Nas sinapses excitatórias no cérebro de mamíferos, o glutamato liberado pré-sináptico ativa os receptores embutidos na membrana pós-sináptica 1,2. A força dessas conexões sinápticas sofre plasticidade dependente da experiência, uma propriedade que permite diversas formas de aprendizado e memória 3,4,5,6,7,8,9. Alterações patológicas no número de sinapses e suas propriedades de sinalização levam à alteração da atividade do circuito e do processamento de informações exibidas em vários distúrbios neurológicos e psiquiátricos 10,11,12. Como tal, há uma necessidade crítica de entender os mecanismos subjacentes que governam a conectividade neural e a força das conexões sinápticas.
Sinapses excitatórias se formam nas espinhas dendríticas, minúsculas protuberâncias pós-sinápticas contendo proteínas de andaime, receptores, fatores de sinalização, proteínas do citoesqueleto e organelas de tráfego 1,2,13,14,15,16. Esses compartimentos de sinalização do tamanho de mícrons permitem o controle da força sináptica sinapse por sinapse 13,16. A morfologia da coluna dendrítica varia ao longo do comprimento dos dendritos neuronais, com formas da coluna tipicamente descritas como finas, filopodiais, atarracadas, em forma de cogumelo ou ramificadas13. É importante ressaltar que a forma da coluna vertebral está correlacionada com a função sináptica e a estabilidade. Por exemplo, espinhas maiores têm maior número de receptores e maior força sináptica 16,17,18. Ao contrário dos espinhos finos, os espinhos maiores podem persistir por meses in vivo, uma propriedade que pode permitir conexões sinápticas estáveis e armazenamento de memória de longo prazo19,20.
A morfologia e a densidade da coluna vertebral ao longo de um dendrito são comumente rastreadas para sondar o grau de conectividade neural e as propriedades das sinapses excitatórias dentro de uma determinada região do cérebro, tanto em estados normais quanto em estados de doença13. Uma variedade de métodos foi desenvolvida para visualizar a morfologia da coluna vertebral em diferentes preparações de tecidos e sistemas de modelo usando microscopia de luz e fluorescência padrão, bem como microscopia de super-resolução e eletrônica (EM) 21 . Essas poderosas técnicas de imagem forneceram uma tremenda visão sobre nossa compreensão atual da organização, função e doença do cérebro. Esta coleção de métodos inclui importantes técnicas de imagem para monitorar a complexidade morfológica de dendritos e espinhos, bem como ferramentas optogenéticas para ativar e medir a atividade neural em dendritos e espinhos únicos.
Pekarek et al.22 apresentam um protocolo relativamente rápido e de alto rendimento para obter imagens e quantificar a estrutura de dendritos neuronais profundos no tecido nervoso intacto. Os autores realizam Clear Lipid-exchanged Acrilamida-hibridizado Rigid Imaging/imunocoloração/hibridização in situ compatível com Tissue-hYdrogel (CLARITY), uma técnica de limpeza de tecido que remove lipídios do tecido cerebral e ajuda a minimizar a dispersão de luz durante a imagem subsequente23. Após a limpeza, pilhas Z de neurônios expressando proteínas fluorescentes foram coletadas por microscopia confocal ou de dois fótons. A análise de imagens e a quantificação automatizada permitiram medições precisas da densidade e forma da coluna vertebral, bem como da complexidade da árvore dendrítica. Este protocolo permite a aquisição simultânea de imagens de estruturas que variam de espinhos únicos a árvores dendríticas e remove a etapa demorada e potencialmente prejudicial do corte de seção fina. Esta técnica será muito útil para pesquisadores que procuram quantificar mudanças na morfologia da coluna vertebral e complexidade dendrítica em tecidos cerebrais intactos após a introdução ou remoção de um gene (s) de interesse.
Desenvolvida há mais de 100 anos24, a coloração de Golgi continua sendo uma ferramenta poderosa para visualizar a organização do sistema nervoso e a morfologia neuronal. Nesse método, populações esparsas de neurônios são coradas por microcristalização de cromato de prata, permitindo a visualização de axônios, árvores dendríticas e espinhos25. Frankfurt e Bowman26 detalham um protocolo de impregnação rápida de Golgi para visualizar neurônios e espinhas dendríticas no hipocampo de ratos e no córtex pré-frontal medial. Os autores demonstram como preparar, corar e obter imagens de tecido para microscopia de luz subsequente, bem como quantificar a densidade da coluna vertebral ao longo das árvores dendríticas. O protocolo descrito aqui produz impregnação consistente e confiável de neurônios e reduz a exposição a produtos químicos tóxicos.
Embora a microscopia de luz e fluorescência seja adequada para a imagem de dendritos e espinhas, o EM permite a visualização com resolução nanométrica de estruturas pré e pós-sinápticas21. As abordagens EM são normalmente usadas para medir as propriedades ultraestruturais das sinapses, incluindo as dimensões da densidade pós-sináptica, bem como o número e o tamanho das vesículas sinápticas21. Nesta coleção, Śliwińska et al.27 fornecem um protocolo para adquirir imagens EM tridimensionais (3D) por varredura de face de bloqueio Serial B Electron Microscopy (SBEM) em tecido de camundongo hipocampal28,29. Especificamente, eles descrevem como preparar amostras, incorporar tecido em resina, montar e aparar amostras, realizar SBEM e analisar imagens para gerar reconstruções 3D. Este protocolo gera imagens de alto contraste com membranas bem definidas e pode ser adaptado para uma variedade de tipos de tecido.
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, os neurônios sofrem mudanças morfológicas dramáticas à medida que as conexões sinápticas são formadas e refinadas pela atividade neural30,31. Para rastrear a maturação neuronal no cerebelo em desenvolvimento, Chan et al.32 fornecem um protocolo para eletroporação pós-natal in vivo de neurônios granulares em desenvolvimento. Aqui, os pesquisadores injetaram e eletroporaram DNA no rombencéfalo de filhotes de camundongos pós-natais para transfectar uma população esparsa de neurônios com proteínas fluorescentes. A microscopia confocal de alta resolução e a imagem 3D permitiram aos pesquisadores caracterizar a morfologia dos dendritos e garras dendríticas em vários estágios do desenvolvimento pós-natal. É importante ressaltar que essa abordagem pode permitir a inserção ou remoção de genes que podem afetar a maturação e a função das células granulares e será de grande interesse para os pesquisadores que estudam o desenvolvimento cerebelar e a maturação dos neurônios granulares.
Finalmente, os protocolos de Cuentas-Condori e Miller33 empregam imagens de super-resolução34, optogenética35 e imagens de células vivas da dinâmica do cálcio36 para estudar a atividade dos neurônios GABAérgicos no nematóide C. elegans. Usando um microscópio confocal equipado para imagens de super-resolução37, os autores expressam proteínas fluorescentes em dendritos para medir a frequência de diferentes formas da coluna. Além disso, os autores avaliam a função neural pela expressão de uma proteína optogenética pré-sinapticamente e um indicador de cálcio pós-sinapticamente. Após a ativação da luz dos terminais, transientes de cálcio foram observados dentro das espinhas dendríticas individuais. Esses protocolos, juntamente com descobertas recentes38, destacam o uso empolgante de C. elegans como um poderoso sistema modelo para rastrear a morfologia da coluna vertebral e a atividade sináptica.
Juntos, os protocolos descritos nesta coleção de métodos serão adicionados à já rica caixa de ferramentas disponível para visualizar a estrutura e função neural21. A implementação desses métodos em estudos futuros provavelmente fornecerá informações adicionais sobre os processos que impulsionam a plasticidade sináptica relacionada ao aprendizado e os mecanismos celulares subjacentes aos estados de doença.