Artigo de método

Microscopia de Fluorescência De Largura Intravital de Microcirculação Pulmonar em Lesão Pulmonar Aguda Experimental Usando um Sistema de Imagem Estabilizada a Vácuo

DOI:

10.3791/63733

⸱

6 de abril de 2022

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1Department of Physiology and Biophysics, Dalhousie University, 2Department of Microbiology and Immunology, Dalhousie University, 3Department of Neuroscience, Dalhousie University, 4Department of Anesthesia, Pain Management, and Perioperative Medicine, Dalhousie University, 5Live Cell Imaging Center, University of Calgary, 6Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary, 8Department of Pharmacology, Dalhousie University

Neste artigo

Resumo

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A microscopia de fluorescência intravital pode ser utilizada para estudar interações leucócito-endotelial e perfusão capilar em tempo real. Este protocolo descreve métodos para imagem e quantificação desses parâmetros na microcirculação pulmonar usando um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imagem intravital das interações leucócito-endotelial oferece insights valiosos sobre doenças imunomediadas em animais vivos. O estudo da lesão pulmonar aguda (ALI)/síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e outras patologias respiratórias in vivo é difícil devido à acessibilidade limitada e artefatos de movimento inerentes aos pulmões. No entanto, várias abordagens foram desenvolvidas para superar esses desafios. Este protocolo descreve um método para microscopia de fluorescência intravital para estudar interações leucócito-endoteliais em tempo real na microcirculação pulmonar em um modelo experimental de ALI. Um sistema de imagem pulmonar in vivo e uma plataforma de microscopia intravital impressa em 3D são usados para proteger o camundongo anestesiado e estabilizar o pulmão, minimizando a lesão pulmonar confusa. Após a preparação, a microscopia de fluorescência widefield é usada para estudar a adesão de leucócitos, rolamento de leucócitos e função capilar. Embora o protocolo aqui apresentado se concentre na imagem em um modelo agudo de doença pulmonar inflamatória, ele também pode ser adaptado para estudar outros processos patológicos e fisiológicos no pulmão.

Introdução

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A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta útil de imagem para visualizar e estudar vários processos biofísicos in vivo. O pulmão é altamente desafiador para a imagem in vivo devido à sua localização fechada, a natureza frágil de seu tecido, e artefatos de movimento induzidos pela respiração e batimentos cardíacos 1,2. Várias configurações de microscopia intravital (IVM) foram desenvolvidas para imagens em tempo real de interações leucócito-endotelial em microcirculação pulmonar para superar esses desafios. Tais abordagens baseiam-se na exposição cirúrgica e estabilização do pulmão para imagem.

Os animais são tipicamente preparados para o IVM pulmonar por procedimentos cirúrgicos. Primeiro, os animais são entubados e ventilados, o que permite a excisão cirúrgica de uma janela torácica e intervenções subsequentes para estabilizar o pulmão para imagem. Uma técnica envolve colar o parenchyma em uma tampa de vidro3, procedimento que corre o risco de trauma físico significativo no tecido imageado. Mais avançado é a utilização de um sistema de vácuo para estabilizar o pulmão sob uma janela de vidro4. Esta configuração facilita a adesão frouxa da superfície pulmonar ao deslizamento de cobertura através de um vácuo reversível espalhado sobre uma grande área local e expande o pulmão enquanto ainda limita o movimento nas dimensões x, y e z4. O vácuo é aplicado uniformemente através de um canal ao redor da área de imagem da configuração e puxa o tecido para uma região cônica rasa de frente para o deslizamento de grau de imagem4. Através desta janela de visualização, a microcirculação pulmonar pode ser estudada utilizando várias modalidades de imagem óptica.

O IVM pulmonar permite imagens quantitativas de uma infinidade de parâmetros microcirculatórios. Estes incluem medidas como velocidade da pista leucócito e comprimento5, velocidade de fluxo de glóbulos vermelhos6 e oxigenação7, metástasestumorais 8, distinção de subpopulações de células imunes 9,10,11, visualização de micropartículas12, dinâmica alveolar13,14, permeabilidade vascular15, e função capilar16 . O foco aqui é o recrutamento de leucócitos e a função capilar. O início do recrutamento de leucócitos na microcirculação pulmonar envolve interações rolantes transitórias e interações adesivas firmes entre leucócitos e células endoteliais, ambas aumentadas sob condições inflamatórias16,17. Normalmente, a rolagem é quantificada pelo número de leucócitos que passam por uma linha de referência definida pelo operador, enquanto a adesão é quantificada pelo número de leucócitos que são imóveis no endotélio16. A função capilar também pode ser afetada em estados inflamatórios, muitas vezes resultando em diminuição da perfusão. Isso pode ser atribuído a vários fatores, incluindo uma redução da deformabilidade dos glóbulos vermelhos18 e expressão variegada de sinthase indutível por células endoteliais resultando em desvio patológico19. Normalmente, o comprimento agregado de capilares perfusados por área é medido e relatado como densidade capilar funcional (FCD).

Estudar o recrutamento de leucócitos nos pulmões em tempo real requer rotular alvos biológicos com corantes fluorescentes ou anticorpos fluorescentes20. Alternativamente, várias cepas de camundongos transgênicos, como camundongos lysozyme M-green fluorescente (LysM-GFP), podem ser utilizadas para imagem de subconjuntos de células imunes específicas, como os neutrófilos21,22. Os leucócitos com rótulo fluorescente podem então ser visualizados usando microscopia de fluorescência widefield, microscopia confocal ou microscopia multifotífera. Essas técnicas conseguem o contraste utilizando comprimentos de onda de excitação específicos e detectando fluorescência emitida ao mesmo tempo em que bloqueiam simultaneamente a detecção do comprimento de onda de excitação, destacando assim o objeto rotulado.

Pesquisas existentes sobre a quantificação do rolamento de leucócitos, adesão e densidade capilar funcional no pulmão murino basearam-se principalmente na análise manual de vídeo. Isso é possível através de software de código aberto, como o Fiji 6,23, software proprietário como o CapImage12 ou sistemas de processamento de imagempersonalizados 24. Por outro lado, várias plataformas de software proprietárias (por exemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permitem a medição automatizada de uma ampla gama de outros parâmetros fisiológicos, incluindo muitos dos mencionados anteriormente aqui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.

Observações importantes têm sido feitas em relação à patologia da lesão pulmonar aguda (ALI) e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) utilizando IVM pulmonar. A ARDS é caracterizada por uma série de processos fisiodicosiológicos no pulmão, incluindo edema pulmonar e danos alveolares causados pela disfunção do endotélio e barreira epitelial25. Usando um modelo murino, descobriu-se que a ALI induzida pela sepse está associada a mudanças prejudiciais significativas no tráfico de células imunes no ambiente pulmonar26. Os neutrófilos recrutados para os capilares de camundongos com ALI induzido pela sepse foram encontrados para impedir a microcirculação, aumentando assim a hipóxia em ALI26. Além disso, o IVM tem sido usado para obter insights sobre o mecanismo de reparo subjacente após o início do ARDS27. O IVM pulmonar também tem sido uma ferramenta valiosa na compreensão de alterações fisiodicosiológicas em várias doenças pulmonares obstrutivas. Por exemplo, a visualização do transporte de mucosa em doenças como fibrose cística (CF) e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) tem facilitado o estudo de tratamentos novos e existentes para a liberação de mucosas28. O tráfico de leucócitos nessas condições também foi analisado, assim como17.

Este protocolo expande a abordagem inicialmente descrita por Lamm et al.29 para estudar interações leucócito-endotelial usando microscopia de fluorescência convencional. Os procedimentos descritos empregam um sistema de imagem pulmonar in vivo , que inclui uma base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulador e janela de imagem a vácuo (Figura 1). O sistema é montado em uma plataforma impressa 3D de 20 cm x 23,5 cm (Arquivo Suplementar 1) para fornecer fixação segura para o tubo do ventilador e almofada de aquecimento. Este método oferece imagens reprodutíveis e quantificáveis de microcirculação pulmonar murina em vivo. Aspectos importantes da preparação cirúrgica, bem como a utilização adequada de um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo são explicados em detalhes. Finalmente, um modelo experimental de ALI é usado para fornecer imagens representativas e análises de rolagem de leucócitos alterados, aderência leucócito e perfusão capilar associada à inflamação. O uso deste protocolo deve facilitar investigações mais importantes sobre alterações fisiofisiológicas na microcirculação pulmonar durante estados com doenças agudas.

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Protocolo

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Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados com aprovação prévia pelo Comitê de Animais de Laboratório da Universidade de Dalhousie (UCLA).

1. Preparação

  1. Sistema de imagem pulmonar: Para preparar a janela, administre uma fina camada de graxa de vácuo no topo do anel externo, evitando a contaminação do canal de vácuo. Coloque uma tampa de vidro limpa de 8 mm na janela e pressione suavemente para baixo para criar uma vedação.
  2. Microscópio de fluorescência widefield: Realize imagens com um microscópio de fluorescência widefield convencional equipado com um objetivo de distância de trabalho de 20x/0,40 e uma câmera de dispositivo acoplado a carga (CCD) em preto e branco com uma taxa de quadro de 25 FPS. Aplique um filtro de excitação de bandpass de 530-550 nm para excitar Rhodamine-6G e um filtro de bandpass de 460-490 nm para excitar isothiocyanato fluoresceína (FITC).
  3. Sistema de vácuo: Conecte a janela de imagem a uma bomba de vácuo equipada com um medidor de pressão digital capaz de fornecer sucção constante de 50-60 mmHg, como mostrado na Figura Suplementar 1. Em suma, conecte a janela de imagem à bomba através de tubos de polietileno de 1,0 mm, tubos de polietileno de 1,0 cm, um frasco de vácuo e um filtro de 0,2 μm inline.
  4. Ventilador: Configure um pequeno ventilador de roedores para fornecer ventilação controlada por pressão a uma taxa e volume calculado com base no peso do mouse. Forneça uma pressão final-expiratória positiva (PEEP) a 5 cmH2O durante a duração do experimento, e defina a pressão-alvo para 20 cmH2O.
  5. Anestésico: Utilizando um sistema de entrega de anestesia de baixo fluxo, prime uma seringa de 5,0 mL com 99,9% de isoflurane. Use um sistema de limpeza de gás para minimizar o risco de inalação pelo cirurgião.

2. Anestesia

  1. Coloque um rato C57Bl/6 masculino de 20-25 g de 12 semanas na câmara de indução da anestesia. Com a câmara bem fechada, comece a indução com gás isoflurane a uma concentração de 3% e uma vazão de 500 mL/min.
  2. Uma vez que o mouse é anestesiado (visualizado pela taxa de respiração lenta), transfira-o para o suporte de intubação e fixe os incisivos superiores à sutura pendurada.
  3. Aperte a sutura para fixar o focinho dentro do cone do nariz. Comece a fluir pelo cone do nariz com uma concentração de 2,5%.
  4. Confirme a profundidade adequada da anestesia através da beliscão do dedo do dedo do dedo antes de passar para o próximo passo.

3. Intubação

  1. Gire a posição de tal forma que a parte de trás do suporte e o lado dorsal do mouse face em direção ao cirurgião.
  2. Passe a ponta de um cabo de fibra óptica de 20 cm através de uma cânula endotraqueal de 20 G e submersa na ponta em Lidocaína HCl (1%) para facilitar a passagem do cabo através da laringe.
  3. Usando fórceps contundentes, levante a mandíbula inferior e desloque a língua para fornecer uma passagem clara para o trato respiratório.
  4. Insira um otoscópio modificado (~60° de circunferência espéculo removido) de tal forma que os incisivos superiores se encaixem dentro da lacuna no espéculo. Ajuste o escopo e a posição da língua até que a epiglote e as cordas vocais estejam claramente visíveis.
  5. Insira o cabo de fibra óptica carregado com a cânula endotraqueal através da abertura no espéculo e na laringe. Usando pequenos movimentos circulares, passe o cabo através das cordas vocais e para dentro da traqueia.
  6. Empurre a cânula ao longo do cabo de fibra óptica, passando entre as cordas vocais e para dentro da traqueia.

4. Ventilação

  1. Recupere o mouse do suporte de intubação e coloque-o em uma almofada de aquecimento na posição de decúbito lateral direito.
  2. Conecte a cânula ao tubo do ventilador e inicie o ventilador. Reduza a concentração anestésico para 1,5% e monitore a profundidade testando o reflexo do pedal. Se o reflexo persistir, aumente a concentração incrementalmente para até 2%.
  3. Coloque gel de lágrima nos olhos do rato para evitar a secagem.
  4. Usando fita médica, proteja a cânula até o focinho. Usando fita de rotulagem, fixe a prevada direita na almofada de aquecimento na posição das 9 horas. Estenda a pata traseira esquerda caudally e fixe na posição das 6 horas.
  5. Usando uma fita de pano, estique levemente a prensa esquerda até a posição das 12 horas e fixe a outra extremidade da fita até o topo da plataforma IVM, como mostrado na Figura 2A (manter uma ligeira tensão aqui facilita a toracotomia subsequente).
  6. Insira uma sonda de temperatura retal e fixe a sonda gravando-a na almofada de aquecimento. Coloque um oxímetro de pulso na pata traseira direita e fixe na almofada de aquecimento, tomando cuidado para não interromper a circulação.
  7. Uma vez que a temperatura esteja estável a 37,0 °C ± 0,1 °C, prossiga para realizar a toracotomia.

5. Toracotomia

  1. Esterilize o tórax e o abdômen com 70% de álcool. Aplique uma camada leve de óleo mineral para umedecer o cabelo do lado esquerdo do rato-do-esterno para a coluna vertebral e do ombro para o fundo da caixa torácica.
  2. Com força-tarefas cegas e tesouras retas, faça uma pequena incisão longitudinal perto da parte inferior da caixa torácica para expor a camada muscular subjacente.
  3. Movendo-se ventrally, use dissecção contundente para separar o tecido epitelial e adiposo da camada muscular. Cauterize qualquer vaso sanguíneo exposto. Uma vez mitigado o risco de perda de sangue, estenda a incisão original ventrally até o processo xiphoide.
  4. Repita este processo dorsalmente até ~5 mm lateralmente à coluna vertebral.
  5. Movendo-se cranialmente, use dissecção contundente para expor a caixa torácica. Cauterize qualquer vaso sanguíneo exposto para preservar a estabilidade hemodinâmica.
  6. Uma vez mitigado o risco de perda de sangue, amplie a incisão do processo xifoide até a axila.
  7. Repita este processo no lado dorsal da incisão até ~1 cm inferior à orelha esquerda.
  8. Utilizando fórceps hemostáticos, segure o tecido epitelial e adiposo dissecado e coloque-se afastado da área cirúrgica (Figura 2B).
  9. Injete uma solução de Rhodamine-6G (0,5 mg/mL; 1,5 mL/kg) para visualização de leucócitos e fitc-albumina bovina (50 mg/mL; 1 mL/kg) para visualização de perfusão capilar pela veia traseira.
  10. Usando fórceps dentados, segure a costela imediatamente inferior à posição da base do pulmão na inspiração final e retraia levemente para puxar a costela para longe do pulmão. Corte a costela para induzir um pneumotórax.
  11. Estenda a incisão lateralmente ao longo do músculo intercostal em ambas as direções, tomando cuidado para não tocar na superfície pulmonar exposta.
  12. Usando fórceps contundentes, segure a próxima costela mais alta e retraia levemente para permitir que o pulmão caia da parede do peito. Se o pulmão não se soltar, pressione levemente a parede torácica contra o pulmão para fazer com que o pulmão adera à pleura subjacente e, assim, caia mais facilmente.
  13. Continue a incisão original ventrally até que o esterno e cranialmente até que o ápice do pulmão seja exposto. Use aplicadores de algodão e gaze para atenuar qualquer sangramento que surgir.
  14. Levante a caixa torácica para expor os vasos sanguíneos intercostais no aspecto dorsal da cavidade torácica. Tomando cuidado para não danificar o pulmão, cauterizar o vaso intercostal mais inferior perto da coluna vertebral, e depois cortar a costela. Movendo-se cranialmente e ventrally, repita até que uma porção de aproximadamente 1 cm x 1,5 cm da caixa torácica seja extirpada (Figura 2C).
  15. Remova qualquer acúmulo de fluido excessivo na cavidade torácica através de ação capilar usando pequenas tiras de gaze.
  16. Enquanto prossegue para a microscopia, permita que ~5 min para o fluido intrapleural se dissipe para uma interface mais segura entre o pulmão e a janela de imagem.

6. Microscopia

  1. Ligue a bomba de vácuo e ajuste a pressão para ~50-60 mmHg.
  2. Transfira a plataforma IVM para o estágio do microscópio. Posicione o poste de metal e o micromanipulador de tal forma que a janela de imagem esteja diretamente acima do pulmão exposto e o braço da janela se aproxime do pulmão da posição das 3 horas.
  3. Usando o micromanipulador, abaixe cuidadosamente a janela de imagem até que adere e estabilize a superfície pulmonar (Figura 3A).
  4. Utilizando o objetivo de 20x e o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, identifique um venule pulmonar baseado no padrão convergente do fluxo sanguíneo. Centralize a embarcação no campo de visão e grave 30 s de vídeo.
    1. Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.
    2. Repita a etapa anterior até que cinco venules pulmonares tenham sido imagens.
  5. Usando o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, identifique uma arteriola pulmonar baseada no padrão divergente do fluxo sanguíneo. Centralize a embarcação no campo de visão e grave 30 s de vídeo.
    1. Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.
    2. Repita a etapa anterior até que cinco artérias pulmonares tenham sido imagens.
  6. Usando o filtro de excitação de bandpass de 460-490 nm, localize uma região de alvéolos e capilares não interceptados por vasos maiores e grave 30 s de vídeo.
    1. Mude para o filtro de excitação do bandpass de 530-550 nm e grave 30 s de vídeo no mesmo campo de visão.
    2. Repita a etapa anterior até que cinco regiões capilares tenham sido imagens.

7. Eutanásia e protocolo de limpeza

  1. Remova a plataforma IVM do estágio do microscópio e ajuste a entrega de isoflurane para 5% por 5 minutos para eutanásia do mouse.
  2. Enquanto estiver esperando, descarte o vidro de cobertura e desconecte a janela de imagem da plataforma. Limpe a janela de imagem com uma escova pequena e use uma seringa de 30 G inserida no canal para lavá-la várias vezes com água destilada. Em seguida, lave com 95% de etanol usando a bomba de vácuo.
  3. Depois de 5 min decorrido, pare o ventilador e garanta a eutanásia completa através da luxação cervical.

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Resultados

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Para ilustrar os resultados alcançáveis através deste protocolo, a lesão pulmonar aguda (ALI) foi induzida 6 h antes da imagem usando um modelo de lipopolilcarida bacteriana intranasal (LPS) de instilação. Resumidamente, os camundongos (n = 3) foram anestesiados com isoflurano, e pequenas gotículas de LPS de Pseudomonas aeruginosa em solução salina estéril (10 mg/mL) foram pipetadas na naris esquerda em uma dosagem de 5 mg/kg. Isso foi comparado com camundongos ingênuos (n = 3; sem administração intranasal).

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Discussão

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O protocolo aqui apresentado requer prática e atenção a alguns passos críticos. Primeiro, é importante preparar a janela de imagem antes de iniciar a intubação e a cirurgia. Use uma quantidade mínima de graxa de vácuo para revestir o anel externo da janela de imagem, aplique o vidro de cobertura e teste a sucção com uma gota de água destilada. Prepará-lo com antecedência evitará que o pulmão exposto seque durante a configuração de outra forma. Embora seja possível lavar com soro fisiológico quente, isso pode correr o ris...

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Divulgações

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Kamala D. Patel é presidente e co-fundadora da Luxidea, a empresa da qual a janela de imagem utilizada neste experimento foi comprada.

Agradecimentos

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Os autores agradecem à Dra.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de ponta deslizante BD Luer de 1 mL estéril, uso únicoBecton, Dickinson and Company309659Seringa de 1 mL
Pinça de curativo ADSON, largura da ponta 0,6 mm, comprimento dos dentes 11,5 mm, 12 cmRWD Life Science Co.F12002-12Fórceps rombos
Albumina-fluoresceína IsotiocianatoSigma-AldrichA9771-1GFITC-albumina
Cotonete de álcool Álcool isopropílico 70% v / vCanadian Custom Packaging Company80002455Limpeza de álcool
AVDC110 Conversor de vídeo digital avançadoCanopus00631069602029Conversor de vídeo digital
B / W - CCD - CameraHorn ImagingBC-71Camera
Bovie Deluxe Kit de Cauterização de Alta Temperaturade Ciência Fina18010-00Cauterizer
C57BL / 6 RatosCharles River Laboratories InternationalC57BL / 6NCrlC57BL / 6 Aplicadores
com ponta de algodãoPuritan806-WCAplicador de algodão
CS-8R 8mm Lamínula de vidro redondaWarner Instruments64-0701Lamínula de vidro
Manômetro DigitalITM Instruments Inc.DG2551L0NAM02L0IM& MedidorPressão Digital
V Dr Mom Slimline Inoxidável LED OtoscópioDr. Mom Otoscópios1001Otoscópio
Ethyl Alchohol 95% VolÁlcoois ComerciaisP016EA9595% etanol
Tesoura Fina - Aço Inoxidável MartensíticoFine Science Tools14094-11Tesoura
Fita de Rotulagem Colorida Fisherbrand FisherScientific1590110Fita de rotulagem
Gast DOA-P704-AA Bomba de vácuo de alta capacidadeCole-Parmer Canada CompanyZA-07061-40Bomba de vácuo
Hartman HemostatsFine Science Tools13003-10Fórceps hemostático
Graxa de alto vácuo DowCorningDC976VFGraxa a vácuo
Isoflurano USPFresenius KabiCP0406V2Isoflurano
LIDOcaína Injeção de HCl 1% 50 mg / 5 mLTeligent Canada0121AD01Lidocaína HCl 1%
Lung SurgiBoardLuxidea, Inc.IMCH-0001Projetado para microscopia intravital do pulmão
Óleo mineralTeva Canada00485802Kit
intubação endotraqueal de camundongoScientific CorporationETI-MSESuporte de intubação, máscara de anestesia, cânula endotraqueal de 20 G, cabo de fibra óptica
Microscópio de fluorescência MST49Leica Microsystems10 450 022Microscópio de fluorescência
N Plan L 20x/0.40 Objetiva de microscópio de longa distância de trabalhoLeica Microsystems56603520x objetiva
Esponjas não tecidas 2" x 2"AMD-RitmedA2101-CHGaze
Optixcare Eye Lube PlusAventix5914322Tear gel
Original Prusa i3 MK3S+ Impressora 3DPrusa ResearchPRI-MK3S-KIT-ORG-PEI Impressora3D
Oxigênio, CompactadoLinde Canada Inc.Agulha
Precision Glide de Oxigênio 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)Becton, Dickinson and Company305106Agulha de 30 G
Frascos Filtrantes Pyrex 5340-2L 5340, 2000 mLCole-Parmer Canada Company5340-2LFrasco a Vácuo
Rodamina 6 GFita Médica Sigma-Aldrich252433Rhodamine 6G
Secure Soft Cloth - 3"PrimedPM5-630709Fita de Tecido
Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 pol. ODDow Corning602-205Tubo de polietileno de 1,0 mm de diâmetro interno Sistema de anestesia
baixo fluxo SomnosuiteKent Scientific CorporationSS-01, SS-04-móduloVentilador de roedores pequenos, Sistema de anestesia de baixo fluxo, Almofada de aquecimento, Sonda de temperatura retal, Oxímetro de pulso
Pinça de tecido, 12,5 cm de comprimento, Curva, 1 x 2 DentesInstrumentos de precisão mundial501216Pinça
dentadaFita Médica Transpore, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)3M7000002795Fita
Médica Tubulação, Transparente, 3/8 in Diâmetro Interno.Grainger CanadaUSSZUSA-HT33141.0 cm I.D.
Filtros In-Line Whatman 6720-5002 50 mm, PTFE, 0.2 µ mCole-Parmer Canada Company6720-5002Inline 0.2µ Filtro M
Ferramentas de de Kent de Tubulação de polietileno

Referências

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