A membrana do porão é essencial para morfogênese tecidual e órgão durante o desenvolvimento. Para entender melhor os mecanismos que levam à colocação adequada dessa estrutura, o protocolo apresentado descreve métodos para visualizar e caracterizar o tráfico intracelular e a secreção de proteínas de membrana de porão em células epiteliais utilizando microscopia confocal e super-resolução.
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Artigo de método
Imagem confocal e super-resolução de tráfico intracelular polarizado e secreção de proteínas de membrana de porão durante Drosophila Oogenesis
Neste artigo
Resumo
Resumo
A membrana do porão (ML) - uma folha especializada de matriz extracelular presente no lado basal das células epiteliais - é fundamental para o estabelecimento e manutenção da morfologia do tecido epitelial e da morfogênese do órgão. Além disso, o BM é essencial para a modelagem tecidual, servindo como uma plataforma de sinalização, e fornecendo forças externas para moldar tecidos e órgãos. Apesar dos muitos papéis importantes que o BM desempenha durante o desenvolvimento normal e as condições patológicas, as vias biológicas que controlam o tráfico intracelular de vesículas contendo BM e como a secreção basal leva à deposição polarizada das proteínas BM são mal compreendidas. O epitélio folicular do ovário Drosophila é um excelente sistema modelo para estudar a deposição basal de proteínas de membrana BM, pois produz e secreta todos os principais componentes do ovário BM. A imagem confocal e super-resolução combinada com o processamento de imagens em tecidos fixos permite a identificação e caracterização de fatores celulares especificamente envolvidos no tráfico intracelular e na deposição de proteínas BM. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para coloração e imagem de vesículas contendo BM e BM depositado usando proteínas marcadas endogenosamente no epitélio folicular do ovário de Drosophila . Este protocolo pode ser aplicado para abordar questões qualitativas e quantitativas e foi desenvolvido para acomodar a triagem de alto rendimento, permitindo a identificação rápida e eficiente dos fatores envolvidos no tráfico intracelular polarizado e secreção de vesículas durante o desenvolvimento do tecido epitelial.
Introdução
A membrana do porão (BM) é uma fina folha de matriz extracelular aderente a células em camadas (ECM) crítica para estrutura epitelial e morfogênese1. Compreende ~50 proteínas e é encontrado onipresentemente subjacente às células epiteliais e endoteliais, e células esqueléticas, lisas e cardíacas e adipócitos 1,2,3. Os três principais componentes do BM no lado basal das células epiteliais são Colágeno IV, Perlecan e Laminins. O BM está por trás das células epiteliais e é responsável por muitas funções, incluindo separação e barreira tecidual, cresciment....
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Protocolo
1. Preparação de moscas para dissecções de ovário
- Coloque 10-15 moscas fêmeas de melanogaster Drosophila (1-2 dias de idade) do genótipo desejado em um frasco estreito contendo ~8 mL de mosca drosophila granulado com uma pequena quantidade de levedura granulada 2-3 dias antes da dissecção a 25 °C. Adicionar alguns machos ao frasco pode aumentar a produção de câmara de ovos. No entanto, certifique-se de que o número total de moscas não exceda 20, pois isso pode afetar negativamente o desenvolvimento do ovário.
NOTA: A descrição de machos e fêmeas de Drosophila, e dicas e conselhos úteis para cientistas sem exper....
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Resultados
Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para imagem eficiente e precisa e caracterizar o tráfico intracelular e secreção de proteínas BM em células epiteliais polarizadas, como a FE do ovário de Drosophila . Em seguida, fornecemos resultados antecipados obtidos usando os métodos descritos, bem como conselhos úteis e potenciais armadilhas. Para isso, é utilizado O Vkg-GFP, um Vkg com etiqueta endógena (Drosophila Col IV). No entanto, os mesmos resultados podem ser alcançados com outras proteínas B.......
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Discussão
O BM é fundamental para morfogênese embrionária e de órgãos, e funções fisiológicas adultas. Além disso, o BM atua como uma plataforma de sinalização para o estabelecimento e manutenção da polaridade epitelial e fornece tecidos com suporte2. No entanto, os mecanismos que regulam a colocação adequada das proteínas BM são mal compreendidos. Uma melhor compreensão das vias biológicas dedicadas ao tráfico intracelular e à secreção polarizada das proteínas BM requer uma análise cuidadosa dos componente.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores são gratos a Julie Merkle por seus comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R15GM137236 para O.D. As imagens confocal e super-resolução foram adquiridas utilizando um Zeiss LSM 900 com Airyscan 2, comprado com 2018748 de subvenção de ressonância magnética da NSF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 faloidina | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 de 66µ M) |
| Alexa Fluor 647 faloidina | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 de 66µ M)) |
| Anti-GM130 Anticorpo | abcam | ab30637 | Para Mancha de Golgi (colocalização); use como concentração de 7µ g / uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Levedura de padeiro de montagem |
| média (levedura seca ativa) | Genesee Scientific | 62-103 | Para engordar os overies para dissecção Albumina |
| soro bovino (solução a 30%) | Sigma-Aldrich | A7284 | Para solução de bloqueio |
| de poços de depressão | Microscopia eletrônica Ciências | 7156101 | Para dissecção (lâmina de concavidade de vidro pode ser usada em vez disso) |
| Agulha de dissecação | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi contra Crag |
| Estoque de mosca: Linha Viking-GFP Drosophila (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Estoque de mosca: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Conduza a expressão de RNAi de Crag no Fórceps FE | ||
| (Dumont 5) | Ferramentas de Belas Ciências | 11251-30 | Para dissecação |
| Microscopia Eletrônica | Lâmina de Concavidade de Vidro | 7187804 | Para dissecação (poços de depressão podem ser usados em seu lugar) |
| IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Anticorpo secundário (anticorpo GM130) (5 µ g/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Limpadores de limpeza de tarefa delicada |
| Microscópio Estéreo Fluorescente Leica M165 FC | Leica | Para imagens de ovário | |
| Lâminas de microscópio | Corning | 294875X25 | Lâminas de microscópio |
| Nutating plataforma rocker | Corning Life Sciences | 6720 | Para fixação e coloração de ovário |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldeído 20% Solução | Microscopia Eletrônica Ciências | Fisher Científico: 15713 | Para PFA 4% |
| Phosphate Buffered Comprimidos Salinos | Fisher BP2944100 científico | Para solução | |
| PBS Prolong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Montagem Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Vidro de cobertura para lâminas de microscópio |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Para PBST |
| Zeiss LSM 900 com Airyscan 2 | Microscópio confocal e de super-resolução | Zeiss | |
| Microscópio estereoscópico Zeiss Stemi 305 Microscópio de | dissecação | Zeiss | |
| Zeiss Zen versão 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Aquisição e processamento de imagens |
Referências
- Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
- Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
- Jayadev, R., ....
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Reimpressões e permissões
