Este protocolo descreve um ensaio comparativo, utilizando atividades complexas mitocondriais CI+CIII e CII+CIII na presença ou ausência de Na+, para estudar a existência de piscinas de CoQ funcionais parcialmente segmentadas.
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Artigo de método
Sensibilidade da membrana mitocondrial interna para na+ revela piscinas de COQ funcionais parcialmente segmentadas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As piscinas de ubiquinona (CoQ) na membrana mitocondrial interna (IMM) são parcialmente segmentadas para enzimas complexas I ou dependentes de FAD. Tal subdivisão pode ser facilmente avaliada por um ensaio comparativo usando NADH ou succinato como doadores de elétrons em mitocôndrias descongeladas congeladas, nas quais a redução do citocromo c (cyt c) é medida. O ensaio se baseia no efeito de Na+ no IMM, diminuindo sua fluidez. Aqui, apresentamos um protocolo para medir a atividade naDH-cyt c oxidoreductase e atividades de succinato-cyt c oxidoreductase na presença de NaCl ou KCl. As reações, que dependem da mistura de reagentes em uma cuvette de forma stepwise, são medidas espectrofotometricamente durante 4 minutos na presença de Na+ ou K+. A mesma mistura é realizada em paralelo na presença dos inibidores específicos da enzima, a fim de subtrair a alteração inespecífica na absortância. A atividade nadh-cyt c oxidoreductase não diminui na presença de nenhuma dessas alcaações. No entanto, a atividade de succinato-cyt c oxidoreductase diminui na presença de NaCl. Este simples experimento destaca: 1) o efeito de Na+ na diminuição da fluidez do IMM e da transferência de CoQ; 2) que o supercomplexO I+III2 protege a transferência de ubiquinona (CoQ) de ser afetada pela redução da fluidez do IMM; 3) que a transferência de CoQ entre CI e CIII é funcionalmente diferente da transferência de CoQ entre CII e CIII. Esses fatos sustentam a existência de piscinas de CoQ funcionalmente diferenciadas no IMM e mostram que podem ser reguladas pelo ambiente Na+ em mudança das mitocôndrias.
Introdução
O sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é a principal via que conduz a síntese de triptosfato de adenosina (ATP), a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e o consumo de equivalentes redutores, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) ou succinato, por mitocôndrias. O sistema OXPHOS é composto por cinco complexos proteicos: Complexo I (CI) oxida NADH e reduz o CoQ em ubiquinol (CoQH2). O Complexo II (CII) oxida o succinato em fumarate e reduz o CoQ em CoQH2. Complexo III (CIII) oxida CoQH2 de volta ao CoQ, reduzindo citocromo c (cyt c). Finalmente, o complexo IV (CIV) oxida o cit c e reduz o oxigênio à ....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo comitê de ética institucional do Centro Nacional de Investigações Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Espanha, de acordo com a Diretiva da União Europeia de 22 de setembro de 2010 (2010/63/UE) e com o Decreto Real Espanhol de 1 de fevereiro de 2013 (53/2013). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de animais utilizados e seu sofrimento.
NOTA: Este ensaio comparativo para estudar a segmentação de piscinas de CoQ mitocondrial é descrito da seguinte forma:
1. Quant....
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Resultados
Os resultados típicos deste protocolo estão representados abaixo (Figura 3). Como a absorvência c reduzida se localiza a 550 nm, todas as subsampeções desinibidas devem mostrar um aumento na absorvância de 550 nm. Subsamples inibidas, o ideal é mostrar uma inclinação plana ou ligeiramente crescente (Figura 3). As encostas de subsamtras inibidas devem ser subtraídas de subsampleções desinibidas.
As amostras A e B, ambas corrigidas por .......
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Discussão
Embora este protocolo represente um procedimento muito simples para identificar a existência das piscinas de CoQ parcialmente segmentadas, existem algumas medidas críticas a serem tomadas em conta. Substratos (ou seja, NADH ou succinato) são preferencialmente adicionados por último, uma vez que a autooxidação desses compostos pode ocorrer. A inversão de Cuvette deve ter cuidado para evitar a formação de bolhas que possam interferir na leitura.
Além disso, a presente técnica apresenta algumas l.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez pela assistência técnica. Este estudo foi apoiado pelo MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). O CNIC conta com o apoio do Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), do Ministério da Ciencia, da Innovación e das Universidades (MCNU) e da Fundação Pró CNIC e do Centro de Excelência Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 criada com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Antimicina A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Ensaio de proteína Bradford | Bio-Rad | 5000001 | |
| Citocromo c do coração equino | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Ácido malônico | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Cianeto de potássio | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenona | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | versão 2 | |
| Espectrofotômetro | UV/VISJASCO | ||
| Succinato | Sigma-Aldrich | 398055 |
Referências
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory superc....
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Reimpressões e permissões
