Descrevemos um sistema de imagem reprodutível, automatizado e imparcial para caracterizar a função de junção neuromuscular usando tecido muscular esquelético projetado por humanos e motoneurons optogenéticos. Este sistema permite a quantificação funcional da conectividade neuromuscular ao longo do tempo e detecta a função neuromuscular diminuída causada por neurotoxinas e soro do paciente myasthenia gravis.
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Artigo de método
Engenharia e Caracterização de um Modelo Optogenético da Junção Neuromuscular Humana
Neste artigo
Resumo
Resumo
Muitas doenças neuromusculares, como a miasthenia gravis (MG), estão associadas à disfunção da junção neuromuscular (NMJ), difícil de caracterizar em modelos animais devido a diferenças fisiológicas entre animais e humanos. A engenharia de tecidos oferece oportunidades para fornecer modelos in vitro de NMJs humanos funcionais que podem ser usados para diagnosticar e investigar patologias do NMJ e testar potenciais terapêuticas. Ao incorporar proteínas optogenéticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), geramos neurônios que podem ser estimulados com comprimentos de onda específicos de luz. Se o NMJ estiver saudável e funcional, um sinal neuroquímico do motoneuron resulta em contração muscular. Através da integração da optogenética e microfabagem com a engenharia de tecidos, estabelecemos uma metodologia imparcial e automatizada para caracterização da função NMJ utilizando análise de vídeo. Foi desenvolvido um protocolo padronizado para formação de NMJ, estimulação óptica com gravação simultânea de vídeo e análise de vídeo da contratude tecidual. A estimulação de motoneurons optogenéticos pela luz para induzir contrações musculares esqueléticas recapitula a fisiologia do NMJ humano e permite medições funcionais repetidas de NMJ ao longo do tempo e em resposta a várias entradas. Demonstramos a capacidade desta plataforma de mostrar melhorias funcionais na conectividade neuromuscular ao longo do tempo e caracterizar os efeitos nocivos dos anticorpos do paciente MG ou neurotoxinas na função NMJ.
Introdução
A junção neuromuscular (NMJ) é a sinapse química entre motoneurons (MNs) e células musculares esqueléticas (TLM) que permite contração muscular. Toxinas, como neurotoxina α-bungarotoxina (BTX), ou doenças neuromusculares (DNM) como a miasthenia gravis (MG) podem levar à degeneração do NMJ e reduções no controle muscular1. Modelos de tecido humano bioengenharia melhor recapituam melhor os mecanismos funcionais e fisiológicos dos NMJs humanos e oferecem maior potencial translacional do que os modelos animais.
Embora os modelos animais tenham avançado o entendimento da formação e função do NMJ, há ....
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Protocolo
Todas as linhas de celular para este trabalho foram criadas e utilizadas em conformidade com as diretrizes institucionais da Columbia University, NY, EUA.
1. Preparação do bioreator
- Faça moldes bioreatores
- Baixe um arquivo CAD bioreator do Arquivo CAD Suplementar ou crie um design próprio personalizado.
- Gere um caminho de ferramentas CNC a partir do modelo 3D usando o software CAM.
- Moldes acetal da máquina usando uma máquina de fresagem CNC.
- Fabricação de bioreatores
- Misture uma base de 10:1 para curar a mistura de agente de polidimtilsi....
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Resultados
As junções neuromusculares foram geradas por motoneurons optogenéticos derivados do hiPSC com tecido muscular esquelético não optogenético. Myoblasts esqueléticos primários humanos (SkM) foram semeados nas plataformas e diferenciados em mosbos multinucleados usando o protocolo de 2 semanas. Os motoneurons optogenéticos foram diferenciados separadamente, mas em paralelo com a diferenciação do miotube, e depois semeados na plataforma (Figura 1). Os tecidos começaram a se contrair em resposta à.......
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Discussão
Este sistema é um modelo de tecido humano 3D projetado que combina optogenética e processamento de vídeo para permitir uma avaliação automatizada e imparcial da função NMJ. Utilizando um protocolo padronizado, demonstramos a capacidade de medir mudanças na função NMJ durante o desenvolvimento fisiológico e caracterizar os efeitos nocivos de patologias como exposição a neurotoxinas e myasthenia gravis paciente sera.
Estudos anteriores relataram a capacidade de modelar MG com motoneurons optogen.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio ao financiamento do NIH [números de subvenção EB025765 e EB027062], doD [número de prêmio W81XWH-18-1-0095], e da UCSF Health Innovation via Engineering (HIVE Fellowship). Agradecemos a ajuda e orientação do Núcleo de Células-Tronco da Universidade de Columbia por sua ajuda e orientação com a reprogramação celular.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| SkMDC | Cook Myosite | P01059-14M | |
| Media e Suplementos | |||
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634-020 | |
| Solução de albumina de soro bovino | Millipore Sigma | A9576-50ML | |
| Suplemento G-5 (100X) | ThermoFisher Scientific | 17503-012 | |
| Antibiótico Seletivo Geneticina (Sulfato G418) (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 10131-035 | |
| Insulina, Millipore Humano Recombinante | Sigma | 91077C-100MG | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 100-0276 | |
| Kit de Mídia de Crescimento MyoTonic | Cook Myosite | MK-4444 | |
| N-2 Suplemento | ThermoFisher Scientific | 17502-048 | |
| NbActiv4 500 mL | BrainBits LLC | Nb4-500 | |
| Meio Neurobasal | ThermoFisher Scientific | 21103-049 | |
| Meio Neurobasal-A | ThermoFisher Scientific | A13710-01 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | |
| Plasticware | |||
| 30 mm sistema de cubo de gaiola | ThorLabs | CM1-DCH, CP33, ER1-P4 e ER2-P4 | |
| 37 µ m Filtro Reversível, grande | Stem Cell Technologies | 27250 | |
| Filtro de excitação passa-curta de 546 nm | Semrock | FF01-546/SP-25 | |
| Espelho dicróico de 573 nm | Semrock | FF573-Di01– Filtro de emissão passa-longa 25x36 | |
| 594 nm | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Filtro de excitação passa-longa 594 nm | Semrock | BLP01-594R-25 | |
| Azul (470nm) LED Rebel em uma piaPAD-II 10mm Base Quadrada - 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-B4 | |
| Carclo 29.8° Óptica de Feixe Circular Fosco de 10 mm - Pernas Integradas | LuxeonStarLEDs | 10413 | |
| Corning 60 mm Ultra-Low Attachment Culture Dish | Corning | 3261 | |
| Dissipador de calor | LuxeonStarLEDs | LPD-19-10B | |
| Optics | |||
| pluriStrainer 400 µ m, pacote de 25, estéril | PluriSelect | 43-50400-03 | |
| pluriStrainer 500 µ m, pacote de 25, estéril | PluriSelect | 43-50500-03 | |
| Vermelho (627nm) Rebel LED em uma piaPAD-II 10mm Base Quadrada - 65 lm @ 700mA | LuxeonStarLEDs | SP-05-R5 | |
| diafragma de íris acionado por anel | ThorLabs | SM1D12D | |
| T-Cube Drivers LED | ThorLabs | LEDD1B, KPS101 | |
| Molds | |||
| Espaçadores Hexagonais Roscados Fêmeas, 3 1/2" 10-32, Parcialmente Rosqueado 1/2" | McMaster | 91920A046 | |
| Perfil Baixo C-Clamp | McMaster | 1705A12 | |
| Fatores de crescimento | |||
| Adenosina 3&e;,5′-monofosfato cíclico | Millipore Sigma | A9501-1G | |
| CHIR 99021, 10 mg | Tocris | 4423/10 | |
| DAPT 10 mg | R& D Systems | 2634/10 | |
| CNTF Humano, grau de pesquisa, 5 µ g | Miltenyl Biotec | 130-096-336 | |
| Proteína de Vitronectina Humana, CF | R& D Systems | 2349-VN-100 | |
| Proteína de Vitronectina Humana, CF R | & D Systems | 2349-VN-100 | |
| IGF1 Proteína Humana Recombinante | ThermoFisher Scientific | PHG0078 | |
| Proteína de camundongo Laminina, natural | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Proteína Agrin Humana Recombinante | R& D Systems | 6624-AG-050 | |
| Proteína GDNF humana recombinante, CF 50ug | R& D Systems | 212-GD-050/CF | |
| Neurotrofina Humana Recombinante 3 100 ug | Cell Sciences | CRN500D | |
| Neurotrofina-4 Humana Recombinante | Cell Sciences | CRN501B | |
| Recombinante Human Sonic Hedgehog / Shh (C24II) N-Terminus | R& D Systems | 1845-SH-100 | |
| Recombinante Humano/Murino/Rato BDNF 50 ug | Peprotech | 450-02 | |
| Ácido Retinóico, 50 mg | Millipore Sigma | R2625-50 | |
| SAG Agonista Suavizado | Millipore Sigma | 566660 | |
| SB431542 10 mg | Stem Cell Technologies | 72234 | |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyl Biotec | 130-103-925 | |
| Vitronectina de plasma humano | Millipore Sigma | V8379-50UG | |
| Y-27632 dicloridrato | Tocris | 1254 | |
| Anticorpos | |||
| &alfa;-actinina mAb (Camundongo IgG1) | Abcam | ab9465 | |
| Colina Acetiltransferase (ChAT) (Cabra) | Millipore | AB144P | |
| Desmin mAb (Mouse IgG1) | Dako | M076029-2 | |
| Cadeia Pesada de Miosina (MHC) (Mouse IgG2b) | DSHB | MF20 | |
| Equipamento | |||
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | |
| Estágio automatizado | Instrumentação científica aplicada | MS- 2000 XYZ | |
| Limpador de plasma expandido | Harrick Plasma | PDC-001( 115V) | |
| Invitrogen Countess Automated Cell Counter | Marshal Scientific | I-CACC | |
| IX-81 Microscópio de fluorescência invertida | Olympus | IX-ILL100LH | |
| Series Stage Top Incubator System | Tokai Hit STX | TOKAI-HIT-STXG | |
| Zyla 4.2 sCOMS | Camera Andor Technology | ZYLA-4.2P-CL10 | |
| Software | |||
| Arduino Software (IDE) | Arduino | IDE 1.8.19 | |
| Mastercam | Mastercam | Mastercam para Solidworks | |
| Matlab | Matlab | R2021b | |
| Elementos NIS | Nikon | Pesquisa | |
| Básica Solidworks 3D CAD | Solidworks Solidworks | Padrão |
Referências
- Al-bassam, W., et al. Characteristics, incidence, and outcome of patients admitted to the intensive care unit with myasthenia gravis. Journal of Critical Care. 45, 90-94 (2018).
- Vila, O. F., Qu, Y., Vunjak-Novakovic, G.
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Reimpressões e permissões
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