Utilizando Baixa Tensão de Oxigênio para Reduzir Células Hematopoiéticas em Culturas de Células Estromais da Medula Óssea Murina

Resumo

Uma cultura rotineira de células estromais da medula óssea (BMSCs) leva ao isolamento de populações de células heterogêneas, sendo muitas células de origem hematopoiética. Aqui, descrevemos um método que utiliza baixa tensão de oxigênio para reduzir significativamente os contaminantes hematopoiéticos em culturas murinas de BMSC.

Resumo

Atualmente, ainda há uma falta de marcadores universalmente aceitos para isolar prospectivamente uma população homogênea de células-tronco esqueléticas (SSCs). Por esse motivo, as BMSCs, que suportam a hematopoiese e contribuem para todas as funções do esqueleto, continuam a ser amplamente utilizadas para estudar progenitores mesenquimais multipotentes (MMPs) e inferir a função das SSC. Além disso, dada a amplitude dos modelos murinos transgênicos usados para estudar doenças musculoesqueléticas, o uso de BMSCs também serve como uma ferramenta poderosa para examinar os mecanismos moleculares que regulam MMPs e SSCs. No entanto, procedimentos comuns de isolamento para BMSCs murinas resultam em mais de 50% das células recuperadas sendo de origem hematopoiética, potencialmente dificultando a interpretação dos dados gerados durante esses estudos. Aqui, descrevemos um método usando baixa tensão de oxigênio ou hipóxia para a eliminação seletiva de células CD45⁺ em culturas de BMSC. É importante ressaltar que esse método pode ser facilmente implementado não apenas para reduzir os contaminantes hemopoiéticos, mas também para aumentar a porcentagem de MMPs e SSCs putativos em culturas de BMSC.

Introdução

Semelhante às células-tronco hematopoiéticas (HSCs), as SSCs estão alojadas no microambiente ósseo; no entanto, ao contrário das HSCs, atualmente há uma falta de marcadores de superfície celular universalmente aceitos que possam ser usados para identificar prospectivamente as SSCs ^1,2,3. No entanto, sistemas de cultura in vitro e ensaios de reconstituição in vivo demonstram que uma proporção de BMSCs tem a capacidade de suportar a hematopoiese, bem como a capacidade de se diferenciar em todas as células das linhagens mesenquimais ^4,5. Assim, embora as BMSCs representem uma população altamente heterogênea, uma proporção dessas células tem características de células-tronco genuínas, definidas por sua capacidade de se auto-renovar e reconstituir todas as células de seu tecido de origem. Além disso, ao contrário do uso de marcadores de superfície celular, as BMSCs podem ser rapidamente isoladas com base em sua rápida adesão ao plástico de cultura de tecidos ^6,7. Por essas razões, os BMSCs são frequentemente usados como substitutos para SSCs⁵.

Embora a adesão preferencial ao plástico de cultura de tecidos (TC) tenha sido usada para isolar com sucesso as BMSCs do tecido humano, os modelos murinos apresentam desafios adicionais para esse método. Mais notavelmente, como as células hematopoiéticas murinas têm a capacidade de aderir tanto ao plástico TC quanto às BMSCs, ocorre alta contaminação hematopoiética nesse sistema modelo, dificultando a interpretação dos dados gerados por esse método de isolamento⁶.

Notavelmente, as BMSCs residem no microambiente ósseo, onde as tensões de oxigênio variam de 1% a 4%⁸. No entanto, sob condições padrão de cultura de tecidos, as incubadoras de cultura de células são mantidas em níveis atmosféricos de oxigênio de 21%, representando níveis suprafisiológicos. Destacando o significado funcional dessas diferenças, a cultura de células de origem mesenquimal a 21% de oxigênio está associada ao aumento da morte celular ^9,10. Além disso, demonstramos recentemente que as células hematológicas e as células mesenquimais respondem diferencialmente a baixas tensões de oxigênio. Especificamente, há uma diminuição substancial no número de células hematopoiéticas CD45⁺ quando as culturas de BMSCs são mantidas em baixas tensões de oxigênio. De fato, observamos uma redução de 90% nas células hematopoiéticas CD45⁺ usando essa técnica¹¹.

Aqui, compartilhamos um protocolo que pode ser facilmente implementado para laboratórios para reduzir significativamente a contaminação hematopoiética e melhorar a pureza das células mesenquimais durante a cultura de rotina de BMSCs.

Protocolo

Todos os métodos descritos utilizando modelos murinos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (A187-19-08).

1. Dissecção dos ossos dos membros posteriores

1. Eutanasiar camundongos C57BL/6 machos ou fêmeas de 10 a 12 semanas de idade por asfixia por CO₂ usando uma taxa de fluxo de 2-4 L/min seguida de confirmação de morte por decapitação. Camundongos fêmeas ou machos podem ser usados neste ensaio sem diferenças esperadas nos resultados. Pulverize o pelo com etanol 70%.
2. Use pinças cirúrgicas estéreis e tesouras para fazer uma pequena incisão na pele sob o esterno. Use as mãos para rasgar a pele ao redor da circunferência do corpo e, em seguida, puxe a pele distalmente em direção aos membros posteriores para expor o tecido subjacente.
3. Use pinças cirúrgicas esterilizadas e tesouras para remover suavemente o membro posterior, separando a cabeça femoral (bola) do acetábulo (encaixe) da pelve (quadril). Use uma pinça estéril e um bisturi para raspar suavemente ao longo dos ossos para remover o máximo de tecido mole possível.
4. Use um bisturi estéril para separar o fêmur e a tíbia usando resistência mínima para cortar os ligamentos (colateral lateral e medial, cruzado anterior e posterior e tendão patelar [ligamento]) que conectam os dois ossos. É importante ressaltar que, após a separação, mantenha os côndilos no fêmur distal e na tíbia proximal intactos.
5. Para fêmures distais, faça um corte entre a cabeça do fêmur e o terceiro trocanter e um corte na epífise proximal à placa de crescimento, minimizando os danos à placa de crescimento.
6. Para tíbias proximais, faça um corte proximal ao maléolo lateral e um corte distal do planalto tibial logo proximal à placa de crescimento.
7. Coloque os fêmures e tíbias com o lado cortado voltado para baixo em tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mL.

2. Isolamento de BMSCs de fêmures e tíbias

1. Coloque tubos de microcentrífuga de 1,5 mL em uma centrífuga de bancada e gire a 10.000 x g a 4 ° C por 1 s.
2. Use uma pinça estéril para remover cuidadosamente os ossos dos tubos da microcentrífuga, deixando um tampão vermelho de medula óssea na parte inferior do tubo da microcentrífuga. Se alguma medula permanecer na haste óssea, transfira o osso para um novo tubo, repita a centrifugação rápida e combine os pellets em um tubo durante a ressuspensão Etapa 2.3.
3. Use uma pipeta P1000 para ressuspender suavemente o pellet de medula em 500 μL de meio de crescimento, MEMa suplementado com 20% de soro bovino fetal e 1.000 U/ml de penicilina-estreptomicina. Transfira as células estromais da medula óssea para um tubo cônico de 15 mL contendo 4,5 mL de meio de crescimento.

3. Lise de glóbulos vermelhos

1. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Aspire o meio de crescimento e ressuspenda suavemente o pellet em 1,5 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos.
2. Incube em temperatura ambiente por 75-90 s. Tempere imediatamente com 10 mL de meio de crescimento.
3. Centrifugar as células a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Aspire o meio e ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de crescimento para contagem (consulte a Etapa 4).
   NOTA: O pellet celular não deve mais ser vermelho, mas branco, indicando lise bem-sucedida dos glóbulos vermelhos. Se o pellet ainda estiver vermelho, uma rodada adicional de tampão de lise de glóbulos vermelhos pode ser realizada.

4. BMSCs de chapeamento

1. Para contar as células vivas para o plaqueamento, remova 10 μL de suspensão celular e adicione a 10 μL de solução de Trypan Blue.
2. Coloque 10 μL de mistura de solução de célula: azul de tripano em um hemocitômetro e conte as células viáveis (não azuis). A maioria das células deve excluir o azul de tripano.
3. Para ensaios de colônias, coloque as células em placas com uma densidade de 60.000 células/^cm2 em frascos de cultura de tecidos T-25 cm² . Para culturas BMSC de alta densidade, células em placa com densidade de 130.000 células/^cm2 em placas de cultura de tecidos de 100 mm² . Use um volume total de 5 mL para frascos T-25 cm² e um volume total de 10 mL para 100 cm² pratos.
4. Incube as células por 3 h a 1% -2% (hipóxia) ou 21% de oxigênio (normóxia) e 5% de CO₂. Para cultura de rotina de BMSCs em baixas tensões de oxigênio, uma incubadora de células hipóxicas ou uma câmara de hipóxia podem ser usadas. Defina cada instrumento de acordo com as instruções do fabricante para que o fluxo de gás de nitrogênio e dióxido de carbono resulte na faixa desejada de oxigênio e CO₂.
5. Após 3 h, enxágue cuidadosamente as placas 3x com 1x PBS. Para evitar a ruptura das células que começaram a se fixar, enxágue suavemente lentamente a aspiração e a pipetagem na lateral das placas de cultura de tecidos.
6. Após o enxágue final de 1x PBS, substitua o PBS por 10 mL de meio de crescimento se estiver usando 100 cm² pratos ou 5 mL de meio de crescimento se estiver usando frascos T-25cm² . Após o enxágue, a maioria das células flutuantes deve ser removida.

5. Manutenção de BMSCs em condições hipóxicas

1. Para culturas hipóxicas, mantenha as células em uma câmara de hipóxia ou incubadora ajustada para 1%-2% O₂ e 5% CO₂. Para culturas normóxicas, mantenha as células a 21% de O₂ e 5% de CO_2. Se estiver usando uma incubadora hipóxica, certifique-se de que as portas estejam minimamente abertas para evitar influxos de oxigênio atmosférico (21%). Mude a mídia a cada 2-3 dias.
2. Para ensaios de colônias, incube as células por 7 a 10 dias, após os quais enumere as colônias ou inicie a diferenciação ou outros ensaios desejados. Em condições hipóxicas, entre 50-120 colônias podem ser antecipadas, enquanto em condições normóxicas, entre 5-30 colônias podem ser antecipadas.
3. Para culturas BMSC de alta densidade, incubar as células até ficarem confluentes, aproximadamente 7-10 dias para culturas hipóxicas e aproximadamente 14-21 dias para culturas normóxicas. Uma vez confluentes, tripsinizar as células com tripsina a 0,25% para uso nos ensaios desejados.
4. Para visualizar as células, coloque a placa de cultura de tecidos em um palco, gire a objetiva de fase para a via óptica e certifique-se de que o controle deslizante de contraste de fase esteja selecionado para a objetiva correspondente. Visualize as células com ampliação de 100x ou 200x.

Resultados

Após 7 dias de isolamento celular, as células cultivadas a 21% de oxigênio são altamente heterogêneas. Especificamente, há uma grande variação de tamanho, com células bipolares maiores interespaçadas com células menores contendo múltiplas saliências (Figura 1A). Em contraste, as células cultivadas em condições hipóxicas são altamente homogêneas. As células dentro das colônias são relativamente semelhantes em tamanho e têm uma aparência bipolar, assemelhando-se a outras células de origem mese...

Discussão

Com base em nossas observações, as BMSCs aderem ao plástico de cultura de tecidos mais cedo do que os macrófagos e outras células de origem hemopoiética¹¹. Por esse motivo, enxaguar as placas 3 h após o plaqueamento é uma etapa crítica, pois remove as células hematopoiéticas flutuantes que têm o potencial de se ligar a pontos de tempo posteriores. Além disso, esses enxágues devem ser feitos com cuidado, especificamente pipetando o meio na lateral do prato para evi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100mm2 placas de cultura de tecidos	Corning	353003
1x Phosphate Buffred Saline (PBS)	Gibco	100010-023
Hemocitômetro Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664
HyClone Fetal Bovine Serum (EUA), Caracterizou	GE Healthcare Life Ciências	SH30071.03
InvivO2 400	Baker Ruskinn	https://bakerco.com
MEMα, nucleosídeos	Gibco	12571-063
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15140-122
Tampão de lise de glóbulos vermelhos Hybri-Max	Sigma-Aldrich	R7757
T-25cm2  frascos de cultura de tecidos	Corning	430168
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Gibco	25200-056

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