Artigo de método

Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

DOI:

10.3791/63713

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13 de abril de 2022

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1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.

Resumo

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Compreender a homeostase proteica in vivo é fundamental para saber como as células funcionam em condições fisiológicas e de doença. O presente protocolo descreve a marcação in vivo e a subsequente purificação de proteínas recém-sintetizadas usando uma linha de camundongos modificados para direcionar a marcação de proteínas para populações celulares específicas. É uma linhagem induzível pela expressão da Cre recombinase da L274G-Metionina tRNA sintetase (MetRS*), possibilitando a incorporação de azidonorleucina (ANL) às proteínas, o que de outra forma não ocorrerá. Usando o método descrito aqui, é possível purificar proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo e detectar mudanças sutis no teor de proteína devido à redução da complexidade da amostra.

Introdução

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A homeostase proteica aberrante é causada por um desequilíbrio na síntese e degradação de proteínas. Diversas doenças estão relacionadas a alterações na homeostase proteica. A marca registrada de algumas doenças é a presença de agregados em diferentes locais subcelulares e áreas cerebrais. A homeostase proteica não é apenas importante na doença, mas também desempenha um papel crucial na função normal dos órgãos e células1. Por exemplo, a síntese proteica é necessária para muitas formas de plasticidade neuronal2,3, conforme determinado pelo uso de inibidores químicos que bloqueiam a síntese proteica4. No entanto, não está claro em quais tipos de células o proteoma é alterado para apoiar a aprendizagem e a memória, nem se entende quais proteínas específicas em cada tipo de célula aumentam ou diminuem sua síntese ou degradação. Assim, um estudo abrangente da homeostase de proteínas requer a capacidade de diferenciar proteomas provenientes de tipos específicos de células. De fato, a identificação de proteomas específicos do tipo celular para estudar processos celulares que ocorrem em um ambiente multicelular tem sido um obstáculo importante na proteômica. Por esse motivo, desenvolvemos uma técnica utilizando a expressão de MetRS* combinada com métodos bioortogonais que tem se mostrado uma forma eficaz de identificar e purificar proteomas específicos do tipo celular, preenchendo essa lacuna 5,6,7.

A expressão de um MetRS* mutante (MetRS L274G) permite a carga do ANL análogo à metionina não canônico no RNAt 8,9 correspondente e sua subsequente incorporação em proteínas. Quando a expressão de MetRS* é regulada por um promotor específico do tipo celular, o aminoácido não canônico será incorporado às proteínas de maneira seletiva celular. Uma vez que o ANL é incorporado nas proteínas, ele pode ser seletivamente funcionalizado por click-chemistry e, posteriormente, visualizado por imagem (FUNCAT) ou por Western Immunoblot (BONCAT). Alternativamente, as proteínas podem ser seletivamente purificadas e identificadas por espectrometria de massa (EM). Usando essa tecnologia, criamos uma linha de camundongo expressando a proteína MetRS* sob o controle da Cre recombinase. Considerando o crescente número de linhas de camundongos Cre disponíveis, o sistema MetRS* pode ser usado em qualquer campo para estudar qualquer tipo de célula de qualquer tecido para o qual exista uma linha Cre existente. A marcação de proteínas com ANL é possível in vitro ou in vivo, e não altera o comportamento do camundongo ou a integridade da proteína6. O período de tempo de rotulagem pode ser adaptado à questão científica de cada pesquisador, marcando proteínas recém-sintetizadas (tempos de rotulagem mais curtos) ou proteomas inteiros (tempos de rotulagem mais longos). O uso dessa técnica é limitado pelo número de células do tipo que o pesquisador está disposto a estudar; portanto, o isolamento proteico de tipos de células com baixo número ou baixas taxas metabólicas não é possível por este método. O objetivo do método apresentado é identificar proteínas/proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo. Neste protocolo, descrevemos como rotular proteomas específicos do tipo celular com ANL em camundongos vivos e purificar as proteínas marcadas. Após a purificação, as proteínas podem ser identificadas por protocolos de espectrometria de massas de rotina 5,10. A redução da complexidade da amostra alcançada neste método pela purificação seletiva de proteínas de populações celulares específicas permite ao experimentador detectar mudanças sutis nos proteomas, por exemplo, em resposta a mudanças ambientais. A purificação das proteínas marcadas pode ser alcançada em ~10 dias, não incluindo a análise de EM ou o período de rotulagem. Aqui, descrevemos dois métodos para a administração de ANL em camundongos que expressam MetRS*, a saber: (1) adição do aminoácido na água potável e (2) introdução de ANL por injeções intraperitoneais. Independentemente do método escolhido para a administração de ANL, as etapas de isolamento e purificação são as mesmas (a partir da etapa 2).

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram realizados com permissão dos escritórios do governo local na Alemanha (RP Darmstadt; protocolos: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) ou Espanha (Comitê de Experimentos em Animais da UCM e Aconselhamento Ambiental da Comunidade de Madri, número de protocolo: PROEX 005.0/21) e estão em conformidade com as regras da Sociedade Max Planck e regulamentos espanhóis e seguem as diretrizes da UE para o bem-estar animal.

1. Marcação metabólica in vivo com ANL

  1. Água potável:
    1. Dissolva a ANL e a maltose na água potável regular dos camundongos. A concentração recomendada de maltose é de 0,7% (peso / vol). A quantidade máxima de ANL adicionada à água potável é de 1% (m/vol). Quando a mistura estiver pronta, esterilizá-la por filtração e armazená-la a 4 °C.
    2. Fornecer a mistura preparada no passo 1.1 aos ratinhos. Troque as garrafas com frequência (por exemplo, a cada 3 dias) para evitar contaminações e verifique-as todos os dias para procurar possíveis contaminações ou entupimentos. Monitore a quantidade de água ingerida diariamente, pesando-a, para saber a ingestão de ANL dos ratos.
      NOTA: O período máximo de rotulagem avaliado aqui é de 3 semanas usando uma concentração de ANL de 1% na água potável, o que resultou em rotulagem bem detectável no cérebro. Uma boa rotulagem também pode ser alcançada em 2 semanas. Nem tempos de rotulagem mais curtos, nem períodos de tempo mais longos, nem outras quantidades de ANL foram estudados por nós usando este método de administração, o que não implica que o acima exposto não funcionaria. As taxas de incorporação de ANL podem variar dependendo do tecido estudado ou do tipo de célula. O tempo de rotulagem pode variar dependendo da questão científica; por exemplo, se os proteomas fossem marcados, o tempo de marcação deveria ser calculado em função das meias-vidas médias das proteínas no tecido estudado. Se o interesse é apenas identificar proteínas recém-sintetizadas, os tempos podem ser encurtados. Os períodos de rotulagem e as dosagens de ANL devem ser testados empiricamente para cada condição experimental e tipo de célula de interesse.
  2. Administração intraperitoneal:
    1. Dissolva o ANL em solução fisiológica de NaCl a 400 mM, tampão salino fosfato (PBS) ou água.
    2. Certifique-se de que a osmolaridade da solução está dentro da faixa fisiológica. Aqui, 10 mL/kg de peso corporal de solução de ANL são administrados aos camundongos.
      NOTA: Uma boa marcação nos neurônios excitatórios do cérebro é obtida com sucesso por uma injeção intraperitoneal (IP) diária com 400 mM de ANL por 1 semana. Nem concentrações mais baixas de ANL nem outros períodos de marcação por injeções de IP foram testados neste estudo, o que não implica que eles não funcionariam. ANL é fornecido como cloridrato por algumas empresas. Neste caso, o pH das soluções deve ser ajustado ao pH adequado (dependendo da via de administração). A ANL também pode ser sintetizada seguindo o método publicado por Link et al.11 com algumas modificações5. A marcação da ANL pode ser realizada usando outras concentrações, intervalos de tempo e vias de administração da ANL. Para tecidos/tipos celulares com baixas taxas metabólicas, uma dieta de metionina de baixo teor pode ser usada, sempre começando 1 semana antes da administração de ANL. Quando se utiliza um ANL de 400 mM, pode precipitar-se enquanto armazenado a 4 °C; o aquecimento até 37 °C traz a ANL de volta à solução. Deixe atingir a temperatura ambiente antes da injeção. Na maioria das regiões do mundo, a administração de ANL em camundongos é um experimento animal e precisa ser aprovada pelas autoridades competentes.

2. Colheita de tecidos, lise e extração de proteínas

  1. Dissecção de tecido: Dissecar a área de tecido que contém o tipo de célula de interesse e observar o peso do pedaço de tecido coletado.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). No presente protocolo, o córtex e o hipocampo dos camundongos foram dissecados.
  2. Lise tecidual: Homogeneizar o tecido à temperatura ambiente adicionando um volume 12-15 vezes o peso húmido do tecido do tampão de lise (PBS pH 7,4, 1% em peso / vol SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol / vol), um inibidor de protease (PI) (livre de EDTA 1:4000)). Por exemplo, para uma peça de tecido de 20 mg, adicione 240-300 μL de tampão de lise. Triturar o tecido até que ele seja homogeneizado.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). Para homogeneização direta em tubos de 1,5 mL, recomenda-se o uso de um homogeneizador portátil operado por bateria, especialmente quando pequenos pedaços de tecido são processados. Para peças maiores, um homogeneizador Dounce pode ser usado. A cada tampão onde os inibidores de protease (IP) estão incluídos, eles devem ser adicionados imediatamente antes do uso e não antes.
  3. Desnaturação de proteínas: Aquecer o homogeneizado a 75 °C durante 15 min e centrifugar a 17.000 x g durante 15 min a 10 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
  4. Medição do teor de proteína: Medir a concentração de proteína de cada amostra e ajustar todas as amostras para serem comparadas com a mesma concentração de proteína; ajustar a concentração adicionando tampão de lise. Uma faixa de concentração ideal está entre 2-4 μg/μL.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem).
  5. Alkylation
    1. Diluir as amostras homogeneizadas em 2-3 vezes em PBS (pH 7,8) + PI (livre de EDTA 1:4000).
    2. Adicionar iodoacetamida (IAA) a uma concentração final de 20 mM (solução-mãe a 500 mM).
    3. Deixar as amostras durante 1-2 h a 20 °C no escuro. Siga as etapas 2.5.2-2.5.3 duas vezes.
      NOTA: Para alguns tecidos, se o clique inespecífico no controle negativo permanecer alto, pode ser necessário realizar uma etapa de redução antes da alquilação12. Preparar a unidade populacional IAA na hora, imediatamente antes de a adicionar às amostras. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem).
  6. Troca de tampão: Equilibre as colunas de troca de buffer usando o buffer de troca química de clique (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:4000)). Siga as instruções do fabricante. Troque todas as amostras alquiladas.
    NOTA: As amostras eluídas podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). Nesta etapa, o IAA é eliminado e o buffer é trocado pelo buffer químico click. A proteína pode ser medida novamente após a etapa de troca de tampão para garantir que as proteínas não foram perdidas durante o processo de troca de tampão. Dependendo do tipo de colunas usadas para troca de tampão, a proteína pode ser massivamente perdida. Use as colunas recomendadas para evitar a perda de proteínas. Para o armazenamento de amostras, recomenda-se a preparação de alíquotas.
  7. Clique na reação para avaliar a incorporação de ANL no experimento
    1. Colher 40 μL das amostras eluídas na etapa 2.6 e adicionar PBS (pH 7,8) a um volume final de 120 μL.
    2. Para configurar a reacção química de clique, adicionar os seguintes reagentes na ordem dada e vórtice durante 20 s após cada adição: 1,5 μL de ligante triazólico (estoque 40 mM), 1,5 μL de alcina biotina (estoque 5 mM) e 1 μL de brometo de(I) (estoque 10 mg/mL, dissolvido em DMSO por pipetagem cuidadosa para cima e para baixo, não vórtice). Adicione os reagentes o mais rápido possível.
    3. Incubar as amostras durante a noite no escuro a 4 °C com rotação contínua.
    4. Centrifugar as amostras a 4 °C durante 5 min a 17.000 x g. Um pellet ligeiramente turquesa será visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
      NOTA: Prepare o estoque de brometo de (I) imediatamente antes do uso para evitar a oxidação do cobre. Manter a relação de volumes entre a amostra lisada e a PBS constante entre as amostras é essencial para garantir a mesma concentração final de detergente em cada tubo. Para acelerar a montagem da reação química do clique, recomenda-se um vórtice de mesa com racks para tubos. Conservar as amostras clicadas a -80 °C durante vários meses ou a -20 °C durante algumas semanas até novo processamento (ponto de paragem).
  8. Análise de Western blot para avaliar a incorporação de ANL no experimento
    1. Execute um SDS-PAGE com 20-40 μL do sobrenadante a partir da reação química do clique (etapa 2.7). Use géis de acrilamida a 12%, executados em SDS a 1%, Tris-HCl de 250 mM, glicina de 2 mM. Corra até que a frente esteja fora do gel.
    2. Transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF13.
    3. Incubar a membrana durante a noite a 4 °C com anticorpo GFP (1:500, proteína GFP é co-traduzida com MetRS*5) e anticorpo biotina (1:1000) para detecção de alquino clicado, que é conjugado à biotina.
    4. Lave o anticorpo primário 2 vezes durante 10 minutos e adicione o anticorpo secundário durante 1,5 h.
    5. Lave o anticorpo secundário 2 vezes durante 10 minutos e analise (se estiver a utilizar anticorpos conjugados com fluoróforos) ou exponha a filmes (se utilizar anticorpos conjugados com peroxidase de rábano).
    6. Quantifique o sinal de biotina usando o ImageJ ou software similar, avalie a rotulagem geral de cada amostra do experimento e detecte possíveis valores atípicos. Avaliar a relação sinal-ruído (marcação da amostra de ANL para o fundo dos controles negativos) do experimento e detectar possíveis animais que não conseguiram retomar/incorporar a ANL.
      NOTA: Para amostras com alta incorporação de ANL, a purificação de proteínas é teoricamente possível usando alcinos não cliváveis como o usado nesta seção para a avaliação da incorporação de ANL. Usando amostras cerebrais, o fundo obtido nos controles negativos pela EM após a purificação de proteínas usando alcinos não cliváveis é muito alto14. Portanto, apenas os alcinos mais fáceis de manusear e não cliváveis foram utilizados para uma primeira amostra geral e avaliação do experimento. Independentemente do tipo de alquino destinado à purificação de proteínas, é aconselhável executar as etapas para a otimização da dosagem de alcino descritas na seção a seguir (etapa 2.9).
  9. Reação de clique para otimização da dosagem de alquino clivável
    1. Preparar quatro tubos com 40 μL de uma amostra representativa (obtida na etapa 2.6 e avaliada na etapa 2.8) e adicionar PBS (pH 7,8) a um volume final de 120 μL.
    2. Configure a reação química do clique, conforme explicado na etapa 2.7, mas, desta vez, adicione quatro quantidades diferentes do DST-alquino. Para o referido alquino, recomenda-se testar 5 μM, 15 μM, 30 μM e 60 μM.
    3. Repita a etapa 2.8 para decidir qual é a dosagem de alcino mais adequada para a questão experimental específica em estudo, com base na maior eficiência de marcação com o menor sinal de fundo.
      NOTA: Antes de submeter as amostras restantes a uma reação de clique, a quantidade ideal de qualquer alcino precisa ser determinada. Existem várias opções de alcinos comercialmente disponíveis que podem ser usados. Eles diferem na forma de clivagem (por exemplo, agentes leves ou redutores). A química de cliques sem cobre usando reagentes promovidos por cepas (por exemplo, reagentes DBCO) também é possível. Pequenas mudanças na quantidade de alcinos ou reagentes DBCO geralmente aumentam significativamente o sinal no controle negativo (fundo). Aqui, a purificação da proteína usando um alcino com uma ponte de dissulfeto clivável por agentes redutores (alcino de biotina dissulfeto ou DST-alquino15) é descrita. Ao usar o DST-alquino, para executar o SDS-PAGE (etapa 8.1), evite carregar buffers com agentes redutores fortes, como TDT ou β-Mercaptoetanol para evitar a clivagem alquina. Neste estudo, o aquecimento a 72 °C, por 5 min, usando 5 mM de N-etilmaleimida (NEM) no tampão de carga não afeta a estabilidade do alcino DST. A etapa 2.9.2 pode ser repetida, testando doses mais finas na faixa da melhor observada.
  10. Reação de clique preparativa para purificação de proteínas
    1. Clique em todas as amostras obtidas na etapa 2.6 com a dosagem ótima de alcino determinada na etapa 2.9 e analise uma fração por SDS-PAGE e Western blot (etapa 2.8).
      NOTA: Certifique-se de que as pipetas estão devidamente calibradas para garantir a precisão do upscaling da amostra. As amostras clicadas podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem).

3. Purificação de proteínas

  1. Troca de buffer
    1. Submeta todas as amostras clicadas a um procedimento de troca de buffer, conforme descrito na etapa 2.6, mas use o buffer de ligação Neutravidin como buffer de equilíbrio (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:2000)).
      NOTA: As amostras eluídas podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). Nesta etapa, o alcino livre não clicado é eliminado e o buffer é trocado pelo buffer de ligação Neutravidina.
  2. Ligação a grânulos de Neutravidin
    1. Lavar os grânulos de alta capacidade de Neutravidin com o tampão de ligação Neutravidin (ver passo 3.1); misturar os grânulos com o tampão e centrifugar a mistura durante 5 minutos a 3000 x g e eliminar o sobrenadante. Repita três vezes.
    2. Prepare uma pasta 1:1 de grânulos de Neutravidina, adicionando o mesmo volume de grânulos secos e tampão de ligação de Neutravidina.
    3. Retirar 20-40 μL de cada amostra em lisado pré-purificado e armazená-la a -20 °C.
    4. Medir a concentração de proteínas (ver etapa 2.4) e misturar 100 μg de proteína com 4 μL da pasta de grânulos obtida na etapa 3.2.2.
    5. Incubar a mistura durante a noite a 4 °C com rotação contínua, permitindo que as proteínas marcadas se liguem às contas.
      NOTA: Quanto à reação química do clique, a reação básica de purificação de afinidade descrita na etapa 3.2.4 pode ser aumentada. Por exemplo, para purificação de proteínas dos neurônios excitatórios do hipocampo, 1 mg de lisado de proteína é misturado com 40 μL de contas de Neutravidin (pasta 1:1). A quantidade de esferas de Neutravidin pode ser aumentada ou reduzida de acordo com a quantidade de proteínas marcadas por mg de proteína total, o que dependerá do tipo de célula escolhido e do período de marcação e precisa ser determinado empiricamente.
  3. Lavagens de contas de neutravidina e eluição de proteínas
    1. Recolher os sobrenadantes por centrifugação (ver passo 3.2.1). Deixar de lado uma alíquota de 20-40 μl de cada sobrenadante para análise posterior e congelar o resto a -80 °C.
    2. Lave as contas com tampão de lavagem Neutravidin refrigerado 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:2000)) adicionando o tampão, sedimentando as contas e descartando o sobrenadante. Repita esta etapa três vezes.
    3. Em seguida, adicionar o mesmo tampão e incubar as contas durante 10 minutos sob rotação contínua a 4 °C antes de eliminar o sobrenadante. Repita esta etapa três vezes.
    4. Lave as contas conforme explicado nas etapas 3.3.2-3.3.3, mas usando o tampão de lavagem Neutravidin 2 (1x PBS, pH 7,4 e PI 1:2000).
    5. Lave as contas conforme explicado na etapa 3.3.2-3.3.3, mas usando o tampão de lavagem Neutravidin 3 (bicarbonato de amônio 50 mM e PI 1:2000).
    6. Eluir as proteínas clicadas incubando as contas por 30 min a 20 °C com um volume de tampão de eluição de Neutravidina (5% (vol/vol) β-mercaptoetanol e 0,03% (em peso/vol) SDS) correspondente a um volume das esferas secas utilizadas.
    7. Manter os grânulos em suspensão durante a eluição por agitação contínua (1000 rpm) num agitador termobloco. Elute duas vezes e combine ambos os eluates.
      NOTA: A centrifugação configurada para a separação da fracção sólida do chorume (grânulos) e da fase aquosa (sobrenadante), tal como explicado no passo 3.2.1, aplica-se aos passos 3.3.1-3.3.7. A quantidade de SDS pode ser aumentada se a eluição da proteína não estiver completa. No entanto, com quantidades acima de 0,08%-0,1% de SDS, as proteínas não especificamente ligadas às esferas começam a ser eluídas. β-mercaptoetanol é volátil e tóxico; o uso de um exaustor para as etapas 3.3.6-3.3.7 é aconselhável. As amostras recolhidas nos passos 3.2.3 e 3.3.1 devem ser geridas pelo SDS-PAGE e avaliadas pelo Western blot (ver passo 2.8) para avaliar a eficiência da purificação da afinidade (passo 3.3).
  4. Avaliação de proteínas eluídas
    1. Carregue 1/3 das amostras eliminadas em uma SDS-PAGE (consulte a etapa 2.8.1).
    2. Colora o gel para visualizar proteínas usando um método de alta sensibilidade, como coloração de prata ou um método fluorescente.
    3. Se as amostras tiverem a qualidade esperada, o que significa que há 3-4 vezes mais proteína nas amostras marcadas com ANL em comparação com o controle negativo, as proteínas eluídas podem ser identificadas por métodos rotineiros de espectrometria de massa, como o explicado na referência5.

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Resultados

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Seguindo o protocolo descrito (resumido na Figura 1), a ANL foi administrada a camundongos por injeções intraperitoneais diárias (400 mM de ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) por 7 dias, ou via água potável (0,7% de Maltose, 1% de ANL, CamkII-Cre::MetRS*) por 21 dias. Após a rotulagem, as áreas cerebrais correspondentes foram dissecadas, lisadas, alquiladas e clicadas. As reações de cliques foram analisadas por SDS-PAGE e Western Immunoblot. Imagens representativas dos ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os aspectos críticos do protocolo são; a inclusão de controles negativos, com replicações biológicas suficientes, via de administração de ANL, quantidade e duração, alquilação das amostras, concentração de alquinos e eliminação de β-mercaptoetanol ao usar o DST-alquino.

É fundamental incluir amostras de controle negativas provenientes de animais marcados com ANL sem condutor Cre e, portanto, sem expressão MetRS*. Essas amostras devem ser submetidas a todas as etapas descritas no protocolo em p...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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O B.A-C é financiado pelo Ministério da Ciência e Inovação espanhol (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) e pelas subvenções MICINN (PID2020-113270RA-I00). A R. A-P é financiada pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). O E.M.S. é financiado pela Max Planck Society, um prêmio de Investigador Avançado do Conselho Europeu de Pesquisa (subvenção 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis e DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Agradecemos a D.C Dieterich e P. Landgraf por seu conselho técnico e pela síntese do DST-Alkyne. Agradecemos a E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast e à instalação de animais do MPI for Brain Research por seu excelente apoio. Agradecemos a Sandra Goebbels por compartilhar a linha de mouse Nex-Cre. Agradecemos a Antonio G. Carroggio por sua ajuda com a edição em inglês. B.A-C. projetou, conduziu e analisou experimentos. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. e S. t. D. realizou e analisou experimentos. B.A-C e E.M.S. projetaram experimentos e supervisionaram o projeto, B.A-C escreveu o artigo. Todos os autores editaram o artigo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
12% de gel de acrilamidaGenScriptSurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-MercaptoetanolSigmaM6250Tóxico; use jaleco, luvas e exaustor.
Bicarbonato de amônioSigma9830Tóxico; use um jaleco, luvas e um exaustor
ANLSintetizado conforme descrito anteriormente para AHA (ver referências 5 e 11)
ANL-HClIrishBotechHAA1625.0500
BenzonaseSigmaE1014
Biotina alcinoThermo,B10185
Anticorpo de frango anti-GFPAves1020
Inibidor completo de protease livre de EDTARoche4693132001Toxic; use jaleco e luvas.
Brometo de cobre (I)Sigma25418599,999% (peso / peso)
Etiqueta de dissulfeto (DST) - alcinoSintetizado conforme relatado no número de referência 15, no qual é referido como sonda 20
DMSOSigma276855
FiltrosMerkSCGP00525
Acetamida de iodo (IAA)SigmaI1149
IR anti frango 800LI-CORIRDye 800CWAnticorpo Secundário Anti-Frango
de Burro IR anti rabit 680LI-CORIRDye 680RDAnticorpo Secundário de IgG de Cabra Anti-Coelho
MaltoseSigmaM9171
Misturador ManualProdutos BioSpec1083
NaClSigmaS9888
N-etilmaleimidaSigma4259Tóxico; Use jaleco, luvas e exaustor.
Grânulos NeutrAvidinPierce29200
Membrana de nitroceluloseBio-rad1620112
PBS 1XThermoJ62036.K2
PBS 1X pH 7,8Preparação descrita no número de referência 5
PD SpinTrap G-25 colunasGE HealthcareBuffer exchange
Pierce BCA Protein Assay KitThermo,23225Os reagentes no Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA são tóxicos para a vida aquática.
Anticorpo anti-biotina policlonal de coelhoSinalização celular5597
Membrana PVDFMilliporeIPVH00010
SDS 10%Sigma71736
SDS-PAGE  Buffer de corrida MOPSGenScriptM00138
SYPRO Ruby stainSigmaS4942
Tabela automática VortexerEppendorfMixmate
Triazole liganteSigma678937
Triton X-100SigmaT9284
WaterSigmaW4502Grau de biologia molecular

Referências

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