de camundongo BLT tem sido amplamente utilizado para investigar diversos aspectos no campo da pesquisa sobre HIV. Camundongos BLT humanizados não são apenas modelos bem estabelecidos para a recapitulação da infecção persistente pelo HIV-1 e patogênese, mas também ferramentas consequentes para a avaliação de estratégias de intervenção baseadas em terapia celular. Os autores atuais e outros demonstraram que o modelo humanizado de camundongos BLT recapitula a infecção persistente pelo HIV-1 e a patogênese 25,26,27 e fornece ferramentas para avaliar estratégias de intervenção baseadas em terapia celular 28,29,30,31,32,33 .

Os esquemas de cTARV que consistem em combinações de medicamentos antirretrovirais que são tomados diariamente suprimem a replicação do HIV-1 a ponto de a carga viral em indivíduos tratados com sucesso permanecer indetectável a longo prazo34. Os resultados do tratamento de camundongos humanizados infectados pelo HIV com regimes de TARV clinicamente relevantes assemelham-se aos observados em indivíduos infectados pelo HIV-1 tratados com TARV22: os níveis de HIV-1 são suprimidos abaixo dos limites de detecção e interrupção dos resultados da cART em um rebote da replicação do HIV do reservatório latente35. A injeção subcutânea (SC)27,36,37 ou intraperitoneal (IP)37,38,39 é a via comumente utilizada para o tratamento da cART em camundongos humanizados. No entanto, a injeção diária intensiva induz estresse aos animais pela contenção física40. Também é trabalhoso e potencialmente inseguro para os pesquisadores devido ao aumento da exposição ao HIV durante o uso de objetos cortantes. A administração oral é ideal para imitar a absorção, distribuição e excreção de medicamentos cART que são tomados por indivíduos infectados pelo HIV-1. A administração oral geralmente envolve procedimentos personalizados e muitas vezes trabalhosos para colocar os medicamentos antirretrovirais em alimentos esterilizados (necessários devido à imunodeficiência dos camundongos) 24,37,41 ou água 42,43,44,45,46 , que pode ou não ser quimicamente compatível com muitos medicamentos antirretrovirais, ou resultar em algo que os ratos não comeriam ou beberiam prontamente (o que afetaria a dose e os níveis de drogas no corpo). O novo método de administração de cART peroral proposto aqui supera as tentativas de parto anteriores devido à sua compatibilidade com diferentes tipos de medicamentos antirretrovirais, segurança e facilidade de preparação e administração, e redução do estresse e ansiedade animal resultantes da injeção diária.

Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), Elvitegravir (ELV) e Raltegravir (RAL) são drogas pouco solúveis em água. Curiosamente, o aumento da biodisponibilidade do TDF é observado com alimentos gordurosos, sugerindo que a inibição competitiva das lipases por alimentos gordurosos pode fornecer certa proteção para o TDF47. Portanto, os copos DietGel Boost foram selecionados para substituir a ração regular de roedores como método de entrega com base em seu modesto teor de gordura (20,3 g por 100 g) em comparação com a ração regular de roedores (10 g por 100 g) e uma dieta típica rica em gordura de camundongo (40-60 g por 100 g)48. O peso total de um copo é de 75 g; assim, cada xícara conterá a quantidade de alimento e, portanto, droga, suficiente para cinco ratos ao longo de 3 dias.

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Protocolo

O tecido fetal humano anonimizado foi adquirido comercialmente. A pesquisa em animais foi realizada de acordo com protocolos aprovados pela Universidade da Califórnia, Los Angeles, e pelo Comitê de Pesquisa Animal (ARC) (UCLA), de acordo com todas as diretrizes federais, estaduais e locais. Especificamente, todos os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações e diretrizes para alojamento e cuidado de animais de laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e da Associação para a Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AALAC) Internacional sob o Número de Protocolo UCLA ARC 2010-038-02B. Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia com cetamina (100 mg/kg)/xilazina (5 mg/kg) e isoflurano (2-3 vol%) e todos os esforços foram feitos para minimizar a dor e o desconforto dos animais.

1. Camundongos humanizados infectados com HIV-1

NOTA: Camundongos humanizados foram construídos conforme descrito anteriormente em30,31,49. O protocolo é brevemente descrito abaixo.

  1. Purificar as células progenitoras hematopoiéticas CD34+ do fígado fetal humano através de microesferas anti-CD34 de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Anestesiar camundongos machos e fêmeas NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) de 6-8 semanas de idade e irradiar subletalmente (2,7 Gy) antes da cirurgia.
  3. Implante timo, derivado do mesmo doador que o fígado fetal, sob a cápsula renal junto com o fígado.
  4. Após a implantação, injete camundongos com 0,5 milhão a um milhão de células CD34+, por via intravenosa.
  5. Após 8-10 semanas, recolher 100 μL de sangue de rato através de sangria retro-orbital50 em tubos de microcentrífuga contendo 5 μL de EDTA e centrífuga a 350 x g durante 3 min.
  6. Armazenar o plasma a -80 °C para monitorizar a carga viral após o rato ter sido infectado com o VIH-1. Adicione 2 mL de solução de NH4C a 83% e incube por 5 minutos à temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos.
  7. Adicione 10 mL de RPMI com 10% de soro fetal bovino (FBS) para interromper a lise. Gire a 300 x g por 5 min.
  8. Aspirar sobrenadante. Células corantes com painel de anticorpos (ver Tabela de Materiais) e analisar por citometria de fluxo para verificar o enxerto de células imunes humanas.
  9. Infectar camundongos que exibem mais de 50% das células CD45+ circulantes por injeção de veia retroorbital51,52 com pelo menos 200 ng de p24 de uma cepa HIV-1 (ou seja, NFNSXSL9 30,53,54) usando uma seringa de insulina. Coletar sangue quinzenalmente para análise de citometria de fluxo e para medir a carga viral.

2. Preparação de medicamentos antirretrovirais

  1. Pesar drogas individuais; por exemplo, para fazer 10 copos de alimentos com cART, use raspadores de células estéreis para pesar 250 mg de FTC (Emtricitabina), 375 mg de TDF e 500 mg de RAL ou ELV em tubos de centrífuga estéril de 15 mL individuais em um gabinete de biossegurança.
  2. Adicionar 1 mL de DMSO em tubo FTC de 250 mg (concentração final de 250 mg/mL), adicionar 1,5 mL de DMSO em tubo de TDF de 375 mg (concentração final de 250 mg/mL) e adicionar 1mL de DMSO em tubo de 500 mg de RAL ou ELV (concentração final de 500 mg/mL). Mexa ou pipete a mistura de drogas até que esteja totalmente dissolvida e uma solução clara seja obtida.
  3. Use um filtro de membrana PVDF hidrofílico de tamanho de poro de 0,22 μM para esterilizar soluções com uma seringa estéril. Soluções medicamentosas individuais podem ser armazenadas a -20 °C por 12 semanas.
  4. Quando estiver pronto a utilizar, descongelar recentemente uma alíquota de cada solução medicamentosa a 37 °C até que a solução se torne límpida. Misture bem usando uma pipeta.
  5. Combine drogas e misture bem para compor a mistura mestre: 1 mL de FTC em DMSO, 1,5 mL de TDF em DMSO e 1 mL de ELV ou RAL em DMSO.
    NOTA: Esta quantidade fará 10 xícaras de comida.
  6. Adicione 350 μL de solução de mistura master cART em um copo para fazer um copo cART DietGel Boost.
  7. Adicionar 0,75 ml de Sulfametoxazol-Trimetoprima (concentração final de 0,48 mg/ml) ao copo.
  8. Mexa bem usando 1 mL de pontas de pipeta estéreis.
  9. Aliquote o copo de comida contendo cART do copo original com uma microespátula em uma placa de Petri de 60 mm, conforme necessário. Pese o alimento em uma balança para calcular a quantidade de copo de alimento contendo cART para cada gaiola de acordo com o número de camundongos.

3. Administração de medicamentos antirretrovirais em camundongos infectados pelo HIV-1

  1. Remova a ração regular da gaiola e substitua-a por um copo de comida contendo cART.
    NOTA: Em média, um rato vai comer até 5 g de comida por dia. Aproximadamente um copo de comida pode ser administrado a cinco ratos por 2 dias.
  2. Atualize a comida cART três vezes por semana.
  3. Pesar copos usados para monitorar a ingestão. Pese os ratos semanalmente para confirmar o consumo.

4. Monitore a carga viral por PCR em tempo real

  1. Avaliar as células imunes humanas (níveis de células T CD4 e CD8) e a replicação do HIV-1 em camundongos BLT a cada 2 semanas por sangramento retroorbital. Colha o plasma seguindo as instruções nas etapas 1.5-1.8.
  2. Monitore as cargas virais plasmáticas de camundongos infectados com HIV-1 antes e durante a administração oral de cART por 8 semanas. Extrair o RNA viral plasmático do plasma usando um kit de extração de RNA viral e quantificá-lo por PCR em tempo real usando os primers e sondas (ver Tabela de Materiais) conforme descrito anteriormente 27,30,31. Use o seguinte protocolo de ciclismo: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), depois pedale 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) por 45 ciclos.

5. Avaliar as relações CD4/CD8 por citometria de fluxo

  1. Prepare suspensões unicelulares do sangue periférico de hemorragias quinzenais seguindo os passos 1.5-1.8.
  2. Células corantes com marcadores de superfície e analisadas por citometria de fluxo. Utilizar os seguintes anticorpos marcadores de superfície 27,30,43,49 na citometria de fluxo: CD45 (clone HI30), CD8 (clone SK1), CD3 (clone OKT3), CD4 (clone RPA-T4)27,30,42,49.

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Resultados

Supondo que um rato médio pesando 25 g consuma 4 g de alimento por dia, a dose diária do medicamento através da ingestão oral corresponde a 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC e 768 mg/kg RAL. Para testar se o regime alimentar otimizado é tóxico e influencia a saúde geral em comparação com a injeção diária de cART, o peso dos ratos foi monitorado semanalmente antes e durante a cART através de injeção oral ou subcutânea. Não houve diferenças significativas de peso antes da administração da TARV em cada grupo (

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Discussão

Um método de administração oral de cART é desenvolvido aqui para camundongos humanizados infectados pelo HIV-1, combinando três medicamentos antirretrovirais em alimentos ricos em nutrientes. Em comparação com a administração por injeções diárias, o parto oral é mais fácil de usar, limita a frequência de administração, reduz o manuseio dos animais, minimiza o estresse e melhora a segurança55. Até este ponto, apenas alguns estudos em camundongos humanizados 24,37,41

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Divulgações

A SK é fundadora da CDR3 Inc. Os demais autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer aos Drs. Romas Geleziunas e Jeff Murry e ao pessoal da Gilead por fornecerem os medicamentos antirretrovirais utilizados neste estudo. Este trabalho foi financiado pelo NCI 1R01CA239261-01 (to Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core e Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (para Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Este trabalho também foi apoiado pelo UCLA AIDS Institute, o James B. Pendleton Charitable Trust e a McCarthy Family Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri de 60 mmThermo Scientific Nunc150288Para aliquoting ART alimentos
APC anticorpo CD8 humanoBiolegend344722Para citometria de fluxo
BD LSRFortessaBD biosciencesPara coleta de dados de fluxo
Microesferas CD34Miltenyi Biotec130-046-702Para geração de camundongos NSG-BLT
Tubos decentrífugaFalcon14-432-22Para dissolver ART
DietGel BoostClearH2O72-04-5022Para fazer comida ART
ElvitegravirGileadGifted de Gilead
EmtricitabinaGileadGifted de Gilead
FITC anti-humano CD3 AnticorpoBiolegend317306Para citometria de fluxo
Flowjo softwareFlowJoPara análise de dados de citometria de fluxo
, primer direto do HIV-1: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′;IDTpersonalizadopara carga viral Sonda RT-PCR
HIV-1: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		IDTpersonalizadopara carga viral RT-PCR
HIV-1 primer reverso: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′;IDTPersonalizadoPara carga viral RT-PCR
Tecido fetal humanoAdvanced Bioscience Resources, Inc
Ratos, cepa NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJO Laboratório Jackson5557Para construir os camundongos humanizados
Pacific Blue anti-humano CD45Biolegend304022Para citometria de fluxo
PerCP anti-humano CD4 AnticorpoBiolegend300528Para citometria de fluxo
QIAamp Kits de RNA ViralQiagen  52904Para medir a carga viral
RaltegravirMerckGifted da Merck
Raspadores de células estéreisThermo Scientific179693Para aliquotar alimentos
ART TaqMan RNA-To-Ct Kit de 1 passoApplied Biosystems4392653Para detecção de carga viral plasmática
Tenofovir disoproxil fumaratoGileadGifted da Gilead
Trimetoprim-SulfametoxazolPharmaceutical AssociatesNDC 0121-0854-16Para manter os alimentos ART estéreis. Cada colher de chá de 5mL contém
200 mg de Sulfametoxazol, USP
40 mg de Trimetoprima, USP
NMT 0,5% Álcool

Referências

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