Artigo de método
A microscopia de fluorescência intravital pode ser utilizada para estudar interações leucócito-endotelial e perfusão capilar em tempo real. Este protocolo descreve métodos para imagem e quantificação desses parâmetros na microcirculação pulmonar usando um sistema de imagem pulmonar estabilizado a vácuo.
A imagem intravital das interações leucócito-endotelial oferece insights valiosos sobre doenças imunomediadas em animais vivos. O estudo da lesão pulmonar aguda (ALI)/síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) e outras patologias respiratórias in vivo é difícil devido à acessibilidade limitada e artefatos de movimento inerentes aos pulmões. No entanto, várias abordagens foram desenvolvidas para superar esses desafios. Este protocolo descreve um método para microscopia de fluorescência intravital para estudar interações leucócito-endoteliais em tempo real na microcirculação pulmonar em um modelo experimental de ALI. Um sistema de imagem pulmonar in vivo e uma plataforma de microscopia intravital impressa em 3D são usados para proteger o camundongo anestesiado e estabilizar o pulmão, minimizando a lesão pulmonar confusa. Após a preparação, a microscopia de fluorescência widefield é usada para estudar a adesão de leucócitos, rolamento de leucócitos e função capilar. Embora o protocolo aqui apresentado se concentre na imagem em um modelo agudo de doença pulmonar inflamatória, ele também pode ser adaptado para estudar outros processos patológicos e fisiológicos no pulmão.
A microscopia intravital (IVM) é uma ferramenta útil de imagem para visualizar e estudar vários processos biofísicos in vivo. O pulmão é altamente desafiador para a imagem in vivo devido à sua localização fechada, a natureza frágil de seu tecido, e artefatos de movimento induzidos pela respiração e batimentos cardíacos 1,2. Várias configurações de microscopia intravital (IVM) foram desenvolvidas para imagens em tempo real de interações leucócito-endotelial em microcirculação pulmonar para superar esses desafios. Tais abordagens baseiam-se na exposição cirúrgica e estabilização do pulmão para ....
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Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados com aprovação prévia pelo Comitê de Animais de Laboratório da Universidade de Dalhousie (UCLA).
1. Preparação
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Para ilustrar os resultados alcançáveis através deste protocolo, a lesão pulmonar aguda (ALI) foi induzida 6 h antes da imagem usando um modelo de lipopolilcarida bacteriana intranasal (LPS) de instilação. Resumidamente, os camundongos (n = 3) foram anestesiados com isoflurano, e pequenas gotículas de LPS de Pseudomonas aeruginosa em solução salina estéril (10 mg/mL) foram pipetadas na naris esquerda em uma dosagem de 5 mg/kg. Isso foi comparado com camundongos ingênuos (n = 3; sem administração intranasal).
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O protocolo aqui apresentado requer prática e atenção a alguns passos críticos. Primeiro, é importante preparar a janela de imagem antes de iniciar a intubação e a cirurgia. Use uma quantidade mínima de graxa de vácuo para revestir o anel externo da janela de imagem, aplique o vidro de cobertura e teste a sucção com uma gota de água destilada. Prepará-lo com antecedência evitará que o pulmão exposto seque durante a configuração de outra forma. Embora seja possível lavar com soro fisiológico quente, isso pode correr o ris.......
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Kamala D. Patel é presidente e co-fundadora da Luxidea, a empresa da qual a janela de imagem utilizada neste experimento foi comprada.
Os autores agradecem à Dra.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de ponta deslizante BD Luer de 1 mL estéril, uso único | Becton, Dickinson and Company | 309659 | Seringa de 1 mL |
| Pinça de curativo ADSON, largura da ponta 0,6 mm, comprimento dos dentes 11,5 mm, 12 cm | RWD Life Science Co. | F12002-12 | Fórceps rombos |
| Albumina-fluoresceína Isotiocianato | Sigma-Aldrich | A9771-1G | FITC-albumina |
| Cotonete de álcool Álcool isopropílico 70% v / v | Canadian Custom Packaging Company | 80002455 | Limpeza de álcool |
| AVDC110 Conversor de vídeo digital avançado | Canopus | 00631069602029 | Conversor de vídeo digital |
| B / W - CCD - Camera | Horn Imaging | BC-71 | Camera |
| Bovie Deluxe Kit de Cauterização de Alta Temperatura | de Ciência Fina | 18010-00 | Cauterizer |
| C57BL / 6 Ratos | Charles River Laboratories International | C57BL / 6NCrl | C57BL / 6 Aplicadores |
| com ponta de algodão | Puritan | 806-WC | Aplicador de algodão |
| CS-8R 8mm Lamínula de vidro redonda | Warner Instruments | 64-0701 | Lamínula de vidro |
| Manômetro Digital | ITM Instruments Inc. | DG2551L0NAM02L0IM& Medidor | Pressão Digital |
| V Dr Mom Slimline Inoxidável LED Otoscópio | Dr. Mom Otoscópios | 1001 | Otoscópio |
| Ethyl Alchohol 95% Vol | Álcoois Comerciais | P016EA95 | 95% etanol |
| Tesoura Fina - Aço Inoxidável Martensítico | Fine Science Tools | 14094-11 | Tesoura |
| Fita de Rotulagem Colorida Fisherbrand Fisher | Scientific | 1590110 | Fita de rotulagem |
| Gast DOA-P704-AA Bomba de vácuo de alta capacidade | Cole-Parmer Canada Company | ZA-07061-40 | Bomba de vácuo |
| Hartman Hemostats | Fine Science Tools | 13003-10 | Fórceps hemostático |
| Graxa de alto vácuo Dow | Corning | DC976VF | Graxa a vácuo |
| Isoflurano USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Isoflurano |
| LIDOcaína Injeção de HCl 1% 50 mg / 5 mL | Teligent Canada | 0121AD01 | Lidocaína HCl 1% |
| Lung SurgiBoard | Luxidea, Inc. | IMCH-0001 | Projetado para microscopia intravital do pulmão |
| Óleo mineral | Teva Canada | 00485802 | Kit |
| intubação endotraqueal de camundongo | Scientific Corporation | ETI-MSE | Suporte de intubação, máscara de anestesia, cânula endotraqueal de 20 G, cabo de fibra óptica |
| Microscópio de fluorescência MST49 | Leica Microsystems | 10 450 022 | Microscópio de fluorescência |
| N Plan L 20x/0.40 Objetiva de microscópio de longa distância de trabalho | Leica Microsystems | 566035 | 20x objetiva |
| Esponjas não tecidas 2" x 2" | AMD-Ritmed | A2101-CH | Gaze |
| Optixcare Eye Lube Plus | Aventix | 5914322 | Tear gel |
| Original Prusa i3 MK3S+ Impressora 3D | Prusa Research | PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI Impressora | 3D |
| Oxigênio, Compactado | Linde Canada Inc. | Agulha | |
| Precision Glide de Oxigênio 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) | Becton, Dickinson and Company | 305106 | Agulha de 30 G |
| Frascos Filtrantes Pyrex 5340-2L 5340, 2000 mL | Cole-Parmer Canada Company | 5340-2L | Frasco a Vácuo |
| Rodamina 6 G | Fita Médica Sigma-Aldrich | 252433 | Rhodamine 6G |
| Secure Soft Cloth - 3" | Primed | PM5-630709 | Fita de Tecido |
| Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 pol. OD | Dow Corning | 602-205 | Tubo de polietileno de 1,0 mm de diâmetro interno Sistema de anestesia |
| baixo fluxo Somnosuite | Kent Scientific Corporation | SS-01, SS-04-módulo | Ventilador de roedores pequenos, Sistema de anestesia de baixo fluxo, Almofada de aquecimento, Sonda de temperatura retal, Oxímetro de pulso |
| Pinça de tecido, 12,5 cm de comprimento, Curva, 1 x 2 Dentes | Instrumentos de precisão mundial | 501216 | Pinça |
| dentadaFita Médica Transpore, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m) | 3M | 7000002795 | Fita |
| Médica Tubulação, Transparente, 3/8 in Diâmetro Interno. | Grainger Canada | USSZUSA-HT3314 | 1.0 cm I.D. |
| Filtros In-Line Whatman 6720-5002 50 mm, PTFE, 0.2 µ m | Cole-Parmer Canada Company | 6720-5002 | Inline 0.2µ Filtro M |
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