Shotgun Lipidômica de Tecidos de Roedores

A fumaça do cigarro (SC) é reconhecida como um dos principais fatores de risco associados ao desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas do pulmão, incluindo carcinoma pulmonar, bronquite e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)¹. Além do impacto pulmonar, a exposição ao SC desempenha um papel significativo no desenvolvimento de outras doenças, como a doença arterial coronariana aterosclerótica e a doença vascular^periférica1. As doenças cardiovasculares, juntamente com a DPOC, são a primeira e a terceira causas de morte no mundo, respectivamente. As abordagens de avaliação de risco toxicológico têm historicamente se baseado no uso de modelos animais, como roedores. Modelos in vivo de ratos e camundongos de nariz ou corpo inteiro são comumente usados para estudar os efeitos a longo prazo da exposição ao SC.

Por exemplo, geralmente, 6 meses de exposição à fumaça induzem anormalidades histológicas e funcionais nos pulmões murinos que mimetizam as da doença humana, incluindo enfisema, remodelamento das vias aéreas e hipertensão pulmonar, embora as alterações sejam relativamente leves em comparação com aquelas observadas em fumantes humanos de longa duração². Em tecidos animais e humanos, estudos têm observado uma ampla gama de alterações moleculares em resposta à exposição ao SC, incluindo respostas ao estresse oxidativo, inflamação e alterações estruturais teciduais ^3,4. Não surpreendentemente, a exposição ao SC também tem sido relatada como tendo um impacto de longo alcance sobre o lipidoma pulmonar, incluindo efeitos sobre os lipídios surfactantes, mediadores de sinalização lipídica e lipídios estruturais ^4,5,6.

Para caracterizar as alterações lipídicas volumosas induzidas pela exposição a longo prazo do SC de pulmões de camundongos, realizamos uma análise rápida e quantitativa por espectrometria de massa com infusão direta de espingarda. Após a introdução do método lipidômico shotgun em 20057, esse método tem sido efetivamente utilizado para ampliar nosso conhecimento sobre o metabolismo celular lipídico8,9,10 em sistemas modelo como levedura 11, Caenorhabditis elegans 12 e Drosophila melanogaster¹³, bem como em uma ampla gama de tipos de amostras de mamíferos como linhagens celulares ^{14, 15,16} vários tecidos humanos^17,18 e roedores^19,20 e fluidos corpóreos^21,22.

Nas últimas décadas, estudos têm revelado a complexidade das respostas celulares às mudanças ambientais, envolvendo milhares de proteínas, lipídios e metabólitos interconectados. Isso deixou claro que o uso de técnicas analíticas de última geração é essencial para obter uma visão aprofundada das máquinas moleculares e para descobrir toda a magnitude dos impactos fisiológicos exógenos. Nesse contexto, as impressões digitais lipídicas quantitativas e abrangentes produzidas por abordagens lipidômicas shotgun podem efetivamente agregar ao nosso conhecimento sobre o metabolismo celular lipídico 8,9,10.

Considerando a exposição ao SC como fator de risco para diversas doenças, as abordagens de avaliação de risco toxicológico têm historicamente se baseado no uso de modelos animais, como roedores. Shotgun lipidomics MS fornece uma ferramenta analítica rápida, sensível e quantitativa para avaliar a perturbação do lipidoma em vários tipos de amostras. A característica única da lipidômica shotgun é a análise automatizada por injeção direta de um extrato lipídico total - cravado com padrões internos marcados - sem separação cromatográfica em um instrumento MS de alta resolução usando um nanochip condutor gerando um nanospray de ionização por eletrospray (ESI)²³.

A informação da relação massa/carga que é adquirida simultaneamente no modo MS1 fornece a pegada lipídica total de todos os lipídios endógenos intactos. Opcionalmente, o modo MS2/MS3, no qual as moléculas lipídicas de origem são fragmentadas e analisadas, fornece informações estruturais adicionais. A análise de dados requer software especializado e inclui a deconvolução de espectros e atribuições de picos em espectros agrupados que levam à identificação de lipídios e elucidação de estruturas químicas putativas. Além disso, a quantificação absoluta pode ser realizada através de uma mistura de padrões internos rotulados contendo pelo menos um padrão lipídico por classe lipídica de interesse. De modo geral, com a presente técnica, a análise da EM com poucos minutos por amostra pode abranger a identificação e quantificação de até 800 lipídios de 14 classes^lipídicas24 em tecidos de roedores.

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados em uma instalação credenciada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International e licenciada pela Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore, com aprovação de um Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e em conformidade com o National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NACLAR, 2004).

1. Coleta de amostras

1. Realizar dissecções pulmonares de camundongos após 3 meses e 6 meses de exposição de camundongos ^ApoE−/− . Coletar os tecidos 16-24 h após a exposição, congelá-los rapidamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C antes de iniciar o fluxo de trabalho lipidômico. Garantir a coleta de um total de nove amostras de cada grupo de dissecção "ômica".

2. Tecido - pulverização das amostras

1. Prepare o martelo magnético e consumíveis para moagem de tecidos. Pré-resfriar bolsas de tecido, pinças, tubos de transferência de tecido tampados com tampas, espátula plástica em "V" e tubos de coleta de plástico de 2 mL sobre gelo seco. Instale o suporte de tubo correspondente em um instrumento de martelo magnético. Ligue o martelo magnético e ajuste a potência de impacto para Alta.
2. Coloque a amostra em uma bolsa de tecido; Insira a amostra através da abertura superior da bolsa de tecido usando pinças pré-resfriadas, se necessário. Coloque a amostra no centro da bolsa flexível, longe das bordas.
3. Sele a bolsa de tecido rosqueando um tubo de coleta pré-resfriado na parte superior da bolsa de tecido.
4. Congele rapidamente a amostra imergindo a bolsa flexível em nitrogênio líquido por 10 s.
5. Ventilar o tubo de coleta; Solte o tubo por um giro de 1/4 para ventilação para evitar romper a bolsa quando o martelo magnético bater.
6. Coloque a bolsa de tecido congelado no martelo magnético.
7. Aplique o martelo magnético pressionando o botão de ativação para pulverizar a amostra. Se pedaços de tecido não pulverizados permanecerem na bolsa, congele a amostra em nitrogênio líquido novamente e repita para um segundo impacto.
8. Retire a bolsa de tecido do martelo magnético, mantendo a amostra pulverizada no fundo. Para evitar que a amostra derreta, congele-a novamente imediatamente.
9. Transfira a amostra para um tubo de coleta. Inverta rapidamente o tubo para que a bolsa de tecido fique na parte superior e toque na bolsa para transferir as partículas de tecido para o fundo do tubo de coleta.
   NOTA: Esta etapa deve ser feita rapidamente para evitar o derretimento do tecido.
10. Transfira uma alíquota tecidual de 10 mg para um tubo de 2 ml para uma análise lipidómica adicional e armazene a amostra a -80 °C até que sejam realizadas novas etapas.

3. Homogeneização tecidual

1. Ligue o instrumento lisador de tecido e ajuste a frequência de agitação em 30 Hz e a duração de agitação em 2 min. Preparar a solução tampão de homogeneização do tecido: bicarbonato de amónio 150 mM em água, com um pH de ~8,2.
2. Retire as amostras do congelador de armazenamento, coloque no gelo e adicione quatro esferas de aço inoxidável nos tubos contendo o pó de tecido. Adicionar 0,5 ml de tampão bicarbonato de amónio 150 mM a cada amostra.
3. Coloque os tubos de amostra nos suportes do lisor de tecido. Contrabalançar ambos os suportes com o mesmo número de tubos. Fixe os suportes no braço de retenção do lisor de tecido. Interrompa o tecido.
4. Coloque os tubos sobre gelo e verifique visualmente se não há sobras de agregados de tecido no tubo. Se a ruptura tecidual estiver incompleta (agregados são vistos), repita o processo de interrupção realizando outro ciclo de tratamento. Coloque as amostras no gelo.
5. Criar uma alíquota 1 de 100 μL da amostra em um tubo de 1,5 mL dedicado à determinação de proteínas. Centrifugar a 18.200 × g por 5 min a 10 °C.
6. Determinar o teor de proteínas da alíquota 1 através do ensaio de Bradford (ver secção 4). Armazenar as amostras no gelo.
7. Criar uma alíquota 2 de 20-100 μL do homogeneizado de reserva num novo microtubo de 2 ml para extracção de lípidos (ver secção 5). Se as amostras não forem imediatamente analisadas, mantenha-as no gelo até que a extração seja realizada.
   NOTA: O volume final de extracção deve ser definido com base na quantidade total de proteínas. Deve estar na faixa de 0,015-0,045 mg de proteína por alíquota total.

4. Ensaio de determinação da proteína de Bradford

NOTA: As amostras dos estudos devem ser randomizadas antes do início da análise, e a randomização é respeitada para todas as etapas do processamento da amostra.

1. Alíquota centrifugada diluída 1 sobrenadante 2x com tampão bicarbonato de amónio.
   NOTA: O fator de diluição depende da concentração do homogeneizado de tecido. Para soluções mais concentradas, aplicar um fator mais alto para que a concentração determinada caia na faixa dinâmica do ensaio.
2. Preparar uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA) de acordo com a Tabela 1. Vórtice os tubos padrão. Centrifugar os tubos a 18.200 × g por 15 s à temperatura ambiente.
3. Dos tubos padrão previamente preparados, transfira 6 μL de cada um dos espaços em branco e padrões para uma placa de fundo plano de 96 poços de acordo com o layout da placa mostrado na Figura 1.
4. Transfira as amostras previamente preparadas para a placa de fundo plano de 96 poços de acordo com a disposição da placa descrita na Figura 1.
5. Adicione 250 μL do Reagente Bradford a cada poço usando uma pipeta multicanal e misture. Incubar por 5 min.
6. Meça a absorbância a um comprimento de onda de 595 nm usando um leitor de placas.
7. Calcular as concentrações de proteínas nas alíquotas com base na curva padrão.
   NOTA: O factor de diluição utilizado no início do procedimento deve ser considerado no cálculo das concentrações de proteínas.

5. Extração de BUME

NOTA: Evite o uso de tubos plásticos de baixa ligação para extração lipidômica, uma vez que os solventes orgânicos fortes liberam plastificantes e criam um fundo forte durante a análise da amostra.

1. Preparar tubos de 1,5 mL com 100 μL de solução de bicarbonato de amônio em cada tubo das amostras em branco total (TB), branco padrão interno (ISB) e controle de qualidade (QC), considerando que 1 amostra de CQ é colocada entre cada conjunto de 10 amostras. Mantenha todas as amostras no gelo.
2. Adicionar 10 μL de pool de plasma humano a todas as amostras de CQ. Spike 10 μL de solução padrão interna em todas as amostras ISB, QC e estudo (ou seja, todas as amostras, exceto TB).
   NOTA: Para material de controle de qualidade, use qualquer plasma K₂EDTA disponível comercialmente em pool. Quantificar a concentração lipídica no plasma agrupado usando o protocolo mencionado após o recebimento e manter esses intervalos como referências para todas as análises em que o material de CQ é usado. Use o plasma NIST apenas para aplicações mais direcionadas ou para verificação de método global, onde a precisão do ensaio precisa ser abordada.
3. Adicionar 300 μL de mistura -20 °C butanol/metanol (3/1, v/v) a cada amostra. Agitar a 450 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente no termomisturador.
4. Adicionar 300 μL da mistura heptano/acetato de etilo (3/1, v/v). Agitar a 450 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente no misturador.
5. Adicionar 300 μL da mistura de ácido acético a 1%. Agitar durante 5 min a 450 × g à temperatura ambiente no termomisturador. Centrifugar a 2.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Transferir 360 μL da fase superior para um novo tubo autoblocante de 2 mL 2.
   NOTA: A extração líquido-líquido pode resultar na mudança de posições do limite de fase de uma maneira dependente da amostra, o que pode resultar em uma pequena discrepância de volume para a fase superior. Ajuste o volume de coleta para a fase superior, se necessário.
6. Adicionar 320 μL de heptano/acetato de etila (3/1, v/v) ao tubo de fase aquosa 1. Agitar a 450 × g durante 5 min à temperatura ambiente no misturador. Centrifugar a 2.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Transferir 320 μL da fase superior e combinar com a fracção do passo 5.11.
   NOTA: Ajuste o volume de coleta para a fase superior, se necessário.
7. Adicionar 250 μL de heptano/acetato de etilo (3/1, v/v) à fase aquosa no tubo 1. Agitar a 450 × g durante 5 min à temperatura ambiente no termomisturador. Centrifugar a 2.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Transferir 200 μL da fase superior e combinar com as frações do passo 5.11 e do passo 5.15 no tubo 2.
   NOTA: Ajuste o volume de coleta para a fase superior, se necessário.
8. Evaporar até à secura a 35 °C num concentrador a vácuo.
   NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a -20 °C até à análise, se necessário.
9. Redissolver em 300 μL de solução de mistura MS (acetato de amónio 7,5 mM em solução de isopropanol/metanol/clorofórmio, solução 4:2:1). Vórtice cada tubo por 5 s para garantir que tudo seja dissolvido. Centrifugar a 18.200 × g por 5 min a 4 °C.
10. Transfira uma alíquota de 50 μL para a placa de microlitro de acordo com o layout da placa na Figura 2 para análise do modo de ionização positiva (colunas 1-6) e dilua com 50 μL da solução de mistura MS.
11. Transferir uma alíquota de 20 μL para a placa MTP de acordo com o layout da placa na Figura 2 para análise do modo de ionização negativa (colunas 7-12) e diluir com 80 μL de mistura MS. Embrulhe a placa com papel alumínio e mantenha a 4 °C antes da análise.

6. Análise da EM

1. Calibrar um espectrômetro de massa (MS) nos modos positivo e negativo de acordo com as instruções do fabricante 5 dias ou menos antes da análise.
2. Instale a nanofonte de infusão direta antecipadamente, garantindo que ela esteja devidamente alinhada contra o capilar de transferência do MS. Instale um chip de bico de 4,1 μm no suporte do chip e configure-o no software.
3. Use os seguintes parâmetros para a configuração do método de modo positivo e negativo: pressão de gás de 1,25 psi; tensão de fonte de 1,1 kV; 5 μL de volume de injeção da amostra; fechamento de contato de saída Rel1 para 2,5 s; 5 min de prazo de entrega; resfriamento da placa a 4 °C.
4. Configure a fila de sequência de análise para o robô de infusão direta no modo positivo.
5. Configure o método MS para o modo positivo usando as seguintes configurações do MS:
   1. Ajuste a temperatura capilar em 250 °C e o nível de RF da lente S em 65,0. Realize a aquisição de MS de varredura completa de 0 a 1 min na faixa de 550-1000 m/z com resolução de 140.000 com controle de ganho automatizado de 1 ×10⁶ e tempo máximo de injeção de 50 ms. Aplique a massa de bloqueio de 680,48022.
   2. Defina o método de aquisição MS/MS independente de dados entre o intervalo de tempo de 1 e 5 min com resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 250 m/z. Use um controle de ganho automatizado para MS2 em 1 × 10⁵ e tempo máximo de injeção de 64 ms, uma energia de colisão de 20 NCE e uma janela de isolamento de 1 m/z. Use a lista de massa de inclusão de 550 a 1.000 m/z, com um passo de massa de 1 Da.
6. Para a aquisição em modo negativo, ajuste a temperatura capilar em 250 °C e o nível de RF do S-Lens em 65,0 no arquivo de ajuste MS.
   1. Use as seguintes configurações do método MS: modo de aquisição de varredura completa de 0 a 1 min com resolução de 140.000 cobrindo a faixa de 400-940 m/z, controle de ganho automatizado de 1 × 10⁶; tempo máximo de injeção de 50 ms; Use uma massa de bloqueio de 529,46262.
   2. Ajuste a aquisição do MS2 no modo DIA entre 1 e 5 min da corrida a uma resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 150 m/z; controle de ganho automatizado de 1 × 10⁵; 64 ms de tempo máximo de injeção; e 35NCE de energia de colisão. Use a lista de massa de inclusão de 400 a 940 com um passo de massa de 1 Da.
7. Crie a fila de sequência de análise no software MS no modo positivo . Aguarde que a aquisição da amostra seja acionada por um sinal de fechamento de contato proveniente do robô de infusão direta para cada amostra.
8. Quando a análise do modo positivo estiver concluída, crie a fila de sequência para o robô de infusão direta no modo negativo .
9. Configure a fila de sequência de análise no software MS no modo negativo .

7. Processamento de dados

1. Para converter os arquivos de dados dos modos positivo e negativo do formato .raw para o formato .mzML, use o software conversor.
   NOTA: Os arquivos de dados dos modos positivo e negativo devem ser convertidos separadamente (devido às suas diferentes configurações de aquisição e diferentes limites de ruído).
   1. Preencha as seguintes configurações para executar a conversão de arquivos: o fator de limite de ruído é 3 e 5 para MS e MS2, respectivamente; ativar a função de remoção de ruído para MS e MS2, compactação de dados, varreduras médias MS2 e coleta de pico. Definir limiares de TIC para modos positivo e negativo (por exemplo, 10.000 e 5.000; a serem definidos com base no nível de ruído da amostra específica produzida por um instrumento específico). Gere relatórios XLC e PDF ao final do processamento.
2. Realizar a identificação lipídica. Defina os seguintes parâmetros (exemplo) de configurações de importação de arquivos : janela de seleção ±0,5 Da (depende da janela de seleção no método MS); intervalo de tempo 2-300 s (depende do tempo de varredura no método MS); ausência de massas de calibração para MS e MS2; transferir e arredondar a faixa de massa dos arquivos de metadados do software Peak by Peak (massa mínima [MS]) e ( massa mínima [MS2]); tolerância de 3 ppm e 10 ppm para SM e MS2, respectivamente; manter vazio o campo de limite MS e MS2 , filtro de frequência, deslocamento MS1 e PMO; Correção isotópica para SM e MS2 selecionadas; gradiente de resolução de transferência do arquivo de metadados do conversor como (Ajuste linear de resolução [MS]) e como (Ajuste linear de resolução [MS2]).
   NOTA: A identificação lipídica nos modos positivo e negativo deve ser realizada separadamente devido às suas diferentes configurações de aquisição.
3. Depois que os dados forem importados, vá para o menu Executar e carregue os arquivos MFQL para identificação lipídica.
   NOTA: Para informações detalhadas sobre a estrutura dos QVFM, consultar a publicação de Herzog et ^al.25. Veja alguns exemplos de arquivos MFQL no https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library e veja a discussão. Todas as MFQLs usadas para o processamento de dados são fornecidas nos Materiais Suplementares.
4. Quantificar as espécies identificadas no nível de MS dividindo a intensidade de massa precursora da característica lipídica pela respectiva intensidade do padrão interno marcado e, em seguida, multiplicando o quociente pela concentração do padrão interno marcado. Normalizar a concentração lipídica final por quantidade de proteína total medida pelo ensaio de Bradford.

8. Procedimento de verificação do CQ

NOTA: Um procedimento de verificação de qualidade é uma etapa essencial para verificar a reprodutibilidade técnica do método. Para este fim, um pool de plasma comercial é analisado para determinar os níveis endógenos de diferentes lipídios ao longo de 5 dias em 15 alíquotas idênticas por lote (total de cinco lotes). Note que, neste caso, um pipeline de avaliação de dados foi criado como uma aplicação web Shiny usando o ambiente de software estatístico R.

1. Defina o intervalo de aceitação de referência como o valor médio calculado para todos os cinco lotes ±3 desvios padrão.
2. Aplicar as regras de aceitação "pass" para cada lote analítico: 90% dos alvos de referência devem passar, considerando que um composto de referência representa uma classe lipídica. Por exemplo, se 15 destinos de referência forem incluídos na verificação de CQ, certifique-se de que 13 destinos passem para que o lote seja aceito.
   NOTA: Em outras palavras, 68% das amostras de CQ por composto de referência devem passar para que os dados dessa classe lipídica sejam aceitos.
3. Se o lote do estudo não cumprir os critérios de aceitação para a verificação do CQ, repita o procedimento.

9. Estimativa da quantidade (relativa) de ácidos graxos conjugados

1. Para cada classe lipídica, estimar as quantidades de ácidos graxos conjugados com base em suas intensidades MS2.
   NOTA: Devido a diferenças de fragmentação e ionização, os valores derivados foram destinados apenas para comparações de abundância relativa entre grupos de amostra, em vez de, por exemplo, estimar a contribuição relativa de um ácido graxo específico para o pool geral de ácidos graxos conjugados de uma classe lipídica.
2. Normalizar as intensidades MS2 dos fragmentos de ácidos graxos pela intensidade média dos fragmentos de ácidos graxos do padrão interno correspondente. Com base na concentração do padrão interno e no peso tecidual medido, deriva-se uma "concentração normalizada" para os ácidos graxos conjugados. Somar esses valores por classe lipídica para estimar a quantidade total de cada ácido graxo conjugado por amostra.

10. Análise estatística

1. Realizar análise estatística. Ajuste um modelo linear para cada condição e o grupo de controle correspondente e calcule valores de p a partir de uma estatística t para dados transformados em log2. Use o método de taxa de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg para corrigir vários efeitos de teste.
   OBS: Lipídios com valores de p ajustados < 0,05 são considerados diferencialmente abundantes. Aqui, a análise estatística foi realizada no ambiente estatístico^R26.

Aqui, como resultados representativos, apresentamos dados que ilustram como a lipidômica shotgun pode ser usada para estudar os efeitos da SC nos pulmões de camundongos. O protocolo de análise lipídica shotgun foi aplicado com sucesso em um estudo in vivo para análise comparativa de dois grupos de amostras: tecidos pulmonares dissecados de nove camundongos fêmeas de Apoe−/− expostos ao SC (grupo 3R4F; controle positivo) e igual número de camundongos mantidos sob condições de ar fresco (grupo sham) como controle negativo coletado aos 3 meses, 4 meses e 6 meses de tempo de exposição. Os animais foram mantidos sob ar fresco filtrado e condicionado a 22 °C ± temperatura de 2 °C e umidade de 55% ± 15% e alimentados com dieta pellet irradiada por gama. O regime de luz foi mantido em 12 h por dia. Até oito camundongos foram alojados por cada gaiola. Os cigarros de referência 3R4F para o tratamento de exposição foram adquiridos da Universidade de Kentucky para gerar o aerossol 3R4F CS (600 μg de material particulado total TPM/L aerossol) para uma concentração-alvo de exposição equivalente a 28 μg de nicotina/L.CS fumaça de cigarros 3R4F foi produzida usando máquinas rotativas de 30 portas, de acordo com Phillips et al.27 . Com base no Health Canada Intensive Smoking Protocol, 55 mL de volume de sopro, um sopro por 30 s e 100% de bloqueio dos orifícios de ventilação foram aplicados aos cigarros 3R4F para proporcionar exposição suficiente. Todos os detalhes adicionais sobre o desenho do estudo foram relatados anteriormente27,28.

No total, ~400 espécies de lipídios moleculares das 14 classes lipídicas mais abundantes foram identificadas e quantificadas (Figura 3). A concentração total normalizada de lipídios por classe foi ligeiramente elevada para as classes lipídicas PE, PEO, PC, PCO, PI e PG, e alguma downregulation foi observada para os lipídios SM, LPE e PA (Figura 3A), enquanto nenhuma diferença pôde ser observada para TAGs e PS. Curiosamente, níveis elevados de lipídios plasmologênicos de PCO e PEO no grupo CS foram relatados em células inflamatórias29 . Uma das funções intracelulares dos lipídios plasmalogênicos é a atividade antioxidante. Sob exposição a espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS), oxidação seletiva de plasmalogênios em comparação com diacilfosfolipídios foi relatada30. A ligação éter-enila na estrutura química dos plasmalogênios é sensível ao ataque de radicais ao estresse oxidativo31. Os principais produtos de ataque radical são os ácidos eicosatetraenóicos hidroxilados, fosfolipídios 2-monoacilglicerol, pentadecanol, ácidos fórmicos, α-hidroxialdeídos de vários comprimentos de cadeia, 1-formil-2-aracdonilglicerofosfolipídeo e lisofosfolipídios.

Esses resultados mostram que, dentre as características moleculares baseadas na fórmula molecular total, 100-120 compostos foram significativamente impactados pela exposição ao SC (Figura 3D). A deconvolução detalhada das informações de fragmentação do MS2 e a normalização das intensidades de sinal dos fragmentos permitiram a definição aproximada da quantidade total de cada ácido graxo conjugado (AG) representado em cada classe lipídica (Figura 3E) e a comparação desses dados entre os grupos exposto e controle. Observou-se uma clara diminuição tanto nos AGs totalmente saturados quanto naqueles com apenas algumas insaturações, principalmente no contexto de lisolipídios. Em contraste, os ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) na composição das classes de fosfolipídios PC, PE e PG estavam elevados no grupo CS para todos os momentos. Os casos extremos de PC e PG conjugados com ácido eicosapentanóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA) foram detectados exclusivamente no grupo de exposição 3R4F CS (Figura 3E, cor vermelha).

Figura 1: Disposição da placa para distribuição da amostra no ensaio de Bradford. As amostras em branco e padrão são colocadas em triplicata nas colunas 1-3; amostras desconhecidas são colocadas em duplicado nas colunas 4-11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Disposição da placa de microtitulação de 96 poços para análise por espectrometria de massa de espingarda. A distribuição das amostras em branco, padrão, desconhecida e CQ para aquisição no modo de ionização positiva é mapeada no lado esquerdo da placa (colunas 1-6); Todas as amostras para o modo de ionização negativa são colocadas à direita (colunas 7-12). Abreviações: pos = positivo; CQ = controle de qualidade; neg = negativo; TB = total em branco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise lipidômica de pulmões de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Camundongos Apoe−/− foram expostos ao SC do cigarro de referência 3R4F ou ao ar fresco (sham). (A) Concentrações de classes lipídicas e número de espécies lipídicas por classe. Para cada classe, o número de espécies lipídicas quantificadas é dado entre parênteses. Intervalos de confiança médios e de 95% para cada classe lipídica, separadamente para cada tipo de exposição (agregados em três momentos). (B) Gráficos vulcânicos mostrando o tamanho do efeito (mudança log2 dobra) e a significância (valor p ajustado por FDR -log10) das espécies lipídicas quantificadas para a comparação 3R4F CS versus sham nos três momentos. Lipídios significativamente elevados são marcados em amarelo; lipídios significativamente diminuídos são marcados no ciano (valor de p ajustado por FDR < 0,05). (C) Abundância diferencial das 25 espécies lipídicas com as maiores alterações de dobras médias absolutas. As alterações de dobras log2 para a comparação 3R4F CS versus sham são codificadas por cores, e a significância estatística é indicada: *: valor de p ajustado por FDR < 0,01; X: Valor de p ajustado por FDR < 0,05. (D) Gráficos de comparação. Os coeficientes de correlação para as comparações de mudança de dobra são codificados por cores, e o número de lipídios diferencialmente abundantes compartilhados é indicado (números totais nas margens). Os gráficos de pizza mostram a porcentagem de lipídios diferencialmente abundantes compartilhados com a mesma direção de mudança (sinal de CF). Asterisk indica uma sobreposição significativa dos lipídios diferencialmente abundantes. (E) Abundância diferencial de AGs conjugados por classe lipídica. Mapa de calor como no painel C para ácidos graxos conjugados com diferenças significativas de abundância entre 3R4F e exposição simulada em todos os três momentos (valor de p ajustado por FDR < 0,05). A quantidade de cada ácido graxo por classe lipídica foi estimada com base nas intensidades de SM2 dos fragmentos de ácidos graxos. Abreviações: CS = fumaça de cigarro; FDR = taxa de descoberta falsa; CF = mudança de dobra; AF = ácidos graxos; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; TAG = triacilglicerol; SM = esfingomielina; PEO = fosfatidiletanolamina plasmalogênica; PE = fosfatidiletanolamina; PG = fosfatidil glicerol; IP = fosfatidilinositol; DAG = diacilglicerol; SE = esterol/ésteres de colesterol; PCO = fosfatidilcolina plasmalogen; LPC = fosfatidilcolina liso; LPE = liso fosfatidiletanolamina; PA = ácido fosfatídico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Esquema de diluição do padrão interno BSA para a curva de calibração do ensaio de Bradford. Abreviação: BSA = albumina de soro bovino.

Informações suplementares: arquivos MFQL usados para identificação lipídica LipidXplorer. O pacote .zip consiste nos arquivos MFQL individuais necessários, cada um nomeado seguindo este padrão: __MS2.mfql (por exemplo, PE_neg_MS2.mfql). Os nomes de arquivo para identificação do padrão interno rotulado incluem a tag D7(D9) na (por exemplo, PED7_neg_MS2.mfql). Esses arquivos MFQL são usados para verificar a quantidade de deutério no padrão interno. Clique aqui para baixar este arquivo.

Todos os autores são funcionários da Philip Morris International. A Philip Morris International é a única fonte de financiamento e patrocinadora deste projeto.