MALDI-TOF foi utilizado para caracterizar fragmentos obtidos a partir da reatividade entre o RNA oxidado e o exoribonuclease Xrn-1. O presente protocolo descreve uma metodologia que pode ser aplicada a outros processos envolvendo RNA e/ou DNA.
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Artigo de método
Identificação de fragmentos de RNA resultantes da degradação enzimática usando espectrometria de massa MALDI-TOF
Neste artigo
Resumo
Resumo
O RNA é um biopolímero presente em todos os domínios da vida, e suas interações com outras moléculas e/ou espécies reativas, por exemplo, DNA, proteínas, íons, drogas e radicais livres, são onipresentes. Como resultado, o RNA sofre várias reações que incluem seu decote, degradação ou modificação, levando a espécies biologicamente relevantes com funções e implicações distintas. Um exemplo é a oxidação da guanina para 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que pode ocorrer na presença de espécies reativas de oxigênio (ROS). No geral, procedimentos que caracterizam tais produtos e transformações são em grande parte valiosos para a comunidade científica. Para isso, a espectrometria de massa de desorpização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF) é um método amplamente utilizado. O presente protocolo descreve como caracterizar fragmentos de RNA formados após o tratamento enzimático. O modelo escolhido usa uma reação entre o RNA e o exoribonuclease Xrn-1, onde a digestão enzimática é interrompida em locais oxidados. Duas sequências de RNA longa de 20 nucleotídeos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] e [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] foram obtidas através de síntese de fase sólida, quantificado por espectroscopia UV-vis, e caracterizado via MALDI-TOF. Os fios obtidos foram então (1) 5'-fosforilados e caracterizados via MALDI-TOF; (2) tratado com Xrn-1; (3) filtrado e desálhado; (4) analisado via MALDI-TOF. Esta configuração experimental levou à identificação inequívoca dos fragmentos associados à paralisação de Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], e [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Os experimentos descritos foram realizados com 200 picomols de RNA (20 pmol utilizados para análises MALDI); no entanto, quantidades mais baixas podem resultar em picos detectáveis com espectrômetros usando fontes laser com mais potência do que a usada neste trabalho. É importante ressaltar que a metodologia descrita pode ser generalizada e potencialmente estendida à identificação do produto para outros processos envolvendo RNA e DNA, podendo auxiliar na caracterização/elucidação de outras vias bioquímicas.
Introdução
MALDI-TOF 1,2,3 é uma técnica amplamente utilizada para a caracterização e/ou detecção de moléculas de tamanhos e características variados. Alguns de seus usos incluem diversas aplicações como a detecção de taninos a partir de recursos naturais4, metabólitos por imagem em alimentos5, descoberta ou monitoramento de alvos ou marcadores de drogas celulares6, e diagnóstico clínico7, para citar alguns. De relevância para o presente trabalho é o uso de MALDI-TOF com DNA ou RNA, com seu u....
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Protocolo
A água ultra pura sem rnase (Tabela 1) foi utilizada para o presente estudo.
1. Determinação de concentração da solução RNA
- Prepare a amostra de RNA seguindo os passos abaixo.
- Use um tubo de microcentrifuge (0,6 mL) para preparar uma solução de RNA diluindo 1 μL de solução de estoque (obtida através de síntese em fase sólida)19 em 159 μL de H2O. Livre de RNase misture a solução pipetando a mistura para cima e para baixo repetidamente (10x).
NOTA: Uma vez que uma ampla gama de cuvetas estão disponíveis comercialmente, os volumes necessários pod....
- Use um tubo de microcentrifuge (0,6 mL) para preparar uma solução de RNA diluindo 1 μL de solução de estoque (obtida através de síntese em fase sólida)19 em 159 μL de H2O. Livre de RNase misture a solução pipetando a mistura para cima e para baixo repetidamente (10x).
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Resultados
Os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram sintetizados, caracterizados e quantificados antes do uso. A concentração de todos os oligonucleotídeos foi determinada através de espectroscopia UV-vis registrada a 90 °C para evitar leituras errôneas decorrentes da formação potencial das estruturas secundárias. A Figura 3 exibe os espectros do modelo oligonucleotídeos de RNA utilizados neste trabalho, tomados à temperatura ambiente e após a aplicação do calor.
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Discussão
O principal desafio nesse fluxo de trabalho surgiu entre finalizar os experimentos e realizar as análises espectrométricas em massa. Experimentos foram realizados e concluídos na Universidade do Colorado Denver e enviados (durante a noite) para as instalações da Universidade estadual do Colorado. A aquisição de dados foi realizada mediante recebimento, conforme conveniência. Várias circunstâncias inesperadas levaram a atrasos de tempo no processo. Em um caso, defeitos inesperados de instrumentos exigiram que as amostras .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
É importante ressaltar que este trabalho foi um esforço colaborativo entre três instituições, dois grupos de pesquisa e uma instalação central. A distribuição e a carga de trabalho foram realizadas da seguinte forma: Expressão proteica (Xrn-1) foi realizada na Universidade de Denver (Denver, CO). A síntese de oligonucleotídeos, quantificação e experimentação (principalmente degradação enzimática) foram conduzidas na Universidade do Colorado Denver (Denver, CO). Também foi realizada otimização lá. As manchas, aquisições e análises maldi-TOF foram realizadas no Centro de Recursos Analíticos da Universidade estadual do Colorado. (Fort Collins, CO). A SS gostaria de recon....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,6 mL MCT Graduado Violet Fisher | Scientific | 05-408-127 | |
| 6'-Trihidroxiacetofenona monohidratado 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrila 99,9%, grau HPLC | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Trifosfato de adenosina, 10 | mM New Englang Bioscience | P0756S | |
| Citrato de amônio, dibásico 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Fluoreto de amônio 98,0%, grau ACS | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Padrão de teste bacteriano Bruker | Daltonics | 8255343 | |
| Fonte comercial de Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Dietil pirocarbonato, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| análise Flex software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software versão 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis espectrofotômetro | Perkin Elmer | ||
| Placa MALDI: MSP 96 alvo de aço retificado | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Espectrômetro de massa | Bruker | Microflex LRFTOF espectrômetro de massa (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | Um sistema Mili-Q foi usado para purificar toda a água usada neste trabalho | |
| Dispositivos centrífugos Nanosep com membrana OmegaTM 10 K, meio filtrante azul (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | tamanho de poro Omega (polietersulfona modificada) 10 K |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | Esta é a solução B |
| Ferramenta de analisador de oligo | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Ponteiras de pipeta P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Ponteiras de pipeta P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polinucleotídeo quinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polinucleotídeo quinase Reação Buffer | Novo Inglaterra BioLabs | B0201S | Esta é a solução A |
| Ácido Triflouroacético | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expresso em casa | Veja ref. 20 | |
| Pontas de Pipeta ZipTip para preparação de amostras | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µ L carregadas com um padrão C18 0,6 µ Cama em L |
Referências
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F.
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Reimpressões e permissões
