Evidências crescentes indicam que a infiltração excessiva de lipídios dentro do músculo esquelético resulta em lipotoxicidade e diabetes. Aqui, apresentamos um protocolo completo, incluindo processamento de tecidos, coloração com Bodipy, aquisição de imagens e análise, para quantificar o tamanho, densidade e distribuição subcelular de gotículas lipídicas de forma específica do tipo fibra.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético
Neste artigo
Resumo
Resumo
A infiltração de lipídios musculares esqueléticos, conhecida como micosteatose, aumenta com obesidade e envelhecimento. A miostetose também foi descoberta recentemente como um fator prognóstico negativo para vários outros transtornos, como doenças cardiovasculares e câncer. A infiltração excessiva de lipídios diminui a massa e a força muscular. Também resulta em lipotoxicidade e resistência à insulina, dependendo do teor total de lipídio intramialcelular, morfologia de gotícula lipídica (LD) e distribuição subcelular. O tipo de fibra (oxidativo versus glicolítico) também é importante, uma vez que as fibras oxidativas têm maior capacidade de utilizar lipídios. Devido às suas implicações cruciais na fisiopatologia, estudos aprofundados sobre a dinâmica ld e função de forma específica do tipo de fibra são justificados.
Aqui, é apresentado um protocolo completo para a quantificação do conteúdo lipídudo intramyocelular e análise da morfologia LD e distribuição subcelular de forma específica do tipo de fibra. Para isso, as crioseções musculares em série foram manchadas com o corante fluorescente Bodipy e anticorpos contra isoformas de cadeia pesada de miosina. Este protocolo permite o processamento simultâneo de diferentes músculos, economizando tempo e evitando possíveis artefatos e, graças a uma macro personalizada criada em Fiji, a automatização da análise LD também é possível.
Introdução
A infiltração de lipídios musculares esqueléticos, conhecida como micosteatose, aumenta com obesidade e envelhecimento. A miostetose está negativamente correlacionada com massa muscular e força e com sensibilidade à insulina1. Além disso, estudos recentes indicam que o grau de mostetose poderia ser usado como fator prognóstico para outras condições como doença cardiovascular2, doença hepática gordurosa não alcoólica3 ou câncer4. Lipídios podem se acumular no músculo esquelético entre as fibras musculares como lipídios extramyocelulares ou dentro das fibras, como lipídios in....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos realizados em camundongos foram aprovados pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal do Setor Médico da Université Catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).
1. Dissecção e preparação das amostras para congelamento
- Rotule um pedaço de rolha de 3 mm de espessura para cada par de músculos.
- Através de uma pequena incisão feita com uma lâmina no centro da rolha, insira perpendicularmente uma peça retangular de plástico rígido (0,5 cm W, 1 cm H) que servirá como suporte (Figura 2B).
NOTA: O tamanho da peça de plástico retangular dependerá do tamanho d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O protocolo descrito aqui fornece um método eficiente para quantificar facilmente os LDs de forma subcelular e subcelular. Mostra como, congelando juntos dois músculos de tamanho semelhante, como o EDL e o soleus, o tempo e os recursos gastos nas etapas seguintes são reduzidos pela metade.
Um protocolo completo é fornecido para imunostaining, aquisição de imagem e análise dos diferentes isoformes MyHC expressos em músculos de camundongos adultos. Este protocolo é baseado no primeiro projetado .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo aqui detalhado descreve um método eficiente para quantificar LDs marcados com Bodipy em uma base tipo de fibra e subcelular específico. Nos últimos anos, corantes lipídicos clássicos, como ORO ou Sudan Black B, foram substituídos por uma nova matriz de corantes celulares permeáveis, lipofílicos, fluorescentes que se ligam a lipídios neutros (por exemplo, Bodipy). Disponível como diferentes conjugados, Bodipy tem se mostrado muito eficaz na marcação de LDs para estudar sua morfologia, dinâmica e interação com .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por subvenções da Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) e da Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. é o beneficiário de uma bolsa de doutorado da FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. recebeu uma bolsa do Programa internacional de Excelência Wallonie-Bruxelles.
Os autores agradecem a Alice Monnier por sua contribuição para o desenvolvimento deste protocolo e Caroline Bouzin por sua expertise e ajuda técnica no processo de aquisição de imagens. Agradecemos também à plataforma de imagem 2IP-IREC pelo acesso ao criostat e aos microscópios (2IP-....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipamento | |||
| AxioCam 506 câmera mono 6 Mpix | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix câmera CCD | Zeiss | ||
| Capuz químico | Potteau Labo | EN-14175 | |
| Microscópio confocal | Zeiss | LSM800 | |
| Discos de cortiça (ø 20 mm, 3 mm de espessura) | 63305 | da Electron Microscopy Sciences | |
| 16072252 | |||
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| Microscópio Estéreo de Dissecação SMZ745 | Nikon | ||
| Ice Seco | |||
| Dumont Fórceps | FST | 11295-10 | |
| Microscópio de Epifluorescência | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Tesoura Bonn Extra Fina | FST | 14084-08 | |
| FisherBrand Descartável Moldes de Base (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Usado para cortar um pedaço para segurar o músculo na cortiça para congelar |
| Placa de Petri de vidro (H 25 mm, ø 150 mm) | MARCA Placa de Petri, MERK | BR455751 | Usada para colocar os músculos no gelo durante a dissecção |
| ImmEdge Barreira hidrofóbica PAP Pen Vector | Labs | H-4000 | Usada para criar uma barreira hidrofóbica ao redor das seções musculares |
| Incubadora | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| Óculos de Cobertura para Microscópio (24x50 mm) | Assistente | ||
| Caixas de Lâminas de Microscópio | Kartell | 278 | Usado como câmaras úmidas para imuno-histoquímica |
| Suporte de pescoço | Linie zwo | SB-035X-02 | Usado como alça para segurar o copo de aço inoxidável |
| No 15 Lâmina de bisturi de aço carbono estéril | Swann-Morton | 0205 | |
| Pincéis | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Usado para lidar com criosseções |
| Caneta Marcador Permanente Preto | Klinipath/VWR | 98307-R | Usado para rotular slides |
| Pinças de Fixação de Perfuração | F.S.T | 18155-13 | |
| Caixa de Poliestireno | A 12 cm x C 25 cm x L 18 cm, usado como recipiente de nitrogênio líquido e para transportar as amostras para o criostato | ||
| Cabo de bisturi, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler para encher com isopenteno para congelamento muscular |
| Slides Superfrost Ultra Plus | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| Pinças cirúrgicas 1/2 dentes | Medische Vakhandel | 1303152 | Também chamado de "pinça de dentes de rato" |
| Tesoura de mola Vannas - 3 mm Ponta | F.S.T | 15000-00 | |
| Barcos de pesagem | VWR international | 611-2249 | |
| Scanner de lâmina inteira para fluorescência | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Usado em uma concentração final de 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Usado em um concentração final de 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Usado em uma concentração final de 1:1.000 |
| Alexa Fluor 647 anticorpo secundário anti-rato-IgG de cabra (H+L) | ThermoFisher | A-21247 | Usado em uma concentração final de 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Usado em uma concentração final de 1 µ g/mL |
| BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Tienil)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indaceno-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Usado em uma concentração final de 1 µ g/mL |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo) | ThermoFisher | D1306 | Usado em uma concentração final de 0,5 µ g / mL |
| de dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Usado para resolver Bodipy para a solução estoque de 1 mg / mL. CUIDADO< / forte>: Tóxico e inflamável. Os vapores podem causar irritação. Manipular em um exaustor. Evite o contato direto com a pele. Use luvas de borracha, óculos de proteção. |
| Solução de formaldeído 4%, tamponada, pH 6,9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CUIDADO: Pode causar uma reação alérgica na pele. Suspeito de causar defeitos genéticos. Pode causar câncer. Manipular em um exaustor. Evite o contato direto com a pele. Use luvas de borracha, óculos de proteção. |
| Isopentano GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CUIDADO: Líquido e vapor extremamente inflamáveis. Pode ser fatal se ingerido e entrar nas vias aéreas. Pode causar sonolência ou tontura. A exposição repetida pode causar ressecamento ou rachaduras na pele. Use luvas de proteção/roupas de proteção/proteção para os olhos/proteção facial. |
| Nitrogênio Líquido | CUIDADO: Extremamente frio. Use luvas. Manuseie lentamente para minimizar a fervura e respingos e em áreas bem ventiladas. Use recipientes projetados para líquidos de baixa temperatura. | ||
| Reagente de Bloqueio de Mouse com Mouse | Vector Labs | MKB-2213-1 | Usado na concentração de 1:30 |
| Cadeia pesada de miosina Tipo I (BA-D5-s Anticorpo Primário) Gene: MYH7, camundongo monoclonal bovino anti IgG2b | DSHB Universidade de Iowa | BA-D5-sobrenadante | Usado em uma concentração final de 1:10 |
| Cadeia pesada de miosina Tipo IIA (SC-71-s Anticorpo Primário) Gene: MYH2, camundongo bovino monoclonal anti IgG1 | DSHB Universidade de Iowa | SC-71-sobrenadante | Usado em uma concentração final de 1:10 |
| Cadeia pesada de miosina tipo IIX (anticorpo primário 6H1-s), Gene: MYH1, Estudos de Desenvolvimento de IgM de camundongo anti camundongo monoclonal | Banco de Hibridoma, Universidade de Iowa | 6H1-sobrenadante | Usado em uma concentração final de 1:5 |
| Soro de Cabra Normal (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | Comumente usado em laboratórios de histologia | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| Anticorpo primário anti-Laminina-2 (α-2 Chain) de rato (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Usado em uma concentração final de 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T composto | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Usado para projetar as figuras | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Software confocal | |
| BioRender | https://biorender.com/ | Usado para projetar as figuras | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Usado para analisar as imagens adquiridas | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | Usado para reconstruir a histologia de todo o músculo após a varredura dos tipos de fibras | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | Usado para reconstruir a histologia de todo o músculo após escanear os tipos de fibras |
Referências
- Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963(2020).
- Miljkovic, I., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
