Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

Khanit Sa-ngiamsuntorn; Piyanoot Thongsri; Yongyut Pewkliang; Suparerk Borwornpinyo; Adisak Wongkajornsilp

doi:10.3791/63761

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Artigo de método

Um Modelo de Hepatócito Competente Examinando a Entrada do Vírus da Hepatite B através do Polipeptídeo Cotransportador de Taurocolato de Sódio como Alvo Terapêutico

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DOI:

10.3791/63761

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10 de maio de 2022

Khanit Sa-ngiamsuntorn¹ , Piyanoot Thongsri² , Yongyut Pewkliang² , Suparerk Borwornpinyo³^,⁴ , Adisak Wongkajornsilp⁵

¹Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Mahidol University, ²Program in Translational Medicine, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University, ³Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University, ⁴Department of Biotechnology, Faculty of Science, Mahidol University, ⁵Department of Pharmacology, Faculty of Medicine Siriraj Hospital, Mahidol University

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para triagem de compostos anti-vírus da hepatite B (HBV) visando estágios do ciclo de vida pré e pós-entrada viral, usando calorimetria de titulação isotérmica para medir a afinidade de ligação (K_D) com o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio do hospedeiro. A eficácia antiviral foi determinada através da supressão de marcadores do ciclo de vida viral (formação, transcrição e montagem viral do cccDNA).

Resumo

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) tem sido considerada um fator de risco crucial para o carcinoma hepatocelular. O tratamento atual só pode diminuir a carga viral, mas não resultar em remissão completa. Um modelo eficiente de hepatócitos para a infecção pelo HBV ofereceria um ciclo de vida viral realista que seria crucial para a triagem de agentes terapêuticos. A maioria dos agentes anti-HBV disponíveis tem como alvo os estágios do ciclo de vida após a entrada viral, mas não antes da entrada viral. Este protocolo detalha a geração de um modelo de hepatócitos competente, capaz de rastrear agentes terapêuticos visando os estágios do ciclo de vida pré-entrada viral e pós-entrada viral. Isso inclui o direcionamento da ligação do polipeptídeo de cotransporte de taurocolato de sódio (NTCP), formação de cccDNA, transcrição e montagem viral com base em imHC ou HepaRG como células hospedeiras. Aqui, o ensaio de inibição de entrada do HBV usou curcumina para inibir as funções de ligação e transporte do HBV via NTCP. Os inibidores foram avaliados quanto à afinidade de ligação (K_D) com o NTCP usando calorimetria de titulação isotérmica (ITC) - uma ferramenta universal para triagem de drogas do HBV com base em parâmetros termodinâmicos.

Introdução

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é considerada uma doença com risco de vida em todo o mundo. A infecção crônica pelo VHB é carregada de risco de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular¹. O tratamento anti-HBV atual concentra-se principalmente na entrada pós-viral usando análogos de nucleos(t)ide (NAs) e interferon-alfa (IFN-α)^2,3. A descoberta de um inibidor da entrada do VHB, o Myrcludex B, identificou um novo alvo para os agentes anti-VHB⁴. A combinação de inibidores de entrada e NAs no HBV crônico diminuiu significativamente a carga viral em compar....