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Artigo de método

Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF

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⸱

DOI:

10.3791/63720

⸱

11 de abril de 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

Neste artigo

Resumo

MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.

Resumo

O RNA é um biopolímero presente em todos os domínios da vida, e suas interações com outras moléculas e/ou espécies reativas, por exemplo, DNA, proteínas, íons, drogas e radicais livres, são onipresentes. Como resultado, o RNA sofre várias reações que incluem seu decote, degradação ou modificação, levando a espécies biologicamente relevantes com funções e implicações distintas. Um exemplo é a oxidação da guanina para 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que pode ocorrer na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). No geral, procedimentos que caracterizam tais produtos e transformações são em grande parte valiosos para a comunidade científica. Para isso, a espectrometria de massa de desorpização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) é um método amplamente utilizado. O presente protocolo descreve como caracterizar fragmentos de RNA formados após o tratamento enzimático. O modelo escolhido usa uma reação entre o RNA e o exoribonuclease Xrn-1, onde a digestão enzimática é interrompida em locais oxidados. Duas sequências de RNA longa de 20 nucleotídeos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] foram obtidas através de síntese de fase sólida, quantificado por espectroscopia UV-vis, e caracterizado via MALDI-TOF. Os fios obtidos foram então (1) 5'-fosforilados e caracterizados via MALDI-TOF; (2) tratado com Xrn-1; (3) filtrado e desálhado; (4) analisado via MALDI-TOF. Esta configuração experimental levou à identificação inequívoca dos fragmentos associados à paralisação de Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Os experimentos descritos foram realizados com 200 picomols de RNA (20 pmol utilizados para análises MALDI); no entanto, quantidades mais baixas podem resultar em picos detectáveis com espectrômetros usando fontes laser com mais potência do que a usada neste trabalho. É importante ressaltar que a metodologia descrita pode ser generalizada e potencialmente estendida à identificação do produto para outros processos envolvendo RNA e DNA, podendo auxiliar na caracterização/elucidação de outras vias bioquímicas.

Introdução

MALDI-TOF 1,2,3 é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização e/ou detecção de moléculas de tamanhos e características variados. Alguns de seus usos incluem diversas aplicações como a detecção de taninos a partir de recursos naturais4, metabólitos por imagem em alimentos5, descoberta ou monitoramento de alvos ou marcadores de drogas celulares6, e diagnóstico clínico7, para citar alguns. De relevância para o presente trabalho é o uso de MALDI-TOF com DNA ou RNA, com seu uso em oligonucleotídeos datando de mais de três décadas8, onde várias limitações foram observadas. Esta técnica evoluiu agora para um meio confiável e comumente utilizado para caracterizar tanto biopolímeros9 quanto identificar/entender reações químicas e bioquímicas, por exemplo, caracterização de locais platinados no RNA10, identificação de fragmentos de RNA após o decotedo fio 11,12, ou formação de ligações cruzadas proteína-DNA13 . Assim, é valioso ilustrar e destacar aspectos importantes do uso dessa técnica. Os fundamentos do MALDI-TOF foram descritos em formato de vídeo, bem como14 e não serão mais elaborados aqui. Além disso, sua aplicação em um contexto de DNA ou proteína foi previamente descrita e ilustrada no referido formato 15,16,17.

O protocolo de detecção de fragmentos de RNA formados após hidrólise enzimática é relatado aqui. O modelo experimental foi escolhido com base em um achado recente publicado pelo nosso grupo18, onde o MALDI-TOF foi usado para determinar a reatividade única entre o exoribonuclease Xrn-1 e os oligonucleotídeos do RNA contendo a lesão oxidativa 8-oxoG. Os fios longos de 20 nucleotídeos foram obtidos através da síntese em fase sólida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], enquanto Xrn-1 foi expresso e purificado após o relatório descrito anteriormente20. Resumindo, Xrn-121 é uma exorapenasnucleação de 5'3' com vários papéis biológicos importantes que degradam vários tipos de RNA, incluindo RNAoxidado 22. Verificou-se que a processividade da enzima para ao encontrar 8-oxoG, o que levou a fragmentos de RNA contendo extremidades fosfoiladas de 5'-phosphoiladas [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Por fim, é importante notar que a espectrometria de massa é um método poderoso que, através de várias metodologias, pode ser adaptado para outros propósitos23,24; assim, escolher o método de ionização certo, bem como outras configurações experimentais é de extrema importância.

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Protocolo

A água ultra pura sem rnase (Tabela 1) foi utilizada para o presente estudo.

1. Determinação de concentração da solução RNA

  1. Prepare a amostra de RNA seguindo os passos abaixo.
    1. Use um tubo de microcentrifuge (0,6 mL) para preparar uma solução de RNA diluindo 1 μL de solução de estoque (obtida através de síntese em fase sólida)19 em 159 μL de H2O. Livre de RNase misture a solução pipetando a mistura para cima e para baixo repetidamente (10x).
      NOTA: Uma vez que uma ampla gama de cuvetas estão disponíveis comercialmente, os volumes necessários podem diferir. Foram utilizadas cuvetas com comprimento de 1 cm e volume reduzido (150 μL).
    2. Enxágüe o cuvette UV-vis com metanol (2x), seguido de água (ultrapure H2O, 3x, ver Tabela de Materiais). Use um fluxo de gás nitrogênio para secar completamente a cuvette.
    3. Use uma pipeta para transferir a solução (passo 1.1.1) para o cuvette, garantindo que não haja bolhas de ar. Tampe a cuvette e coloque-a para o lado até que seja necessário.
  2. Determine a concentração da solução RNA preparada usando UV-vis Spectrophotometer.
    1. Ligue o espectrômetro UV-Vis invertendo o interruptor localizado na parte de trás do instrumento. Permita que o instrumento complete o procedimento de inicialização e clique no ícone UV WinLab para abrir a janela de operação/controle do instrumento.
    2. Ligue o espectrômetro do Controlador de Temperatura Peltier usando o interruptor localizado à direita do instrumento.
    3. Em Métodos Básicos, clique em Scan - Lambda 365. Outra tela abrirá e solicitará ao usuário que garanta que os suportes de celular estejam vazios. Clique em OK e permita que o instrumento realize suas verificações de sistema. Em seguida, o sistema exibirá uma lista de verificações, garantirá que todos "Passe" e clique em OK.
      NOTA: Recomenda-se seguir as etapas 1.2.1-1.2.3 na ordem fornecida; alterar essa sequência de eventos pode levar ao mau funcionamento do software.
    4. Ajuste os parâmetros de digitalização selecionando a Coleta de Dados. Na nova janela em Configurações de varredura , altere o Iniciar para 350 nm e o Final para 215 nm.
    5. Ative o Peltier selecionando o + à esquerda do Acessório. Clique em Multiple Cell Peltier, altere a temperatura °C para 25 e clique em Peltier On.
    6. Navegue até a guia Informações de amostra e digite o número de amostras, nomes e posição celular conforme desejado.
    7. Clique em Autozero e insira a cuvette contendo a solução de fundo. Certifique-se de posicionar esta cuvette no mesmo slot onde as medidas serão realizadas.
    8. Clique em Iniciar e insira o cuvette (passo 1.1.3) na célula desejada. Certifique-se de que a janela cuvette esteja orientada paralelamente à face frontal do instrumento. Clique em OK para iniciar a primeira varredura a 25 °C.
    9. Para medições em temperaturas mais altas, repita as etapas 1.2.5-1.2.8 e altere a temperatura para a temperatura amostral desejada (90 °C no presente caso).
    10. Clique em Arquivo > Exportar e escolha o local do arquivo desejado. Selecione XY Data para obter um arquivo .txt.
      NOTA: Um auxílio ilustrativo da etapa 1.2 pode ser encontrado no Arquivo Suplementar 1 (S1-S7).
  3. Realizar aquisição de dados para determinar a concentração de RNA.
    1. Encontre o arquivo de cada espectro na guia Resultados . Para obter a absorvância, passe o mouse sobre a linha, navegue até 260 nm e regisse as absorvâncias exibidas. Alternativamente, através da cascata de > de arquivos export , exporte os dados como um arquivo .txt para análises gráficas adicionais usando outro software de plotagem.
      NOTA: Se 0,1 < A ≥ 1, será necessário diluir ou aumentar a concentração da amostra de RNA preparada na etapa 1.1.1.
    2. Use a lei Beer-Lambert para calcular a concentração da solução.
      NOTA: Lei da Cerveja: A = εcl, onde:
      R: Absorvância (a 260 nm neste caso, a partir da etapa 1.3.1)
      ε: Coeficiente de extinção. Para a sequência utilizada aqui, 208.000 L mol-1 cm-1 é o valor obtido a partir de uma ferramenta OligoAnalyzer.
      l: Comprimento do caminho, 1 cm
      c: concentração da amostra
    3. Use esses cálculos para preparar a solução desejada do RNA para ser usado para experimentos subsequentes. Foram utilizadas soluções com [RNA] = 200 μM no presente estudo.

2. Hidrólise de oligonucleotídeos de RNA por Xrn-1

  1. Realize a fosforilação de 5' do RNA seguindo as etapas abaixo.
    1. Use um tubo de microcentrifuge de 0,6 mL para preparar a seguinte solução (volume total de 50 μL).
      1. Adicionar H2O sem RNase (33,5 μL); os volumes podem variar dependendo do [RNA].
      2. Em seguida, adicione a solução A (5 L, Tabela 1).
      3. Adicione uma solução aquosa de triptofato de adenosina (ATP, ver Tabela de Materiais) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
      4. Adicionar solução aquosa RNA (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
      5. Adicione a solução de quinase de polinucleotídeo (enzima PNK, ver Tabela de Materiais) (4,5 L, 45 unidades). Misture suavemente ao pipetar a mistura para cima e para baixo (10x).
    2. Incubar a mistura de reação a 37 °C por 45 min colocando-a em um banho de água.
    3. Inativar a enzima colocando o tubo de reação em um bloco de calor pré-aquecido (65 °C) e incubando a solução por 10 minutos.
    4. Permitir que a solução esfrie à temperatura ambiente (a fosforilação do RNA foi caracterizada através da análise MALDI-TOF, ver Resultados Representativos) para produzir uma solução final de RNA de 5'-fosforilado (4 μM, 50 μL).
  2. Execute a hidrólise de RNA por Xrn-1 seguindo os passos abaixo.
    1. Utilizando a solução (50 μL) a partir da etapa 2.1.4, realize as seguintes etapas.
      1. Adicionar a solução B (5 L, Tabela 1).
      2. Adicione uma solução de Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Misture a solução gentilmente tubondo para cima e para baixo (10x).
      3. Incubar o tubo de reação à temperatura ambiente por 2 h.
    2. Transfira a mistura de reação (passo 2.2.1.3) em um dispositivo centrífugo do tamanho de um poro de 10 kDa (ver Tabela de Materiais) e filtre as enzimas por centrifugação (700 x g por 10 min a temperatura ambiente).
    3. Transfira o filtrado para um tubo centrífuga de 0,6 mL.
    4. Lave o RNA residual no tubo centrífugo (passo 2.2.2.2.) adicionando H 2 O (20L) livre de RNase, seguido de centrifugação (700 x g por 10 min a temperatura ambiente).
    5. Combine o filtrado com o obtido a partir da etapa 2.2.3.
    6. Armazene o tubo contendo a solução resultante em um congelador (0 °C) ou navio para análise.

3. Desalting da solução RNA, mancha de placa MALDI-TOF

  1. Desaltar e concentrar a amostra usando dicas de pipeta C18 de troca de cás disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais).
    1. Posicione uma ponta de pipeta 10 L C18 (ponta de pipeta carregada com uma cama de mídia cromatografia C18 fixada no final) em uma pipeta de 10 μL e, em seguida, continue com o seguinte:
      1. Lave a ponta C18 com 50% de acetonitrila aquosa (10 μL) solução duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
      2. Equilibre a ponta C18 com uma solução aquosa de ácido trifluoroacético (0,1% TFA, 10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
      3. Remova manualmente a ponta C18 da pipeta e fixe-a em uma pipeta de 200 μL contendo uma ponta de pipeta P200 (a ponta C18 agora será anexada à ponta da pipeta P200).
      4. Mergulhe a ponta C18 na solução (passo 2.2.6), e aplaque a solução através da ponta C18 dez vezes.
        NOTA: A amostra de RNA fica ligada à resina de troca de cation dentro da ponta.
      5. Retire a ponta C18 da pipeta P200 e posicione-a sobre uma pipeta de 10 μL.
      6. Lave a ponta C18 usando uma solução aquosa de 0,1% TFA (10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
      7. Lave a ponta C18 com água sem RNase (10 μL) duas vezes. Descarte os volumes usados em um tubo de resíduo separado a cada vez.
  2. Coloque na placa MALDI seguindo os passos abaixo.
    1. Elute o oligonucleotídeo RNA da ponta C18 (passo 3.1.1.7) imergindo a amostra na matriz desejada (10 μL, solução 1:1 de C e D, Tabela 1), seguido pela distribuição da solução de volta para o tubo. Repita este processo dez vezes.
    2. Pipeta a solução de 3.2.1 em dois pontos separados na placa (1 μL cada, 20 pmol). Deixe as manchas secarem o ar (Figura 1A e Vídeo 1).
      NOTA: Este processo pode ser repetido no mesmo local para aumentar a concentração amostral em cada ponto.
    3. Pipeta desejava calibrante (1 L) em dois pontos separados fisicamente perto do local da amostra e permitia secar o ar.
      NOTA: O padrão de teste utilizado no presente estudo foi obtido a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
    4. Sobre-coloque o calibrante [totalmente seco] com a matriz desejada (1 L). Deixe secar o ar.
      NOTA: É importante rastrear a posição onde as amostras e calibrantes são detectados antes da inserção no instrumento. Anote isso usando o sistema de coordenadas da placa, por exemplo, a amostra 1 está localizada na posição (C,3)

4. Aquisição e processamento de dados

NOTA: Em geral, o THAP requer maior potência laser para alcançar a ionização. Além disso, os oligos podem ser difíceis de ionizar sem fragmentar. Assim, geralmente é necessário usar o menor poder laser possível e aumentar os ganhos do detector e/ou menor frequência de laser para maximizar a detecção e minimizar a fragmentação.

  1. Realize a aquisição de dados seguindo as etapas abaixo.
    NOTA: As medidas de peso molecular foram realizadas utilizando-se um espectrômetro de massa (ver Tabela de Materiais), em íon positivo, modo linear com tensão de origem íon de 20 kV, ganho de detector de ~2,8 kV, e uma frequência laser de 20 Hz. As faixas de varredura foram definidas com base no peso molecular esperado( s). Estes foram calculados e expressos em massa sobre carga (m/z), onde a carga foi de 1. A calibração externa foi realizada usando uma mistura de calibração proteica (Padrão de Teste Bacteriano, veja Tabela de Materiais), em um local adjacente à amostra. Os dados brutos foram então processados no software flexAnalysis (ver Tabela de materiais).
    1. Abra o "software Flexcontrol" para operação. Pressione o botão verde de dentro/para fora do instrumento, aguarde que o estágio alvo se mova e aspire para ventilar. Abra a tampa, coloque a placa alvo totalmente seca no instrumento. Certifique-se de alinhar na orientação certa (Figura 1B).
    2. Abaixe suavemente a tampa e pressione o botão verde de dentro/para fora . Aguarde que a placa seja retraída e o instrumento volte a bombear para baixo. Uma vez que a barra de status (canto inferior direito da janela de software) reflita 'Pronto', proceda com calibração.
    3. Para calibrar os instrumentos usando o software, realize o seguinte.
      1. Selecione o método desejado clicando no Método de seleção de arquivos > ou pressionando o botão Selecionar adjacente ao método carregado. Clique na Coordenada para o ponto calibrante. Navegue até a guia Calibração e confirme se o calibrador correto está selecionado. Certifique-se de que a caminhada aleatória está desatrada (na guia Portadora de amostras ).
      2. Pressione Start e direcione manualmente o laser ao longo de um cristal (clicando na seta do mouse no local desejado na visão da câmera). Ajuste a potência do laser, se necessário. Uma vez satisfeito com as configurações, pressione Comece a coletar espectros e adicione-os ao buffer de soma.
      3. Adicione espectros à soma até que a intensidade suficiente seja alcançada. Alterne para ver apenas o buffer de soma, subtraia a linha de base e suave. Em seguida, clique em Atribuir Automático. Verifique cada pico atribuído e observe o erro ppm. Se estiver satisfeito com atribuições e erros, clique em Aplicar.
      4. Limpe o buffer de soma e navegue até a posição da primeira amostra.
      5. Confirme o intervalo de varredura desejado (guia 'Detecção'). Ajuste as barras na "Faixa de Massa" para que a região verde represente a massa esperada(es).
      6. Clique diretamente na janela de ampliação para que as miras sejam orientadas para o fragmento cristalizado desejado (cristais maiores geralmente produzem os melhores resultados, Figura 2).
      7. Colete alguns espectros ao longo dos cristais grandes, ajustando a potência do laser conforme necessário. A configuração adequada é 5%-10% acima da potência em que os picos aparecem.
    4. Para obter espectros, realize o seguinte.
      1. Clique em Iniciar para observar o flash laser em conjunto com o aumento da intensidade espectral (mostrada na janela no canto superior direito). Mova o laser ao longo do comprimento do cristal clicando na seta do mouse para cima e para baixo do cristal (Vídeo 2).
      2. Clique em Adicionar diretamente abaixo Iniciar.
      3. Repita isso várias vezes até que a intensidade/número de tiros desejados seja atingida (refletida no eixo y da janela espectral)
      4. Ajuste a potência do laser e/ou velocidade e/ou detector ganhos se as varreduras iniciais forem insatisfatórias. Repetição de passos 4.1.4.1-4.1.4.3 conforme necessário.
      5. Se estiver satisfeito com o espectro, clique em Salvar Como salvar o espectro sob um nome especificado. Em seguida, se forem necessárias outras amostras, clique em Clear Sum e repita etapas sob a etapa 4.1.4.
  2. Executar o processamento de dados.
    NOTA: O passo 4.2 descreve uma maneira de analisar os dados usando o software flexAnalysis.
    1. Abra o software desejado. Em seguida, abra espectro (a) selecionando Arquivo. No menu suspenso, selecione Abrir.
    2. Uma nova janela será exibida. Clique em Procurar para localizar os arquivos salvos da etapa 4.1.4. Verifique as caixas para os arquivos desejados e clique em Abrir à esquerda. Se apenas um único espectro exigir análise, basta arrastar e soltar o arquivo na janela do software.
    3. Destaque o arquivo carregado para análise em massa. Navegue até a guia Processo na barra de ferramentas. Na linha de base do espectro de massa subtraída.
      NOTA: O algoritmo utilizado para a subtração será determinado pelo método selecionado na etapa 4.1.3.
    4. Navegue até a guia Processo na barra de ferramentas. No dropdown, selecione Smooth Mass Spectrum.
      NOTA: O algoritmo utilizado para a suavização será determinado pelo método selecionado na etapa 4.1.3.
    5. Clique na guia Lista de massas ; no dropdown, selecione Encontrar. Este comando rotula automaticamente picos com suas massas; uma lista das massas será exibida na tela à direita.
    6. Para adicionar ou excluir picos, prossiga para a guia Lista de massa . No dropdown, clique em Editar.
    7. Paire sobre o eixo x do espectro; uma linha vertical representa a localização do espectro onde o cursor está ligado.
      NOTA: Um ícone com um gráfico e um cursor aparecerá quando uma nova massa pode ser adicionada clicando. Este ícone aparecerá ao pairar sobre picos que podem ser excluídos clicando (ver etapa 4.2.7 em Arquivo Suplementar 1).
    8. Repetir as etapas 4.1.3-4.1.7 para espectros adicionais. Exporte a lista de massa para todos os espectros clicando e arrastando para destacar os arquivos à esquerda e execute a seguinte cascata de arquivos > exporte > lista de massa para Excel.
    9. Para exportar espectros como mostrado na tela, faça uma captura de tela ou exporte-a como um relatório. Para este último, navegue até o menu Relatório . No dropdown, selecione Salvar como PDF.
      NOTA: Pode-se alterar a forma como os espectros são exibidos usando as três guias abaixo do espectro e/ou variando os arquivos destacados. Uma tela vai aparecer. Nomeie o documento PDF conforme desejado, ajuste as configurações/layout e clique em Salvar para gerar uma imagem do espectro.
    10. A imagem gerada refletirá a visão espectral no programa de software. Para manipular a visão, execute o seguinte.
      1. Ampliação: Clique no botão Zoom In na barra de ferramentas.
      2. Passe o mouse sobre o eixo x e clique até que a faixa desejada seja alcançada.
      3. Zoom out/desfaz: Clique no botão Zoom Out e clique em qualquer lugar do espectro para retornar à visão completa.
        NOTA: Um auxílio ilustrativo para as etapas 4.1 e 4.2 pode ser encontrado nos Arquivos Suplementares 1 (pp S8-S23 e S24-S30, respectivamente).

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Resultados

Os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram sintetizados, caracterizados e quantificados antes do uso. A concentração de todos os oligonucleotídeos foi determinada através de espectroscopia UV-vis registrada a 90 °C para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A Figura 3 exibe os espectros do modelo oligonucleotídeos de RNA utilizados neste trabalho, tomados à temperatura ambiente e após a aplicação do calor.

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Discussão

O principal desafio nesse fluxo de trabalho surgiu entre finalizar os experimentos e realizar as análises espectrométricas em massa. Experimentos foram realizados e concluídos na Universidade do Colorado Denver e enviados (durante a noite) para as instalações da Universidade estadual do Colorado. A aquisição de dados foi realizada mediante recebimento, conforme conveniência. Várias circunstâncias inesperadas levaram a atrasos de tempo no processo. Em um caso, defeitos inesperados de instrumentos exigiram que as amostras ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

É importante ressaltar que este trabalho foi um esforço colaborativo entre três instituições, dois grupos de pesquisa e uma instalação central. A distribuição e a carga de trabalho foram realizadas da seguinte forma: Expressão proteica (Xrn-1) foi realizada na Universidade de Denver (Denver, CO). A síntese de oligonucleotídeos, quantificação e experimentação (principalmente degradação enzimática) foram conduzidas na Universidade do Colorado Denver (Denver, CO). Também foi realizada otimização lá. As manchas, aquisições e análises maldi-TOF foram realizadas no Centro de Recursos Analíticos da Universidade estadual do Colorado. (Fort Collins, CO). A SS gostaria de reconhecer um prêmio UROP Award (CU Denver) e bolsas Eureca (CU Denver) para apoio. E. G.C. reconhece o suporte da NIGMS, via R00GM115757. A MJER reconhece o suporte da NIGMS, via 1R15GM132816. K.B. reconhece iD de recursos: SCR_021758. O trabalho também foi apoiado por um Prêmio Professor-Acadêmico (MJER), TH-21-028, da Fundação Henry Dreyfus.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,6 mL MCT Graduado Violet FisherScientific05-408-127
6'-Trihidroxiacetofenona monohidratado 98%Sigma Aldrich480-66-0
Acetonitrila 99,9%, grau HPLCFisher Scientific75-05-8
Trifosfato de adenosina, 10mM New Englang BioscienceP0756S
Citrato de amônio, dibásico 98% Sigma Aldrich3012-65-5
Fluoreto de amônio 98,0%, grau ACSAlfa Aesar12125-01-8
Padrão de teste bacteriano BrukerDaltonics8255343
Fonte comercial de Xrn-1New England BioLabsM0338S
Dietil pirocarbonato, 97%ACROS OrganicsA0368487
análise Flex softwareBruker daltonicsFlexAnalysis software versão 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis espectrofotômetroPerkin Elmer
Placa MALDI: MSP 96 alvo de aço retificadoBruker Daltonics280799
Espectrômetro de massaBrukerMicroflex LRFTOF espectrômetro de massa (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000Milipore SigmaUm sistema Mili-Q foi usado para purificar toda a água usada neste trabalho
Dispositivos centrífugos Nanosep com membrana OmegaTM 10 K, meio filtrante azul (24/pkg)Pall CorporationOD010C33tamanho de poro Omega (polietersulfona modificada) 10 K
NEBuffer 3New England BiolabsB7003SEsta é a solução B
Ferramenta de analisador de oligoIDT-DNAhttps://www.idtdna.com/calc/analyzer
Ponteiras de pipeta P10Fisher Scientific02-707-441
Ponteiras de pipeta P200Fisher Scientific02-707-419
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11
T4 Polinucleotídeo quinaseNew England BioLabsM0201S
T4 Polinucleotídeo quinase Reação BufferNovo Inglaterra BioLabsB0201SEsta é a solução A
Ácido TriflouroacéticoAlfa Aesar76-05-1
Xrn-1 exoribonucleaseExpresso em casaVeja ref. 20
Pontas de Pipeta ZipTip para preparação de amostrasMilliporeZTC 18S 09610 µ L carregadas com um padrão C18 0,6 µ Cama em L
,

Referências

  1. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  2. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  3. Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73(2003).
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  5. Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
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