Passagem rápida, econômica e livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas em células alimentadoras por adesão mediada pelo ácido etilenodiaminotetracético

Resumo

Para evitar as limitações associadas à passagem enzimática ou mecânica de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC ou hiPSC mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA.

Resumo

Células-tronco pluripotentes humanas (células-tronco embrionárias humanas, hESCs e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, hiPSCs) foram originalmente cultivadas em diferentes tipos de células alimentadoras para manutenção em um estado indiferenciado em cultura de longo prazo. Essa abordagem tem sido suplantada em grande parte por protocolos de cultura sem alimentadores, mas estes envolvem reagentes mais caros e podem promover uma transição para um estado primed, o que restringe a capacidade de diferenciação das células. Tanto em condições de alimentação quanto de alimentador, a colheita de colônias hESC ou hiPSC para passagem é um procedimento necessário para a expansão das culturas.

Para fornecer um procedimento fácil e de alto rendimento para a passagem de hESCs/hiPSCs cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método de colheita usando desadesão eliciada pelo quelante de cálcio ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Avaliamos o rendimento e a qualidade das células passageiras resultantes comparando esta abordagem com a abordagem original de colheita mecânica, na qual as colônias são isoladas com bisturi sob um microscópio (a colheita mecânica foi escolhida como um comparador para evitar a variabilidade reagente associada à colheita enzimática).

Em um conjunto de experimentos, duas linhagens diferentes de hESC foram mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos humanos do prepúcio. Cada linhagem foi submetida a múltiplas passagens usando EDTA ou colheita mecânica e avaliada quanto ao tamanho e morfologia das colônias, densidade celular, expressão de marcadores de caule, diferenciação para as três camadas germinativas em corpos embrionários e aberrações genômicas. Em outro conjunto de experimentos, utilizou-se a colheita baseada em EDTA em duas linhagens diferentes de hiPSC e obtivemos resultados semelhantes. A desadesão induzida pelo EDTA economizou tempo e proporcionou maior rendimento de colônias de tamanho mais favorável e morfologia mais uniforme em relação à colheita mecânica. Também foi mais rápida que a colheita enzimática e não foi propensa à variabilidade do lote enzimático. O método de desadesão induzida por EDTA também facilita a transferência de linhagens hESC/hiPSC da cultura baseada em células alimentadoras para condições livres de alimentador, se desejado para uso e análise a jusante.

Introdução

A manutenção adequada de hESCs e hiPSCs in vitro é uma metodologia básica e conveniente para várias vias de pesquisa em biologia celular humana e do desenvolvimento. Devido ao impulso inerente de hESCs e hiPSCs para diferenciar, manter o estado indiferenciado in vitro requer cuidados e atenção especiais. Assim, o desenvolvimento de protocolos custo-eficientes para a manutenção e passagem de hESCs e hiPSCs com a menor variabilidade metodológica possível é de grande utilidade geral.

Originalmente, as hESCs e hiPSCs foram cultivadas em diferentes tipos de células alimentadoras para auxiliar na cultura de longo prazo e na manutenção do estado indiferenciado ^1,2,3. Mais recentemente, o cultivo em condições livres de alimentadores tornou-se a norma, pois evita lidar com células alimentadoras^{por completo 4}. No entanto, alguns laboratórios e instalações centrais ainda cultivam hESCs ou hiPSCs em células alimentadoras. A cultura livre de alimentadores é mais dispendiosa, pois requer o uso de meios de cultura de composições especiais e alguma forma de revestimento da superfície de cultura para garantir a aderência da colônia (componentes principais da matriz extracelular [MEC] ou um composto comercial de MEC, ou o uso de placas revestidas comercialmente disponíveis). O gasto não é trivial e apresenta um potencial obstáculo financeiro para alguns laboratórios interessados em realizar pesquisa e desenvolvimento baseados em hESC ou hiPSC. Além disso, a cultura em condições livres de alimentadores tende a conduzir as hESCs e hiPSCs a um estado menos ingênuo do que é mantido em células alimentadoras⁵, o que pode comprometer a diferenciação subsequente e levar a variações genéticas⁶.

Historicamente, a passagem de hESCs e hiPSCs cultivadas em células alimentadoras envolveu colheita mecânica - usando um bisturi para excisar colônias sob um microscópio⁷ - mas esta foi posteriormente amplamente suplantada pela digestão enzimática com ou sem raspagem suave para isolar colônias ou células dissociadas. A colheita mecânica é tediosa e requer microcirurgia de precisão. A colheita enzimática pode variar em eficiência devido a diferenças enzimáticas lote a lote e tende a favorecer a dissociação completa, o que promove a morte celular a menos que seja combatido por inibidores de ROCK ^8,9 e aumenta a incidência de cariótipos anormais⁹.

Para aproveitar o menor custo e o maior potencial de diferenciação do cultivo de hESCs e hiPSCs em células alimentadoras, evitando as desvantagens da colheita mecânica e enzimática, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC e hiPSC mantidas em uma camada alimentadora de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA. Comparamos o rendimento, a variabilidade e a qualidade das células-tronco com aqueles obtidos com a colheita mecânica (não comparamos com a digestão enzimática devido à variabilidade adicional que essa abordagem implica). Observamos que a desadesão mediada por EDTA também funciona bem para transferir colônias de culturas baseadas em alimentadores para condições livres de alimentadores, se desejado para uso e análises a jusante. Este método fornece uma transição com um método de passagem consistente, uma vez que a adesão induzida por EDTA é uma abordagem popular empregada para culturas livres de alimentadores.

Protocolo

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Cultivo de células de fibroblastos humanos e preparação da camada de células alimentadoras

1. Sementes de 0,5 × 10⁶ fibroblastos de prepúcio humano (doravante denominados "células alimentadoras") por cada frasco de cultura T-75 (número de frascos conforme necessário) com 20 mL de Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) com (p/) 10% de soro fetal bovino (SFB), doravante denominado "meio de células alimentadoras".
2. Quando as células alimentadoras atingirem 90% de confluência, retirar o meio e lavar 3x com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco por frasco para evitar a inibição da tripsina por fatores no meio. Adicionar 2 ml de tripsina-EDTA a cada balão e colocar o(s) frasco(s) numa incubadora a 37 °C/5% CO₂ durante 5 min ou até que as células alimentadoras se tenham desprendido do(s) frasco(s). Observe o descolamento das células ao microscópio como agregados flutuantes de células ou células únicas.
3. Adicionar 5 mL de meio de célula alimentador pré-aquecido fresco a cada frasco para inativar o EDTA-tripsina e suspender suavemente as células alimentadoras por pipetagem.
4. Transfira as células alimentadoras para um tubo de centrífuga de 15 mL. Tampe o tubo e pastilha as células alimentadoras por centrifugação a 200 × g por 5 min.
5. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet da célula alimentadora. Em seguida, ressuspenda cuidadosamente o pellet em 4 mL de meio alimentador de células frescas. Certifique-se de que as células alimentadoras sejam completamente ressuspensas antes da contagem usando uma câmara de contagem de células ou outro aparelho de contagem de células.
6. Adicionar 0,5 × 10⁶ células alimentadoras ao número necessário de novos frascos de cultura T-75 para expansão e adicionar 20 mL de meio de célula alimentador fresco a cada frasco. Incubar o(s) frasco(s) de cultura numa estufa a 37 °C/5% CO₂ até que as células alimentadoras atinjam 90% de confluência.
   NOTA: As células do alimentador podem ser usadas até, pelo menos, a passagem 25.
7. Calcular o número de células alimentadoras necessárias para o número de placas de cultura de tecidos de 35 mm que serão usadas para a cultura das hESCs/hiPSCs.
   NOTA: Geralmente, 3,0 × 10⁵ células alimentadoras por placa de cultura de tecidos são suficientes para gerar uma camada confluente de células alimentadoras.
8. Para evitar a proliferação das células alimentadoras, certifique-se de que elas sejam presas mitoticamente de duas maneiras.
   NOTA: Para ambos os métodos, um grande lote de células alimentadoras mitoticamente presas pode ser gerado e congelado em alíquotas para uso posterior.
   1. Realizar a parada mitótica por irradiação gama, transferindo todas as células alimentadoras necessárias para um tubo de centrífuga de 50 mL e completando com meio de célula alimentadora para um volume total de 5 mL. Transporte imediato à temperatura ambiente para uma máquina de irradiação gama e irradiar para deter mitoticamente as células alimentadoras (300 kV e 10 mA por 20 min).
      NOTA: Um atraso no transporte pode levar à fixação indesejada das células alimentadoras à parede do tubo de centrífuga de 50 mL. Se o transporte exigir mais do que alguns minutos, certifique-se de que as células alimentadoras permaneçam suspensas durante o transporte, agitando continuamente o tubo.
   2. Realizar a parada mitótica usando mitomicina C transferindo todas as células alimentadoras necessárias em 5 mL de meio de célula alimentadora para um tubo de centrífuga de 50 mL e, em seguida, adicionar 15 mL de meio de célula alimentadora contendo 20 μg/mL de mitomicina C e incubar em uma incubadora de 37 °C/5% de CO2 por 3 h. Adicionar 20 mL de PBS a 37 °C, pellet as células por centrifugação a 200 × g por 5 min, repetir a lavagem com PBS mais duas vezes e ressuspender em meio alimentador.
9. Depois que as células alimentadoras tiverem sido mitoticamente presas, retorne à capa de cultura de tecidos e plaqueie as células alimentadoras a 3,0 × 10⁵ células por placa de cultura de tecido de 35 mm, da seguinte forma. Certifique-se de que as células alimentadoras estão totalmente ressuspensas, adicione o meio celular alimentador para atingir uma concentração de células alimentadoras de 1,5 × 10⁵ por mL e adicione 2 mL dessa suspensão de células alimentadoras a cada placa de cultura de tecidos de 35 mm.
10. Transfira os pratos de cultura para uma incubadora a 37 °C/5% CO₂ . Para garantir uma distribuição uniforme das células alimentadoras, mova as placas de cultura lenta mas firmemente na prateleira da incubadora para frente e para trás 3x, seguido de uma pausa, e então execute a mesma ação da esquerda para a direita 3x. Não mova a louça novamente e feche suavemente a porta da incubadora.
11. Após 24 h, trocar do meio de célula alimentadora para IMDM com 10% de reposição de soro (SR). Substitua este meio a cada três dias. As células alimentadoras estão prontas para uso após os primeiros 3 dias.

2. Colheita mecânica das colônias hESC ou hiPSC

1. Meio hESC pré-quente consistindo de 80% de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM), 20% SR, 1 mM substituto de glutamina 100x, 1 mM de aminoácidos não essenciais (NEAA), 1 mM de penicilina/estreptomicina (P/S), 0,1 mM de 2-mercaptoetanol e 10 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos básicos (bFGF). O meio hESC é usado para o cultivo de hESCs ou hiPSCs nas células alimentadoras.
2. Tomar pratos frescos de cultura de tecidos de 35 mm contendo células alimentadoras mitoticamente presas e substituir o meio de células alimentadoras por 1,2 mL de meio hESC contendo bFGF pelo menos 30 minutos antes da transferência das colônias hESC/hiPSC.
3. Colocar uma placa de cultura contendo colônias de hESC/hiPSC em células alimentadoras mitoticamente presas sob um microscópio com aumento de 10x colocado dentro de uma capela de fluxo laminar. Use um bisturi estéril para cortar cuidadosamente em torno da circunferência de cada colônia e, em seguida, corte cada colônia em 5-6 pedaços aproximadamente iguais. Levante cuidadosamente os pedaços da colônia com a ponta da lâmina de bisturi para que eles se desprendam da camada de células alimentadoras e flutuem livremente no meio.
   1. Tente evitar regiões das colônias que contenham células diferenciadoras, que aparecem como ilhas de células menores com núcleos menos distintos em comparação com hESCs/hiPSCs dentro de uma colônia.
4. Transfira as colônias flutuantes livremente com uma pipeta de 1 mL para as novas placas de cultura contendo as células alimentadoras. Tente manter as colônias separadas para que elas não cresçam umas nas outras mais tarde. Mova os pratos de cultura cuidadosamente para uma incubadora de células e evite perturbar os pratos até o dia seguinte.
5. No dia seguinte, adicionar cuidadosamente 600 μL de meio hESC contendo bFGF a um volume final de 1,8 mL. Substitua o meio hESC + bFGF todos os dias até a próxima passagem (geralmente após 1 semana).

3. Colheita das colônias hESC ou hiPSC usando desadesão mediada por EDTA

1. Tomar pratos de cultura frescos com células alimentadoras mitoticamente presas e mudar de IMDM c/ 10% SR para 1,2 mL de meio hESC + bFGF pré-aquecido pelo menos 30 minutos antes da transferência das colônias.
2. Manusear uma placa de cultura contendo colônias hESC ou hiPSC de cada vez. Remova o meio hESC + bFGF e lave as colônias com 1 mL de DPBS à temperatura ambiente para eliminar possíveis células não anexadas e detritos celulares. Adicionar 1 ml de EDTA 0,5 mM e incubar durante 1 min a 37 °C. Se a capela de fluxo laminar tiver uma placa de aquecimento, execute esta etapa e as etapas da seção 4 na placa de aquecimento para melhor desaderência.
3. Após 1 min de incubação, remova a solução de EDTA e adicione cuidadosamente 1 mL de meio hESC + bFGF usando uma pipeta de 1 mL. Triturar suavemente com a mesma pipeta para liberar as colônias da camada de células alimentadoras. Continue a triturar cuidadosamente até que a camada de células alimentadoras se solte e se dobre sobre si mesma em um aglomerado separado. Retire a camada de célula do alimentador com a ponta da pipeta.
4. Transferir as colônias hESC/hiPSC suspensas com uma nova pipeta de 1 mL para novas placas de cultura contendo as células alimentadoras e o meio hESC + bFGF, dividindo na proporção de 1:5. As colônias tendem a se distribuir uniformemente dentro de cada novo prato de cultura, mas facilitam isso movendo o prato suavemente de um lado para o outro. Substitua o meio hESC + bFGF todos os dias até a próxima passagem (geralmente após 1 semana).

Resultados

Nos ensaios e comparações documentados abaixo, foram utilizadas duas linhagens de hESC (H9 e HS429, da WiCell e do Instituto Karolinska, respectivamente) e duas linhagens de hiPSC (NCS001 e NCS002, ambas geradas pelo Norwegian Core Facility for Human Pluripotent Stem Cells). Os dados apresentados nas figuras e tabelas são das linhas hESC, mas resultados totalmente semelhantes foram obtidos a partir das linhas hiPSC.

Em nossas mãos, a colheita mecânica resultou na divisão das colônias em aproximadamente cinco a seis touceiras de ~200-250 μm de diâmetro, enquanto que com a desadesão induzida pelo EDTA seguida de trituração, cada colônia foi dividida em ~10-20 touceiras de ~60 μm de diâmetro. Estimamos que o número de células em cada aglomerado colhido com EDTA é de ~20. Como é impraticável dividir uma colônia em touceiras desse tamanho com bisturi, nesse aspecto, a adesão induzida pelo EDTA é superior, pois gera aglomerados de tamanho mais favorável à sobrevivência das células da colônia^10,11.

As colônias hESC/hiPSC colhidas com EDTA também foram mais homogêneas em tamanho e forma em comparação com as colônias colhidas mecanicamente (Figura 1A-F). Isso ocorre porque o corte necessário para a colheita mecânica gera bordas irregulares e tamanhos de aglomeração variados. Para avaliar isso quantitativamente, avaliamos a circularidade da colônia (como uma medida de quão arredondadas eram as bordas da colônia; um valor de 1 indica um círculo perfeito) 5 dias após a passagem usando o protocolo ImageJ-win64¹². A circularidade das colônias foi significativamente menor nas colônias colhidas mecanicamente (colheita mecânica: 0,61 ± 0,10; Colheita à base de EDTA: 0,84 ± 0,01; n = 10, p < 0,001, teste U de Mann-Whitney, U = 10).

A densidade celular nas colônias colhidas e replaqueadas, que é uma medida das interações célula-célula pós-colheita durante a formação da colônia, foi semelhante com a colheita baseada em EDTA e a colheita mecânica (Tabela 1 e Figura 1G,H). As colônias colhidas mecanicamente apresentaram maior tendência a desenvolver necrose em suas regiões centrais (Figura 1J). Isso provavelmente se deveu à variabilidade na forma e, particularmente, no tamanho dos aglomerados celulares isolados mecanicamente, pois quando esses aglomerados são muito grandes, eles podem facilmente dobrar-se sobre si mesmos ao serem transferidos para novos pratos de cultura. Não foi o caso das colônias colhidas com EDTA, que exibiram uniformemente aspecto translúcido com bordas distintas (Figura 1I).

Usando a colheita baseada em EDTA, fomos capazes de coletar essencialmente todas as colônias que haviam sido estabelecidas em um poço dentro de 2-3 min. Usando a colheita mecânica, coletar todas as colônias em um poço seria tedioso e demorado. Nós normalmente conseguimos coletar apenas ~30%, ou ~20-25 colônias, usando colheita mecânica, e isso levou ~20 min. Da mesma forma, usando digestão de colagenase seguida de raspagem suave, era tipicamente difícil colher todas as colônias, embora o procedimento total levasse apenas alguns minutos. Assim, a colheita baseada em EDTA é tão rápida ou mais rápida do que a colheita enzimática e mais eficiente do que a colheita mecânica ou enzimática.

Para avaliar o efeito dos diferentes métodos de colheita sobre a estraculo e a pluripotência, primeiramente submetemos as colônias obtidas após 20 passagens utilizando coleta mecânica ou baseada em EDTA à análise por qPCR (Figura 2) e coloração imunocitoquímica (Figura 3 e Figura 4) para marcadores de caule. As colônias obtidas por ambos os métodos exibiram uma expressão estável de marcadores de caule tanto em nível de RNAm quanto de proteína. Em seguida, avaliamos a pluripotência pela diferenciação para as três camadas germinativas nos corpos embrionários (Figura 5 e Figura 6). Os corpos embrionários gerados a partir das hESCs ou hiPSCs obtidas após 20 passagens usando qualquer um dos métodos continham uma mistura de células expressando marcadores comumente avaliados para ectoderma, mesoderma e endoderma.

Finalmente, avaliamos a incidência de aberrações genômicas em hESCs e hiPSCs passadas por cada método usando análise genética baseada em qPCR (veja a Tabela de Materiais). As colônias obtidas após 20 passagens usando qualquer um dos métodos de colheita exibiram alguns exemplos de desvio modesto de um padrão cromossômico diploide de referência (as anormalidades avaliadas foram aquelas comumente associadas à reprogramação de hiPSCs, mas também podem ser obtidas em hESCs) (Figura 7). No entanto, o padrão desses desvios foi essencialmente o mesmo nas colônias obtidas após ambos os métodos de colheita, indicando que eles não estavam ligados ao método de colheita.

Figura 1: Morfologia da colônia e densidade celular após colheita mecânica ou baseada em EDTA. (A-F) Imagens representativas de campo claro de colônias hESC de H9 estabelecidas em cultura livre de alimentadores por 5 dias após 20 passagens usando colheita mecânica à base de (A-C) EDTA ou (D-F). (G,H) Imagens representativas de fluorescência da densidade celular em colônias H9 hESC estabelecidas após 20 passagens usando (G) colheita mecânica baseada em EDTA ou (H). Os núcleos celulares são corados com DAPI. (I,J) Imagens representativas de campo claro de colônias H9 hESC estabelecidas após 20 passagens usando (I) colheita mecânica baseada em EDTA ou (J). Notar a região central necrótica na colônia colhida mecanicamente (seta em J). Todas as imagens foram adquiridas 5 dias após a 20ª passagem. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: hESC = human embryonic stem cell; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Expressão do mRNA do marcador de haste em duas linhagens de hESC (H9 e HS429) geradas após colheita mecânica ou baseada em EDTA. Reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real dos marcadores indicados em hESCs H9 (painel superior) e HS429 (painel inferior) após uma única passagem usando colheita mecânica, após 20 passagens usando colheita mecânica e após 20 passagens usando colheita baseada em EDTA (diluição 1:5). O nível de expressão é relativo ao do gene housekeeping ACTB (beta-actina). As barras de erro indicam o desvio padrão. Abreviaturas: hESC = human embryonic stem cell; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Expressão de proteínas marcadores de caule na linhagem H9 hESC após diferentes condições de colheita. Coloração representativa por imunofluorescência de colônias H9 hESC colhidas mecanicamente (A-E) antes de nova passagem, (F-J) após 20 passagens usando colheita mecânica, e (K-O) após 20 passagens usando colheita baseada em EDTA. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: hESC = human embryonic stem cell; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Expressão de proteínas marcadores de caule na linhagem HS429 hESC após diferentes condições de colheita. Coloração representativa por imunofluorescência de colônias HS429 hESC colhidas mecanicamente (A-E) antes de posterior passagem, (F-J) após 20 passagens usando colheita mecânica e (K-O) após 20 passagens usando colheita baseada em EDTA. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: hESC = human embryonic stem cell; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Expressão de marcadores para as três camadas germinativas em corpos embrionários gerados a partir da linhagem H9 hESC após colheita mecânica ou baseada em EDTA. Coloração representativa por imunofluorescência de marcadores para (fileiras A e D) ectoderma (ECTO, TUJI), endoderma (fileiras B e E), endoderma (ENDO, AFP) e mesoderma (fileiras C e F) (MESO, SMA). EBs gerados (A-C) após 20 passagens de colheita mecânica ou (D-F) após 20 passagens de colheita à base de EDTA. Barras de escala = 40 μm. Abreviaturas: hESC = human embryonic stem cell; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; EBs = corpos embrionários. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Expressão de marcadores para as três camadas germinativas em corpos embrionários gerados a partir da linhagem HS429 hESC após colheita mecânica ou baseada em EDTA. Coloração representativa por imunofluorescência de marcadores para (fileiras A e D) ectoderma (ECTO, TUJI), endoderma (fileiras B e E), endoderma (ENDO, AFP) e mesoderma (fileiras C e F) (MESO, SMA). EBs geradas (A-C) após 20 passagens de colheita mecânica (A-C) ou (D-F) após 20 passagens de colheita à base de EDTA. Barras de escala = 40 μm. Abreviaturas: hESC = human embryonic stem cell; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; EBs = corpos embrionários. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Análise genética baseada em qPCR de aberrações genômicas comuns nas linhagens ESC HS9 e HS429 e na linha NCS002 iPSC após 20 passagens usando colheita mecânica ou baseada em EDTA. A linha de base no valor 2 representa diploidia normal em todos os marcadores cromossômicos. Um valor de 1 ou 3 representaria uma perda ou ganho, respectivamente, do marcador cromossômico indicado em todas as células. Valores intermediários entre 1 e 2 ou entre 2 e 3 indicam a presença de perda ou ganho do marcador indicado em uma fração das células. Note-se que o padrão de aberrações é semelhante nas duas condições de colheita. Abreviaturas: ESC = células-tronco embrionárias; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético; iPSC = células-tronco pluripotentes induzidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Densidade celular (células/mm2)
H9	significar	STDEV
Colheita mecânica antes de nova passagem	3918	263.3
Colheita mecânica 20 vezes	3868	197.7
Colheita EDTA 20 vezes	4080	127.8
HS429	significar	STDEV
Colheita mecânica antes de nova passagem	5249	565.4
Colheita mecânica 20 vezes	5247	726.3
Colheita EDTA 20 vezes	4963	448.8

Tabela 1: Comparação das densidades celulares nas colônias das duas linhagens hESC (H9 e HS429) geradas após colheita mecânica ou baseada em EDTA. As densidades celulares foram avaliadas após uma única passagem por colheita mecânica, após 20 passagens por colheita mecânica ou após 20 passagens por colheita à base de EDTA (diluição de 1:5). Em todos os casos, n = 5 colônias.

Discussão

Descrevemos um método rápido e econômico para a colheita de hESCs e hiPSCs cultivadas em células alimentadoras usando desadesão mediada por EDTA e comparamos este método principalmente com o método convencional de colheita mecânica com bisturi. Também comparamos a colheita baseada em EDTA com a colheita enzimática com relação à velocidade do método, mas não aos aspectos da qualidade da colônia resultante. A razão para isso é que a colheita enzimática é inerentemente mais variável e tem sido associada a uma maior prevalência de aberrações genômicas⁵, o que poderia obscurecer as diferenças entre os métodos.

Nós demonstramos que a colheita baseada em EDTA é mais rápida e eficiente do que qualquer um dos outros métodos e gera colônias menores e morfologicamente mais homogêneas do que a colheita mecânica. Esta última característica é benéfica em relação à sobrevivência celular, uma vez que os aglomerados maiores obtidos com a coleta mecânica são propensos à necrose central, enquanto a digestão enzimática tende a gerar hESCs e hiPSCs isoladas, que são mais propensas à apoptose e requerem tratamento extra, por exemplo, com inibidores de ROCK, para sobreviver. A colheita baseada em EDTA pode ser usada por pelo menos 20 passagens. Os métodos de colheita mecânica e baseados em EDTA são comparáveis quando se trata de densidade de células de colônia, mRNA e expressão proteica de genes do tronco, diferenciação das três camadas germinativas em corpos embrionários e anormalidades genômicas. Se o objetivo for eficiência, maior rendimento, menor variabilidade e manejo mais suave das hESCs e hiPSCs, a colheita baseada em EDTA é preferível.

Também observamos que a colheita baseada em EDTA de hESCs e hiPSCs cultivadas em células alimentadoras é uma maneira barata de manter um estado mais ingênuo e fornece uma transição suave de cultura baseada em alimentador para cultura livre de alimentador onde isso é desejável.

Etapas críticas dentro do protocolo
As etapas mais críticas da desadesão mediada por EDTA são a seção 3 do protocolo (incubação na solução de EDTA) e a seção 4 (trituração). Se a exposição à solução de EDTA for superior a 1 min, o risco de dissociação completa para células individuais aumenta. Isso também pode ocorrer se a trituração for muito prolongada ou muito dura. Este último é afetado pelo tamanho da ponta da pipeta. O ideal é utilizar pipetas de cultura celular de 1 mL, como descrito aqui. Usar um tipo diferente de pipeta com um diâmetro de ponta menor é arriscado.

Solucionando problemas
Se as células alimentadoras continuarem a proliferar, a parada mitótica não foi eficaz, e um novo lote deve ser tomado e o procedimento reiniciado. Se as colônias não se soltarem da camada de células alimentadoras, deve-se certificar-se de que não há Ca²⁺ no EDTA e que a placa de cultura contendo as colônias seja bem lavada com PBS para remover qualquer meio de cultura celular restante antes de adicionar o EDTA. O excesso de dissociação, que gera células isoladas ou aglomerados celulares muito pequenos, pode surgir devido à trituração excessiva e comprometer o estabelecimento de novas colônias. O grau de trituração deve ser determinado empiricamente em ensaios do protocolo para confirmar que os aglomerados celulares resultantes têm ~60 μm de diâmetro. Se a camada alimentadora se desprender espontaneamente da placa de cultura, especialmente antes que as hESCs/hiPSCs estejam prontas para a colheita, pode ser porque as células alimentadoras não foram usadas dentro de ~7 dias após serem preparadas. Portanto, o período de tempo de uso das células alimentadoras deve ser monitorado cuidadosamente. Se a camada alimentadora se dissociar durante a exposição ao EDTA (algo que nunca observamos com as células alimentadoras usadas aqui), o tipo de célula alimentadora ou seu método de cultura devem ser alterados.

Limitações da técnica
A principal limitação da técnica é que ela requer inspeção visual do processo de adesão para alcançar um resultado bem-sucedido. Isso significa que os usuários devem aprender a identificar quando as colônias se liberam da camada de células alimentadoras e a camada de células alimentadora se solta do substrato. No entanto, isso não é difícil e, em nossa experiência, novos usuários da técnica podem dominá-la dentro de alguns testes.

Há também uma possibilidade inerente de que as hESCs ou hiPSCs colhidas possam estar contaminadas por algumas células alimentadoras. Se a intenção for transferir para condições não alimentadoras ou isolar as hESCs ou hiPSCs para ensaios, essa contaminação comprometeria a pureza. Observamos que com as células alimentadoras aqui utilizadas (fibroblastos de prepúcio humano), é extremamente difícil dissociar a camada de células alimentadoras, mesmo com digestão enzimática (não mostrada). Uma vez que a camada de células alimentadoras não dissociadas é removida in toto, é provável que a contaminação das hESCs ou hiPSCs colhidas seja desprezível. Como as células alimentadoras são, além disso, mitoticamente presas, qualquer contaminação acabaria diminuindo a zero com a passagem adicional das hESCs ou hiPSCs.

Importância em relação aos métodos existentes
A norma atual para o cultivo de hESCs e hiPSCs é fazê-lo em condições livres de alimentadores, para as quais o uso de EDTA para passagem é generalizado. A cultura livre de alimentadores depende do uso de meios especialmente formulados e substratos de cultura que garantam a aderência. Esses reagentes acarretam um gasto adicional que pode ultrapassar alguns orçamentos laboratoriais. Além disso, a cultura em condições livres de alimentadores tem sido associada a um potencial de diferenciação perturbado devido à falta de fatores específicos nos meios de cultura livres de alimentadores e a uma consequente transição do estado virgens para o estado primed. O crescimento em células alimentadoras mitoticamente presas evita essa transição e pode reduzir os custos gerais a um nível gerenciável, facilitando assim o uso mais amplo de células-tronco pluripotentes em pesquisas laboratoriais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	15575020
tubos de centrífuga de 15 mL	Sarstedt	62.554.502
2-mercaptoetanol	Gibco	31350-010
Tubos de centrífuga de 50 mL Sarstedt		62.547.254
Fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)	PeproTech	AF-100-18B-250UG
Marca Bü rker Chamber	Fisher Scientific	10628431
bisturis descartáveis no.15	Susann-Morton	505
DPBS (1x) sem Ca/Mg	Gibco	14190-094
Placa de cultura de tecidos Easy Grip, 35 x 10 mm	Pipeta Falcon	353001
Eppendorf 1 mL	Eppendorf Eppendorf
pipeta 200 μ L	Eppendorf
FBS (Soro Fetal Bovino)	Gibco	10270-106
Ponta do filtro 1,000 μ L	Sarstedt	70.1186.210
Ponta do filtro 200 μ L	Sarstedt	70.760.211
Gamma Cell 3000 Máquina de irradiação ELAN (alternativamente, use Mitomicina C para interromper a proliferação)	Melhor Theratronics	BT / MTS 8007 GC3000E
Glutamax 100x	Gibco	35050-038
Matriz Reduzida do Fator de Crescimentogel	Corning	734-0269
H9 linha hESC WiCell		WAe009-A
Kit de Análise Genética hPSC	Stem Cell Technologies	#07550
HS429 linha hESC	ECACC	KIe024-A
Fibroblastos Humanos do Prepúcio - linha CRL2429	ATTC	CRL2429
IMDM (1x)	Gibco	21980-032
linhas iPSC	Norueguesa Core Facility para Células-Tronco Pluripotentes Humanas	NCS001 & NCS002
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Microscópio Confocal de Varredura a Laser ou equivalente (usamos o LSM 700 da Zeiss)	Zeiss
	CETI
Mitomicina C	Sigma Aldrich	M4287
Aminoácidos não essenciais (NEAA)	Gibco	11140.035
Pipetas, plástico 10 mL	Sarstedt	86.1254.001
Pipetas de plástico, 5 mL	Sarstedt	86.1253.001
Reposição de soro (SR)	Gibco	10828-028
Filtros estéreis 0,22 Umm	Sarstedt	83.1826.102
Balão de cultura T-75	ThermoScientific	156499
Trypan Blue Stain (0,4 %)	Gibco	15250-061
Tripsina-EDTA, 500 mL	25300062		Gibco