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Cancer Research

Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/63744
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

Summary

Los modelos preclínicos tienen como objetivo avanzar en el conocimiento de la biología del cáncer y predecir la eficacia del tratamiento. Este artículo describe la generación de xenoinjertos derivados de pacientes a base de pez cebra (zPDX) con fragmentos de tejido tumoral. Las zPDX se trataron con quimioterapia, cuyo efecto terapéutico se evaluó en términos de apoptosis celular del tejido trasplantado.

Abstract

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la incidencia de muchos tipos de cáncer sigue aumentando. Se ha avanzado mucho en términos de detección, prevención y tratamiento; Sin embargo, todavía faltan modelos preclínicos que predigan el perfil de quimiosensibilidad de los pacientes con cáncer. Para llenar este vacío, se desarrolló y validó un modelo de xenoinjerto derivado del paciente in vivo . El modelo se basó en embriones de pez cebra (Danio rerio) a los 2 días después de la fertilización, que se utilizaron como receptores de fragmentos de xenoinjerto de tejido tumoral tomados de la muestra quirúrgica de un paciente.

También vale la pena señalar que las muestras biópticas no fueron digeridas o desagregadas, con el fin de mantener el microambiente tumoral, lo cual es crucial en términos de analizar el comportamiento tumoral y la respuesta a la terapia. El protocolo detalla un método para establecer xenoinjertos derivados de pacientes (zPDX) a base de pez cebra a partir de la resección quirúrgica de tumor sólido primario. Después de la detección por un anatomopatólogo, la muestra se disecciona con una hoja de bisturí. El tejido necrótico, los vasos o el tejido graso se extraen y luego se cortan en trozos de 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm.

Las piezas se marcan con fluorescencia y se xenotrasplantan en el espacio perivitelino de los embriones de pez cebra. Se puede procesar un gran número de embriones a bajo costo, lo que permite análisis in vivo de alto rendimiento de la quimiosensibilidad de zPDX a múltiples medicamentos contra el cáncer. Las imágenes confocales se adquieren rutinariamente para detectar y cuantificar los niveles apoptóticos inducidos por el tratamiento de quimioterapia en comparación con el grupo control. El procedimiento de xenoinjerto tiene una ventaja de tiempo significativa, ya que se puede completar en un solo día, proporcionando una ventana de tiempo razonable para llevar a cabo un cribado terapéutico para ensayos coclínicos.

Introduction

Uno de los problemas de la investigación clínica del cáncer es que el cáncer no es una sola enfermedad, sino una variedad de enfermedades diferentes que pueden evolucionar con el tiempo, requiriendo tratamientos específicos dependiendo de las características del propio tumor y del paciente1. En consecuencia, el desafío es avanzar hacia la investigación oncológica orientada al paciente, con el fin de identificar nuevas estrategias personalizadas para la predicción temprana de los resultados del tratamiento del cáncer2. Esto es particularmente relevante para el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), ya que se considera un cáncer difícil de tratar, con una tasa de supervivencia a 5 años del 11%3.

El diagnóstico tardío, la progresión rápida y la falta de terapias efectivas siguen siendo los problemas clínicos más apremiantes de PDAC. El principal desafío es, por lo tanto, modelar al paciente e identificar biomarcadores que puedan ser aplicados en la clínica para seleccionar la terapia más efectiva en línea con la medicina personalizada 4,5,6. Con el tiempo, se han propuesto nuevos enfoques para modelar enfermedades cancerosas: organoides derivados del paciente (PDO) y xenoinjertos derivados de pacientes de ratón (mPDX) se originaron a partir de una fuente de tejido tumoral humano. Se han utilizado para reproducir la enfermedad para estudiar la respuesta y la resistencia a la terapia, así como la recurrencia de la enfermedad 7,8,9.

Del mismo modo, el interés en los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (zPDX) basados en pez cebra ha aumentado, gracias a sus características únicas y prometedoras10, lo que representa una herramienta rápida y de bajo costo para la investigación del cáncer11,12. Los modelos zPDX requieren solo un tamaño de muestra tumoral pequeño, lo que hace factible el cribado de quimioterapia de alto rendimiento13. La técnica más común utilizada para los modelos zPDX se basa en la digestión completa de la muestra y la implantación de las poblaciones de células primarias, que reproduce parcialmente el tumor, pero tiene las desventajas de la falta de microambiente tumoral y la diafonía entre células malignas y sanas14.

Este trabajo muestra cómo se pueden usar las zPDX como modelo preclínico para identificar el perfil de quimiosensibilidad de pacientes con cáncer de páncreas. La valiosa estrategia facilita el proceso de xenoinjerto, ya que no hay necesidad de expansión celular, lo que permite acelerar el cribado de quimioterapia. La fortaleza del modelo es que todos los componentes del microambiente se mantienen tal como están en el tejido canceroso del paciente, porque, como es bien sabido, el comportamiento del tumor depende de su interacción15,16. Esto es altamente favorable sobre los métodos alternativos en la literatura, ya que es posible preservar la heterogeneidad tumoral y contribuir a mejorar la previsibilidad del resultado del tratamiento y la recaída de una manera específica del paciente, lo que permite que el modelo zPDX se utilice en ensayos coclínicos. Este manuscrito describe los pasos involucrados en la elaboración del modelo zPDX, comenzando con una parte de la resección del tumor del paciente y tratándola para analizar la respuesta a la quimioterapia.

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Protocol

El Ministerio de Salud Pública italiano aprobó todos los experimentos con animales descritos, de conformidad con la Directiva 2010/63/UE sobre el uso y cuidado de animales. El Comité de Ética local aprobó el estudio, con el número de registro 70213. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados. Antes de comenzar, se deben preparar todas las soluciones y el equipo (sección 1) y se deben cruzar los peces (sección 2).

1. Preparación de soluciones y equipos

NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer las soluciones y los medios que deben prepararse.

  1. Soporte de gel de agarosa
    1. Pesar el polvo de agarosa en un matraz para microondas y disolverlo en un volumen dado de medio de pez cebra E3 para hacer un gel al 1%. Calentar en un microondas hasta que la agarosa se haya disuelto por completo.
      NOTA: No hierva demasiado la solución.
    2. Vierta la agarosa derretida en una placa de Petri y espere hasta que el gel se haya solidificado por completo.
    3. Haga pequeños cilindros de agarosa (~ 5 mm de alto) usando una pipeta de plástico Pasteur con la punta cortada. Una vez preparado, conservar en una placa de Petri a 4 °C envuelto en papel de aluminio.
  2. Microagujas de vidrio
    1. Tire de los capilares de vidrio de borosilicato con un extractor para obtener agujas finas (ajustes: HEAT 990, PULL 550).
      NOTA: A partir de un capilar, es posible obtener dos agujas finas con un diámetro de punta de 10 μm.

2. Cruce de peces y recolección de huevos

  1. Transfiera peces adultos en tanques de reproducción 3 días antes de la implantación del tejido, según lo descrito por Avdesh et al.17.
  2. NOTA: Se recomienda una proporción de 1:1 o 2:3 hombres a mujeres. La densidad de peces debe ser de un máximo de cinco peces por litro de agua. Mantenga a los machos y hembras separados con una barrera durante la noche.
  3. Al día siguiente, retire la barrera y permita que los peces se apareen.
  4. Retire los peces de los tanques de cría y devuélvalos a sus tanques de alojamiento.
  5. Vierta el agua del tanque de cría a través de una red de malla fina. Transfiera los huevos fertilizados a una placa de Petri con medio de pez cebra E3.
  6. Revise la placa de Petri con un microscopio estereoscópico y deseche los huevos turbios. Mantener los huevos fertilizados en medio fresco de pez cebra E3 a 28 °C.

3. Recolección de muestras

NOTA: Pinzas de autoclave y mango de bisturí.

  1. Procesamiento inmediato
    1. Recoger la muestra quirúrgica del tumor en 10 ml de medio tumoral a 4 °C (muestra tumoral de 5 mm a 10 mm de diámetro). Transfiera la muestra a 4 °C desde el lugar deseado para su procesamiento inmediato.
  2. Almacenamiento durante la noche (opcional)
    1. Recoger la muestra quirúrgica del tumor en 10 ml de medio tumoral y almacenar la muestra durante la noche a 4 °C.
  3. Almacenamiento a -80 °C (opcional, menos recomendado)
    1. Almacene la muestra a -80 °C en un vial criogénico con medio tumoral suplementado con dimetilsulfóxido (DMSO) al 5%.

4. Procesamiento de muestras

NOTA: Realice los pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril.

  1. Lave todo el tejido tumoral con 5 ml de medio tumoral fresco, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta plástica Pasteur. Aspirar y desechar el medio de lavado. Repita este paso 3 veces.
    NOTA: Evite la aspiración del tejido tumoral, ya que podría permanecer unido a la pipeta plástica Pasteur.
  2. Transfiera la muestra en una placa de Petri y sumérjala en 1-2 ml de medio tumoral fresco. Corte la muestra del tumor en trozos pequeños (1-2 mm3) con una hoja de bisturí y colóquelos en un tubo plástico estéril de 5 ml con medio tumoral.
  3. Ajuste el picador de tejidos McIlwain a 100 μm de espesor. Coloque los fragmentos de la muestra en la mesa circular de plástico del helicóptero y córtelos. Gire la mesa 90° y repita el picado.
  4. Centrifugar los fragmentos a 300 × g durante 3 min. Luego, aspire cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo.
  5. Incubar los fragmentos con un seguidor celular fluorescente, CM-DiI (concentración final de 10 μg/ml en solución salina tamponada con fosfato [DPBS] de Dulbecco), Deep Red (concentración final de 1 μL/ml en DPBS) o CellTrace (concentración final de 5 μM en DPBS) durante 30 min, colocando el tubo en un baño maría a 37 °C.
  6. Resuspenda los fragmentos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos.
    NOTA: En el caso de CellTrace, agregue un medio que contenga al menos un 1% de proteína al final de la incubación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Centrifugar a 300 x g durante 3 min y desechar el sobrenadante. Repita este paso 3 veces con 1 ml de DPBS para eliminar el tinte no incorporado.
  8. Suspender los fragmentos en 5 mL de DPBS en una placa de Petri de 60 mm.
    NOTA: Asegúrese de que el tejido no se seque.

5. Creación de zPDX

NOTA: Realice los pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejido estéril.

  1. Anestesiar los embriones 2 días después de la fertilización (dpf) con 0,16 mg/ml de tricaína en medio de pez cebra E3.
  2. Coloque tres cilindros de agarosa (paso 1.1.3) en una placa de Petri y coloque un embrión de pez cebra en un cilindro, exponiendo un lado. Retire el exceso de solución para mantener el embrión en una película delgada.
  3. Transfiera el pedazo de tejido teñido con pinzas estériles de la placa de Petri al soporte de agarosa al 1% donde yace el embrión. Recoger el tejido, colocarlo encima de la yema del embrión y, a continuación, introducirlo en el espacio perivitelino utilizando la microaguja de vidrio tirada térmicamente (paso 1.2.1).
  4. Agregue suavemente algunas gotas de E3 1% penicilina-estreptomicina (Pen-Strep) al embrión para devolverlo al líquido.
  5. Repita los pasos 5.2-5.4 para todos los embriones y, finalmente, retire los soportes de agarosa de la placa de Petri e incube los embriones a 35 ° C.
  6. Compruebe los embriones para los xenoinjertos correctos (tinción positiva) 2 h después de la implantación utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Deseche los embriones con fragmentos tumorales que no estén completamente dentro del espacio perivitelino, así como los embriones muertos. Distribuir aleatoriamente los embriones en seis placas multipocillos (máximo n = 20 embriones/pocillo), divididos equitativamente en grupos según el plan experimental (p. ej., control y FOLFOXIRI).

6. Tratamiento

  1. Diluir el fármaco (por ejemplo, 5-fluorouracilo, oxaliplatino, irinotecán) en E3 1% Pen-Strep, mezclando bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Según lo propuesto por Usai et al.12, utilizar una dilución quíntuple del fármaco en el agua de los peces, con respecto a la concentración plasmática equivalente (CPE).
  2. Mezcle los medicamentos para preparar el cóctel (por ejemplo, FOLFOXIRI).
  3. Retire los medios de cada pocillo y agregue el cóctel de medicamentos 2 h después de la implantación.
  4. Tratar los embriones durante 3 días. Renueve el cóctel de drogas todos los días.

7. Tinción inmunofluorescente de montaje completo

NOTA: Antes de empezar, colocar la acetona a -20 °C y preparar las soluciones enumeradas en la Tabla 1.

  1. Día 1:
    1. Fijar las larvas con 1 ml de paraformaldehído al 4% en viales de vidrio a 4 °C durante la noche.
  2. Día 2:
    1. Lave las larvas 3 x 5 min con 1 mL de PBS, agitando suavemente en un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    2. Almacenar en 1 ml de metanol al 100% a -20 °C durante la noche (o para almacenamiento a largo plazo).
    3. Rehidratar 3 x 10 min con 1 mL de PTw (0,1% de tween en PBS), agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    4. Permeabilizar con 1 mL de 150 mM de Tris-HCl a pH 8.8 durante 5 min a RT, seguido de calentamiento durante 15 min a 70 °C.
    5. Lavar 2 x 10 min con 1 ml de PTw, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    6. Lavar 2 x 5 min con 1 mL dedH2O, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    7. Permeabilizar con 1 ml de acetona helada durante 20 min a -20 °C.
    8. Lavar 2 x 5 min con 1 mL dedH2O, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    9. Lavar 2 x 5 min con 1 ml de PTw, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    10. Incubar las larvas en 1 ml de tampón de bloqueo durante 3 h a 4 °C, agitando suavemente sobre un balancín de plataforma de laboratorio (400 rpm).
    11. Coloque las larvas en placas de pocillos divididas por grupo de la siguiente manera: 10 larvas en 50 μL de volumen/pocillo en una placa de 96 pocillos o 20 larvas en 100 μL de volumen/pocillo en una placa de 48 pocillos.
    12. Deseche el tampón de bloqueo, incube las larvas con solución de anticuerpos primarios (por ejemplo, caspasa-3 hendida antihumana de conejo, 1:250) diluida en tampón de incubación durante la noche a 4 °C en la oscuridad, y meca suavemente en una placa agitadora (400 rpm). Consulte el paso 7.2.11 para ver los volúmenes recomendados.
  3. Día 3:
    1. Lavar las larvas secuencialmente 3 x 1 h con 1 mL de PBS-TS (10% suero de cabra, 1% Triton X-100 en PBS) y luego, con 2 x 10 min con 1 mL de PBS-T (1% Triton X-100 en PBS) y 2 x 1 h con 1 mL de PBS-TS. En cada lavado, agite suavemente las placas que contienen las larvas en una placa agitadora (400 rpm).
    2. Incubar las larvas con anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente (p. ej., anticuerpo secundario adsorbido cruzado anti-conejo IgG [H+L], Alexa Fluor 647, 1:500) y 100 μg/ml Hoechst 33258 diluido en tampón de incubación en la oscuridad durante la noche a 4 °C, con agitación suave en una placa agitadora (400 rpm). Ver paso 7.2.11 para ver los volúmenes recomendados de solución de anticuerpos secundarios.
  4. Día 4:
    1. Lavar 3 x 1 h con 1 mL de PBS-TS y 2 x 1 h con 1 mL de PTw, con agitación suave en una placa agitadora (400 rpm).
    2. Cree una capa circular con el esmalte (grosor de ~0.5-1 mm) en portaobjetos de microscopio. Deje que el esmalte se seque y coloque las larvas en el centro de la capa circular, exponiendo el lado del xenoinjerto.
    3. Seque el exceso de solución y monte el cubreobjetos de vidrio con un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente.

8. Imágenes

  1. Captura imágenes bajo microscopía confocal con un objetivo de 40x. Utilice los siguientes parámetros de adquisición: una resolución de 1024 x 512 píxeles con un espaciado Z de 5 μm.

9. Análisis de la apoptosis por ImageJ

  1. Cargue (Fiji Is Just) el software ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads) y abra la imagen de archivo Z-stack (haga clic en Archivo | Abierto). En la ventana emergente, seleccione Visualización de pila/Hyperstack y haga clic en Aceptar.
  2. Superponga los diferentes canales seleccionando Imagen | Color | Hacer compuesto.
  3. Arrastre la barra Z en la parte inferior de la imagen para navegar por la imagen de la pila Z e identificar el área del xenoinjerto (células que son positivas para el rastreador de células fluorescentes. Ver paso 4.5) en el espacio perivitelino del pez cebra.
  4. Seleccione Point Tool y cuente el número de células humanas apoptóticas (positivo a rastreador de células fluorescentes y caspasa-3 hendida), como se muestra en el video complementario S1.
  5. Haga doble clic en el icono de la herramienta de puntos , cambie el contador y cuente el número total de núcleos de células humanas (núcleos de células CM-DiI positivas).

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Representative Results

Este protocolo describe el enfoque experimental para establecer zPDX a partir del adenocarcinoma pancreático humano primario. Se recogió, picó y tiñó una muestra tumoral con tinte fluorescente, como se describe en la sección 4 del protocolo. Las zPDX se establecieron con éxito mediante la implantación de un pedazo de tumor en el espacio perivitelino de 2 embriones de pez cebra dpf, como se describe en la sección 5 del protocolo. Como se describe en la sección 6 del protocolo, las zPDX se examinaron más a fondo para identificar los perfiles de sensibilidad a la quimioterapia de las células cancerosas derivadas del paciente. Por ejemplo, se probó la combinación de quimioterapia FOLFOXIRI (5-fluorouracilo, ácido folínico, oxaliplatino e irinotecán), ya que se utiliza como quimioterapia de primera línea para el adenocarcinoma ductal pancreático avanzado y en el cáncer colorrectal metastásico. Las imágenes de montaje completo de los zPDX se adquirieron como pilas Z en el microscopio confocal, y la inducción de apoptosis se analizó como se describe en las secciones 8 y 9 del protocolo. Como se muestra en la Figura 1A, B, la terapia combinada condujo a un aumento en la apoptosis celular en comparación con el grupo control. En el estudio de caso reportado aquí, se identificó un aumento estadísticamente significativo en la fracción de células apoptóticas en xenoinjertos implantados para el grupo tratado con FOLFOXIRI en comparación con el grupo control (Figura 1C).

Figure 1

Figura 1: zPDX de adenocarcinoma ductal pancreático humano 3 días después del tratamiento con FOLFOXIRI. Las membranas celulares se tiñeron con CM-DiI (rojo) y el tejido se xenoinjertó en el espacio perivitelino de 2 dpf AB de pez cebra de tipo salvaje. Las larvas fueron expuestas a una combinación de FOLFOXIRI (0,216 mg/mL de 5-fluorouracilo, 0,013 mg/ml de ácido folínico, 0,006 mg/ml de oxaliplatino, 0,011 mg/ml de irinotecán) o no expuestas (CTRL) durante 3 días, fijas e inmunoteñidas con anticuerpos caspasa-3 hendidas (cian) y contrastadas por Hoechst (núcleos azules). Las larvas fueron montadas con Aqua Poly-Mount en portaobjetos de microscopio de vidrio. (A1-3) Ejemplo representativo de una larva control (no expuesta a quimioterapia). No se observaron células positivas para caspasa-3 escindidas. (B1-3) Ejemplo representativo de una larva xenoinjertada 3 días después del tratamiento con FOLFOXIRI, mostrando una activación consistente de la caspasa-3 hendida. Las imágenes de montaje completo se capturaron en un microscopio confocal Nikon A1 con una cámara digital. Las líneas discontinuas muestran las áreas de xenoinjerto. (C) Cuantificación de células caspasa-3 y CM-DiI doble positivas en larvas xenoinjertadas tratadas con FOLFOXIRI en comparación con CTRL, trazadas como media ± SEM (n ≥ 12); p < 0,001, prueba U de Mann-Whitney. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: zPDX = xenoinjerto derivado del paciente de pez cebra; DPF = días después de la fertilización; FOLFOXIRI = 5-fluorouracilo, ácido folínico, oxaliplatino e irinotecán; CTRL = control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Solución/medio Composición, comentarios Propósito
Tumor medio (1x) Al medio RPMI-1640, añadir penicilina-estreptomicina (concentración final 100 U/mL) y anfotericina (concentración final 2,50 μg/mL).
Pez cebra mediano E3 (1x) Diluir el medio embrionario 60x E3 (NaCl 3 M, KCl 0.1 M, CaCl 2 0.2 M, MgSO4 0.2 M) en agua desionizada hasta una concentración final de trabajo de 1x.
E3 1% Pen-Strep Agregue 1 ml de penicilina-estreptomicina a 99 ml de medio de pez cebra E3. Mezclar por inversión. Conservar la solución a 4 °C
Ptw 0.1% Tween en PBS Inmunotinción de montaje completo
Búfer de bloqueo 10% suero de cabra, 1% DMSO, 1% BSA, 0.8% Triton X-100 en PTw Inmunotinción de montaje completo
Tampón de incubación 1% suero de cabra, 1% DMSO, 1% BSA, 0.8% Triton X-100 en PTw Inmunotinción de montaje completo
PBS-TS 10% suero de cabra, 1% Triton X-100 en PBS Inmunotinción de montaje completo
PBS-T 1% Triton X-100 en PBS Inmunotinción de montaje completo

Tabla 1: Soluciones y medios utilizados en el protocolo.

Figura suplementaria S1: La muestra tumoral de PDAC se tiñó de DiO (verde) y se xenoinjertó en el espacio perivitelino de 2 embriones de pez cebra dpf.Después de un tiempo de incubación de 3 días, los zPDX se inyectaron con yoduro de propidio (PI; rojo) de 2 μg / ml y luego se sometieron a imágenes confocales 3D. La viabilidad celular se verificó midiendo células PI-positivas del número total de células humanas (DiO positivo). Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: PDAC = adenocarcinoma ductal pancreático; DPF = días después de la fertilización; zPDX = xenoinjerto derivado del paciente con pez cebra. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario S1: Ejemplo de recuento apoptótico de células humanas, utilizando la herramienta multipunto de ImageJ. El video es una pila Z de un zPDX 3 días después de la implantación, adquirido después de la caspasa-3 escindida y la inmunotinción Hoechst 33258. Abreviaturas: zPDX = xenoinjerto derivado del paciente de pez cebra. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Los modelos in vivo en la investigación del cáncer proporcionan herramientas invaluables para comprender la biología del cáncer y predecir la respuesta al tratamiento del cáncer. Actualmente, se dispone de diferentes modelos in vivo , por ejemplo, animales modificados genéticamente (ratones transgénicos y knockout) o xenoinjertos derivados de pacientes a partir de células primarias humanas. A pesar de muchas características óptimas, cada una tiene varias limitaciones. En particular, los modelos antes mencionados carecen de una forma confiable de imitar el microambiente del tejido tumoral del paciente.

Se ha sugerido que el microambiente tumoral puede desempeñar muchos papeles importantes en la respuesta a fármacos18. Por lo tanto, para encontrar un modelo animal adecuado que mantenga el microambiente del tejido tumoral, se desarrolló un modelo PDX alternativo, utilizando trozos de tejido tumoral xenoinjertados en embriones de pez cebra de 2 dpf. El protocolo describe cómo realizar xenoinjertos en un gran número de embriones, lo que permite el cribado de fármacos de alto rendimiento, tanto como agentes únicos como en combinaciones.

El punto clave de este enfoque innovador es que preserva tanto las interacciones célula-célula como el microambiente tumoral, en comparación con los zPDX comúnmente realizados con suspensiones de una sola célula. El PDAC de una muestra quirúrgica se coloca inmediatamente en medios tumorales frescos y fríos, y el tumor se corta en pequeños fragmentos. El procedimiento general utilizado para generar el modelo zPDX se basa en la implantación directa de un fragmento del tumor de un paciente en el espacio perivitelino de un embrión de pez cebra de 2 dpf.

El modelo propuesto podría servir como una alternativa al modelo PDX basado en la digestión de la muestra de tejido tumoral derivada del paciente, seguida de una inyección directa en el saco vitelino o en el espacio perivitelino. Como lo demuestra el trabajo de Fior et al., es posible establecer un modelo zAvatar a partir de la disección enzimática de cánceres pancreatobilares resecados quirúrgicamente. La tasa de implantación osciló entre 44% y 64%, debido a la baja celularidad típica de la muestra pancreática tumoral y al estroma desmoplásico denso desfavorable19.

Sin embargo, la suspensión celular sólo reprodujo parcialmente el tumor original14. Por el contrario, el mPDX, construido mediante el trasplante directo de tejido tumoral en ratones inmunodeficientes, se parece mejor al tumor original, lo que puede ayudar mejor a los médicos a comprender el comportamiento del tumor y evaluar las respuestas individuales antes del tratamiento20. De hecho, el pequeño fragmento injertado mantiene el microambiente tumoral y preserva la diafonía entre células malignas y sanas, similar al tumor original21. La quimiosensibilidad o quimiorresistencia se reproduce mejor, con un impacto directo de la tecnología zPDX en el campo de la oncología traslacional14. El enfoque zPDX permite que cada paciente tenga su propio tumor desarrollado en un sistema vivo. Por lo tanto, esto representa una buena alternativa al uso de mPDX, donde el tejido tumoral es ortoinjertado intacto o desagregado en células, que luego son xenoinjertadas en modelos receptores de ratón13.

Este protocolo fue desarrollado en colaboración con patólogos que se encargan de seleccionar las piezas tumorales más adecuadas para el trasplante. Las muestras de tejido biológico siempre se han tomado de la muestra quirúrgica y nunca de una biopsia, ya que esta última generalmente se caracteriza por una escasez de tejido y, por lo tanto, está destinada solo a fines diagnósticos. El criterio para el muestreo de tejido generalmente no es marginal versus núcleo, sino más bien un área tumoral que está desprovista de hemorragia y necrosis. Por esta razón, siempre se realizó una sección histológica de criostato en una mitad de la muestra para un control de calidad inmediato del material. El presente estudio podría estar limitado por la capacidad de las células tumorales primarias para injertarse en el espacio perivitelino de embriones de pez cebra. Sin embargo, se observó una tasa de injerto del 80% de tejido viable 3 días después del trasplante, tanto después del almacenamiento a 4 °C (12/15 casos) como descongelado de -80 °C (10/12 casos), lo que sugiere que el tumor puede ser efectivamente criopreservado, con una viabilidad celular del 74% ± 2% (Figura Suplementaria S1). A pesar de esto, la tasa de éxito del injerto tisular varía entre los diferentes tumores de pacientes con PDAC; En consecuencia, el procesamiento rápido del tejido poco después de la resección quirúrgica, así como la prevención de la congelación, puede mejorar la eficiencia.

Algunos recursos técnicos también se sugieren en el protocolo para xenoinjertos exitosos. Por ejemplo, el uso del helicóptero estandarizó las dimensiones de las piezas xenoinjertadas. Para comprobar que las piezas de tejidos tumorales son iguales en dimensión después del corte, una posible solución es utilizar un vidrio de calibración para medir el diámetro de los fragmentos antes del xenotrasplante.

El uso del soporte del cilindro de agarosa al 1% es esencial tanto para colocar los embriones en un lado como para simplemente implantar un pedazo de tumor, así como para evitar que se rompa la microaguja. Debido a que los tumores exhiben una alta variabilidad, otra limitación del método es que la heterogeneidad intratumoral está menos representada en un fragmento en comparación con una suspensión celular. De hecho, pequeñas piezas de tejido podrían divergir en términos de poblaciones de células benignas y subclones tumorales. Para superar esta crítica, se debe utilizar un alto número de embriones inyectados para recapitular la heterogeneidad tumoral y reducir la variabilidad en el análisis. De acuerdo con el análisis estadístico, cada grupo requiere un tamaño muestral mayor que 15, considerando un tamaño del efecto de d = 2, y un poder de significación estadística del 80% y 95%. Este número es razonable, ya que un operador experto puede procesar alrededor de 40 embriones por hora.

Además de la metodología utilizada para generar el modelo zPDX, también se evidenció aquí que una combinación de FOLFOXIRI induce la apoptosis de células derivadas del paciente en el modelo zPDX. Al igual que con FOLFOXIRI, es posible probar la quimiosensibilidad zPDX a otros esquemas de quimioterapia, como los probados con éxito por Usai et al.11.

Además, se presenta la técnica de inmunotinción de montaje completo e imagen para proporcionar la cuantificación de la característica de interés. Para superar algunos problemas y conducir a una inmunotinción exitosa de montaje completo, se recomienda una solución de DMSO al 5% para permeabilizar los tejidos. En cuanto a la imagen confocal, las limitaciones de resolución del microscopio confocal podrían perjudicar la adquisición de las pilas más profundas de las larvas xenoinjertadas. Sin embargo, en el estudio, las células apoptóticas se cuentan del número total de células del paciente. Una reconstrucción tridimensional desde la base hasta la parte superior de la masa tumoral implantada, con un tamaño de paso de 5 μm, permite identificar todos los núcleos humanos, considerando la probabilidad de que el mismo núcleo pueda diseminarse dentro del plano Z anterior o siguiente. En consecuencia, el contador de herramientas multipunto ImageJ se puede utilizar para controlar y evitar contar la misma celda dos veces y para ejecutar el conteo doble en las mismas pilas Z (apoptóticas del total de células humanas) y puede rastrear fácilmente la apoptosis a nivel de una sola célula.

A pesar de sus limitaciones, el modelo zPDX tiene varias ventajas en comparación con los modelos in vivo : el ciclo de vida extremadamente rápido del pez cebra, pudiendo obtener grandes cantidades de animales en poco tiempo; la claridad óptica en las etapas de desarrollo; y, sobre todo, el impacto ético extremadamente bajo en la ventana de tiempo de 0-120 h después de la fertilización22. Hoy en día, un ensayo coclínico con zPDX es más barato que el realizado con PDX basados en ratones, ya que las cepas huésped inmunodeficientes requieren un alto costo de mantenimiento, así como métodos complejos de imagen para monitorear el crecimiento tumoral23. En conclusión, todos estos factores resaltan el potencial del modelo zPDX para su uso en ensayos coclínicos para predecir los perfiles de sensibilidad a la quimioterapia de pacientes con cáncer y para su uso por investigadores interesados en nuevos modelos para la detección de fármacos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Fondazione Pisa (proyecto 114/16). Los autores desean agradecer a Raffaele Gaeta de la Unidad de Histopatología de Azienda Ospedaliera Pisana por la selección de muestras de pacientes y el apoyo a la patología. También agradecemos a Alessia Galante por el apoyo técnico en los experimentos. Este artículo se basa en el trabajo de COST Action TRANSPAN, CA21116, apoyado por COST (Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorouracil Teva Pharma AG SMP 1532755
48 multiwell plate Sarstedt 83 3923
96 multiwell plate Sarstedt 82.1581.001
Acetone Merck 179124
Agarose powder  Merck A9539
Amphotericin Thermo Fisher Scientific 15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Merck MAB1281  1:200 dilution
Aquarium net QN6 Penn-plax 0-30172-23006-6
BSA Merck A9418
CellTrace Thermo Fisher Scientific C34567
CellTracker CM-DiI  Thermo Fisher Scientific C7001
CellTracker Deep Red  Thermo Fisher Scientific C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 9661S 1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  PanReac AppliChem ITW Reagents A3672,0250
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 501985
Folinic acid -  Lederfolin Pfizer
Glass capillaries, 3.5" Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials  VWR International WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A-21244   1:500 dilution
Goat serum Thermo Fisher Scientific 31872
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Irinotecan Hospira
Low Temperature Freezer Vials VWR International 479-1220
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
Microplate Mixer SCILOGEX 822000049999
Oxaliplatin Teva
Paraformaldehyde Merck P6148-500G
PBS Thermo Fisher Scientific 14190094
Penicillin-streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish 100 mm Sarstedt 83 3902500
Petri dish 60 mm Sarstedt 83 3901
Plastic Pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Poly-Mount Tebu-bio 18606-5
Propidium iodide Merck P4170
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Tricaine Merck E10521
Triton X-100  Merck T8787
Tween 20 Merck P9416
Vertical Micropipette Puller Shutter instrument P-30 

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References

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Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad
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Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing. J. Vis. Exp. (195), e63744, doi:10.3791/63744 (2023).

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