Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

Summary

Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.

Abstract

Compreender a homeostase proteica in vivo é fundamental para saber como as células funcionam em condições fisiológicas e de doença. O presente protocolo descreve a marcação in vivo e a subsequente purificação de proteínas recém-sintetizadas usando uma linha de camundongos modificados para direcionar a marcação de proteínas para populações celulares específicas. É uma linhagem induzível pela expressão da Cre recombinase da L274G-Metionina tRNA sintetase (MetRS*), possibilitando a incorporação de azidonorleucina (ANL) às proteínas, o que de outra forma não ocorrerá. Usando o método descrito aqui, é possível purificar proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo e detectar mudanças sutis no teor de proteína devido à redução da complexidade da amostra.

Introduction

A homeostase proteica aberrante é causada por um desequilíbrio na síntese e degradação de proteínas. Diversas doenças estão relacionadas a alterações na homeostase proteica. A marca registrada de algumas doenças é a presença de agregados em diferentes locais subcelulares e áreas cerebrais. A homeostase proteica não é apenas importante na doença, mas também desempenha um papel crucial na função normal dos órgãos e células¹. Por exemplo, a síntese proteica é necessária para muitas formas de plasticidade neuronal^2,3, conforme determinado pelo uso de inibidores químicos que bloqueiam a sínt....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados com permissão dos escritórios do governo local na Alemanha (RP Darmstadt; protocolos: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) ou Espanha (Comitê de Experimentos em Animais da UCM e Aconselhamento Ambiental da Comunidade de Madri, número de protocolo: PROEX 005.0/21) e estão em conformidade com as regras da Sociedade Max Planck e regulamentos espanhóis e seguem as diretrizes da UE para o bem-estar animal.

1. Marcação metabólica in vivo com ANL

1. Água potável:
   1. Dissolva a ANL e a maltose na água potável regular dos camundongos. A concentração reco....

Results

Seguindo o protocolo descrito (resumido na Figura 1), a ANL foi administrada a camundongos por injeções intraperitoneais diárias (400 mM de ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) por 7 dias, ou via água potável (0,7% de Maltose, 1% de ANL, CamkII-Cre::MetRS*) por 21 dias. Após a rotulagem, as áreas cerebrais correspondentes foram dissecadas, lisadas, alquiladas e clicadas. As reações de cliques foram analisadas por SDS-PAGE e Western Immunoblot. Imagens representativas dos .......

Discussion

Os aspectos críticos do protocolo são; a inclusão de controles negativos, com replicações biológicas suficientes, via de administração de ANL, quantidade e duração, alquilação das amostras, concentração de alquinos e eliminação de β-mercaptoetanol ao usar o DST-alquino.

É fundamental incluir amostras de controle negativas provenientes de animais marcados com ANL sem condutor Cre e, portanto, sem expressão MetRS*. Essas amostras devem ser submetidas a todas as etapas descritas no protocolo em p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12% de gel de acrilamida	GenScript	SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoetanol	Sigma	M6250	Tóxico; use jaleco, luvas e exaustor.
Bicarbonato de amônio	Sigma	9830	Tóxico; use um jaleco, luvas e um exaustor
ANL			Sintetizado conforme descrito anteriormente para AHA (ver referências 5 e 11)
ANL-HCl	IrishBotech	HAA1625.0500
Benzonase	Sigma	E1014
Biotina alcino	Thermo,	B10185
Anticorpo de frango anti-GFP	Aves	1020
Inibidor completo de protease livre de EDTA	Roche	4693132001	Toxic; use jaleco e luvas.
Brometo de cobre (I)	Sigma	254185	99,999% (peso / peso)
Etiqueta de dissulfeto (DST) - alcino			Sintetizado conforme relatado no número de referência 15, no qual é referido como sonda 20
DMSO	Sigma	276855
Filtros	Merk	SCGP00525
Acetamida de iodo (IAA)	Sigma	I1149
IR anti frango 800	LI-COR	IRDye 800CW	Anticorpo Secundário Anti-Frango
de Burro IR anti rabit 680	LI-COR	IRDye 680RD	Anticorpo Secundário de IgG de Cabra Anti-Coelho
Maltose	Sigma	M9171
Misturador Manual	Produtos BioSpec	1083
NaCl	Sigma	S9888
N-etilmaleimida	Sigma	4259	Tóxico; Use jaleco, luvas e exaustor.
Grânulos NeutrAvidin	Pierce	29200
Membrana de nitrocelulose	Bio-rad	1620112
PBS 1X	Thermo	J62036.K2
PBS 1X pH 7,8			Preparação descrita no número de referência 5
PD SpinTrap G-25 colunas	GE Healthcare		Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo,	23225	Os reagentes no Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA são tóxicos para a vida aquática.
Anticorpo anti-biotina policlonal de coelho	Sinalização celular	5597
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010
SDS 10%	Sigma	71736
SDS-PAGE  Buffer de corrida MOPS	GenScript	M00138
SYPRO Ruby stain	Sigma	S4942
Tabela automática Vortexer	Eppendorf	Mixmate
Triazole ligante	Sigma	678937
Triton X-100	Sigma	T9284
Water	Sigma	W4502	Grau de biologia molecular