A microscopia de expansão de retenção de etiquetas (LR-ExM) permite imagens de super-resolução e rotulagem de alta eficiência

A microscopia de expansão (ExM) tem sido utilizada por pesquisadores desde que foi introduzida pela primeira vez como uma abordagem conveniente para alcançar imagens de super resolução com microscópios convencionais, como epifluorescência e microscópios confocais 1,2,3,4,5,6,7 . Usando o ExM, é possível alcançar uma resolução lateral de ~70 nm, mesmo com microscópios confocais regulares. Quando o ExM é combinado com imagens de super-resolução, a resolução é melhorada ainda mais. Por exemplo, pode-se alcançar uma resolução de aproximadamente 30 nm com microscopia de iluminação estruturada (SIM) e aproximadamente 4 nm de resolução com microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM)^1,5.

No entanto, a baixa eficiência de rotulagem é um problema crítico com os métodos padrão do ExM. A perda de fluorescência pode variar com base no tipo de grupos fluorescentes e no tempo de digestão. Em média, no entanto, tem sido relatado que mais de 50% dos fluoróforos são perdidos após a polimerização e as etapas de digestão proteica do ExM, o que é prejudicial à qualidade de imagem ^3,4.

Assim, foi desenvolvida a microscopia de expansão de retenção de rótulos (LR-ExM), que pode reter eficientemente os rótulos e reduzir a perda de sinal¹. A principal inovação do LR-ExM é o uso de um conjunto de âncoras trifuncionais em vez de simplesmente usar corantes fluorescentes - como no procedimento padrão ExM - para coloração de proteínas de interesse. Esses ligadores trifuncionais consistem em três partes: (1) o conector (por exemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS)) para se conectar ao anticorpo, (2) a âncora (por exemplo, metacrilamida (MA)) para ancorar proteínas ao polímero e (3) o repórter (por exemplo, biotina ou digoxigenina (DIG)) para se conjugar a um corante orgânico. As âncoras trifuncionais sobrevivem às etapas de polimerização e digestão de proteínas e, portanto, evitam a perda de fluoróforo.

Além disso, este método tem um grande potencial, uma vez que é compatível com tags enzimáticas de auto-rotulagem, como SNAP ou CLIP. As abordagens enzimáticas de marcação têm alguns benefícios em relação à abordagem de imunocoloração quanto à alta especificidade e eficiência de marcação ^8,9,10.

Neste manuscrito, um procedimento detalhado do LR-ExM é demonstrado. LR-ExM é um método altamente eficaz e flexível para alcançar alta resolução espacial com maior eficiência de rotulagem.

1. Cultura celular

1. Use células U2OS cultivadas em meio 5A de McCoy suplementado com 10% de FBS a 37 °C em 5% de CO₂.
2. Células de cultura em um vidro de cobertura de câmara removível de 16 poços (área de cultura de 0,4 cm²) para facilitar o manuseio.

2. Fixação e permeabilização

NOTA: As condições de fixação e permeabilização dependem dos protocolos de imunocoloração otimizados. A seguir, um protocolo de fixação e permeabilização para co-imunocorantes microtúbulos e cavidades revestidas de clatrina (CCPs).

1. Quando a contagem de células atingir ~0,04 x 10 6, fixe células com 100 μL de paraformaldeído (PFA) a 3,2% em tampão PEM (PIPES 100 mM, EGTA 1 mM e 1 mM MgCl₂, pH^6,9) por 10 min à temperatura ambiente (Tabela 1).
   NOTA: A fixação usando PFA é realizada em um exaustor de segurança certificado.
2. Lave as células três vezes por 5 min cada com 200 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Permeabilizar células com o tampão de permeabilização de 100 μL à temperatura ambiente por 15 min (Tabela 1).
   NOTA: Prossiga com a marcação o mais rápido possível para evitar a degradação da proteína-alvo, RNA ou DNA e para obter um resultado ideal. Se for necessário, no entanto, as amostras fixas podem ser armazenadas por um tempo alongado (até um mês) em um buffer PBS a 4 °C. Substitua qualquer PBS evaporado e proteja a amostra do fotobranqueamento.

3. Estreptavidina endógena e bloqueio de biotina

1. Incubar as células com a solução de estreptavidina diluída num tampão bloqueador celular (100 μL) durante 15 min à temperatura ambiente (Tabela 1).
2. Enxaguar brevemente com 200 μL de tampão de bloqueio celular.
3. Incubar células com 100 μL de solução de biotina diluída em tampão de bloqueio celular durante 15 min à temperatura ambiente.
   Observação : ao usar uma abordagem de marcação de auto-rotulagem, como o uso de marcas SNAP ou CLIP, ignore a etapa 4 e prossiga para a etapa 5.1: abordagem de marcação de auto-rotulagem.

4. Coloração de anticorpos primários

1. Incubar células com anticorpo anti-α-tubulina de rato (diluição 1:500) e anticorpo anti-clatrina de cadeia pesada de coelho (diluição 1:100) em 100 μL de tampão de bloqueio celular durante 16 h a 4 °C ou 1 h à temperatura ambiente. Dobrar o tempo de incubação para as amostras de tecido.
2. Lave as amostras quatro vezes com 200 μL de PBS por 5 min cada.

5. Coloração de anticorpos secundários específicos para LR-ExM

1. Conjugar anticorpos IgG com os ligantes trifuncionais como N-hidroxisuccinimida (NHS) - metacrilamida (MA) -Biotina ou NHS-MA-Digoxigenina (Dig) (Figura 1B). A síntese das âncoras trifuncionais e a conjugação dos anticorpos secundários são previamente introduzidas em Shi et ^al.1. Abordagem de marcação automarcante: Conjugar anticorpos IgG com os ligantes trifuncionais, como MA-benzilguanina (BG)-Biotina ou MA-benzilcitosina (BC)-Dig (Figura 1B). A síntese de âncoras trifuncionais e a conjugação dos anticorpos secundários são previamente introduzidas em Shi et ^al.1.
2. Incubar células com os anticorpos secundários burro anti-coelho-Dig-MA (diluição 1:100) e burro anti-rato-biotina-MA (diluição 1:100) em 100 μL de tampão bloqueador celular por 1 h à temperatura ambiente. O dobro desse tempo de incubação para as amostras de tecido.
3. Lave as amostras quatro vezes em 200 μL de PBS por 5 min cada.

6. Ancoragem adicional

1. Incubar células com glutaraldeído (GA) a 0,25% em PBS (100 μL) por 15 min à temperatura ambiente, a fim de ancorar as proteínas no hidrogel. Alternativamente, use 25 mM ácido metacrílico N-hidroxisuccinimida éster (MA-NHS) para ancoragem. Uma hora de incubação à temperatura ambiente é encorajada.
2. Lave as amostras três vezes em PBS por 5 min cada.

7. Gelificação

NOTA: A velocidade de expansão é determinada pelo tempo de difusão de sal e água para fora ou para dentro do gel; assim, a fundição de géis finos acelera o tempo de expansão.

1. Remova a estrutura superior da placa de gel de 16 poços. Adicionar 40 μL de solução de monômero a cada poço para condicionar as células no gelo. Incubar no gelo por 5 min.
   1. Para preparar uma solução de monómero, ver Tabela 2.
2. Prepare a solução de gelificação no gelo. Adicionar água destilada dupla e acelerador de tetrametiletilenodiamina (TEMED) a 10% de N,N,N′ à solução de monómero (TEMED a 10%: solução de monómero = 1:47); ainda não adicione o iniciador (Tabela 3).
3. Para uma câmara de cultura celular com uma área de 0,4 cm², use um volume de solução de gelificação de cerca de 40 μL. Prepare 45 μL de solução de gelificação para cada poço.
4. Adicionar persulfato de amónio a 10% (APS) à solução de gelificação, incubar sobre gelo e pipetar imediatamente 40 μL de solução de gelificação em cada junta de silicone bem sobre gelo. Incubar sobre gelo por 3 min (10% APS:10% TEMED:solução de monômero = 1:1:47).
5. Proteger a amostra da luz e mover o vidro de cobertura da placa de Petri de 10 cm para uma incubadora de 37 °C durante 1,5 h para gelificação. Para manter a umidade do gel durante a incubação de 37 °C, cubra a placa de Petri com a tampa e coloque algumas gotas de água na placa de Petri.

8. Digestão

1. Após a gelificação, retire o vidro para separar o gel e transfira o gel para a placa de 6 poços. Digerir as células embutidas com 2 mL de tampão de digestão (Tabela 1) durante a noite à temperatura ambiente ou 4 h a 37 °C. Use pelo menos 10 vezes o excesso de volume de tampão de digestão.
2. Lave os géis com pelo menos um volume de água 10 vezes superior ao volume final do gel. Repita a etapa de lavagem quatro vezes por 20 a 30 minutos de cada vez. O gel se expande em cerca de duas vezes em cada dimensão.
   NOTA: As amostras de gel podem ser armazenadas por até 1 mês em um tampão PBS a 4 °C. Substitua qualquer água evaporada para evitar a secagem e proteja a amostra da luz durante o armazenamento. Para evitar a degradação das âncoras trifuncionais, as amostras devem ser coradas o mais rapidamente possível após a digestão e lavagem.

9. Coloração por fluorescência pós-digestão

1. Incubar géis em volume de 2 mL de tampão de coloração estreptavidina (STV)/digoxigenina (DIG) com corante STV de 2 a 5 μM e/ou corante anti-DIG por 24 h à temperatura ambiente. Mantenha as amostras no escuro.

10. Expansão

1. Lave e expanda o gel quatro vezes com excesso de água (2-3 mL) por 30 min a 1 h de cada vez.
2. Para facilitar a visualização das células sob microscopia fluorescente, core as células com DAPI durante a terceira das cinco lavagens. Diluir a concentração de DAPI (5 mg/ml, armazenada a 4 °C) em diluições 1:5.000 em água de lavagem. Incubar o gel com uma solução de DAPI-água (2 mL) por 30 min a 1 h.
3. Lave mais duas vezes com 3 mL de água.
4. Expanda os géis em qualquer prato plano que seja grande o suficiente para conter as amostras. Os géis expandidos que são preparados em vidro de cobertura de 0,4 cm² área se encaixam bem em uma placa de 6 poços com fundo de vidro.
   NOTA: Amostras coradas pós-expansão podem ser armazenadas por até 4 meses em um tampão PBS a 4 ° C. Adicione água suficiente para evitar a secagem e proteja a amostra do fotobranqueamento. Repita a etapa de expansão e coloração DAPI antes da imagem. Para evitar qualquer risco de degradação do fluoróforo, as amostras precisam ser fotografadas o mais rápido possível.

11. Imagens

1. Revestir a câmara de imagem do fundo de vidro de 6 poços com poli-L-lisina a 0,01% (3 mL cada) para imobilizar as amostras de gel.
2. Transfira amostras de gel para a câmara de imagem revestida.
3. Fotografe as amostras com quaisquer escopos de fluorescência desejados.

Os poços revestidos de clatrina (CCPs) são imunocorados usando âncoras trifuncionais (Figura 1B) e o LR-ExM é realizado conforme descrito na Figura 1A. LR-ExM (Figura 2C,E) apresenta intensidade de fluorescência muito maior em comparação com a microscopia de expansão de retenção de proteínas (proExM, Figura 2A) ou biotina-ExM (Figura 2B); o sinal para LR-ExM foi cerca de seis vezes maior que o proExM (Figura 2D). O LR-ExM pode efetivamente capturar pequenas estruturas, como CCPs, que são ainda menores do que o limite de difração (Figura 2F,G).

Alguns resultados representativos do LR-ExM são apresentados usando a abordagem de imunocoloração. Microtúbulos e CCPs são co-imunocorados usando âncoras trifuncionais, incluindo NHS-MA-DIG e NHS-MA-biotina (Figura 3A,B). O LR-ExM está disponível para a abordagem enzimática baseada em tags. O resultado é demonstrado usando âncoras trifuncionais BG-MA-biotina (para SNAP-tag) e BC-MA-DIG (para CLIP-tag) na Figura 3C-F. Além disso, pode-se combinar tanto a imunocoloração quanto a abordagem protein-tag no LR-ExM, como mostra a Figura 3G-J. A partir desses resultados, confirma-se que o LR-ExM é benéfico para obter imagens de alta qualidade com maior eficiência e resolução de rotulagem.

O LR-ExM também apresenta ótimo desempenho em amostras de tecido. O LR-ExM é realizado no tecido cerebral de camundongos por co-imunocoloração do marcador pré-sináptico Fagote e do marcador pós-sináptico Homer1. As duas etiquetas são claras e bem separadas, que suportam alta resolução e eficiência de rotulagem (Figura 4A-E).

Figura 1: Fluxo de trabalho da Microscopia de Expansão de Retenção de Etiquetas (LR-ExM). (A) Fluxo de trabalho do LR-ExM. (B) Esquemas de âncoras trifuncionais. Esse número foi modificado a partir de Shi et al.1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação de imagens confocais de Microscopia de Expansão de Retenção de Sinal (A-C) (ExM) de fossas revestidas de clatrina (CCPs) em células U2OS indiretamente imunocoradas para cadeia pesada de clatrina (POI). (A) ExM de retenção de proteínas (ProExM) usando anticorpos secundários conjugados com AF488. (B) ExM com marcação pós-expansão usando anticorpos conjugados com biotina. (C) LR-ExM usando anticorpos conjugados com âncoras trifuncionais NHS-MA-biotina. As amostras em B e C são coradas após expansão com estreptavidina-AF488. (D) Quantificação da intensidade de A-C. As barras de erro representam SD. n = 3 para cada caso. As razões de expansão de comprimento para imagens em A, B, C e E-G são 4,3, 4,5, 4,6 e 4,3, respectivamente. A razão de expansão do comprimento para as amostras utilizadas na parcela D é de 4,5 ± 0,2. Barras de escala, 500 nm (A-C e E) e 100 nm (F e G). Todas as barras de escala estão em unidades de pré-expansão. Arb. u., unidades arbitrárias; STV, estreptavidina. Todas as imagens são obtidas utilizando-se um microscópio confocal de disco giratório (Nikon CSU-W1) com objetiva de imersão em água de 60x (NA1.27). Esse número foi modificado a partir de Shi et al.1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados representativos do LR-ExM usando microscópios confocais. (A,B) LR-ExM imagens confocais de microtúbulos marcados com anticorpos secundários conjugados com NHS-MA-biotina (magenta) e CCPs marcados com anticorpos secundários conjugados com NHS-MA-DIG-(verde) em uma célula U2OS. (B) Visão ampliada. (C-F) Imagens confocais LR-ExM de CCPs e/ou mitocôndrias em células HeLa marcadas usando abordagem de etiqueta de proteína (C) clatrina marcada com tag SNAP, (D) TOMM20 marcada com tag CLIP e (E) imagem de duas cores. (F) Visão ampliada. (G) Imagens LR-ExM confocais de duas cores usando uma combinação de abordagem de imunocoloração (NPC, vermelho quente) e abordagem de marcação de proteína (lamina A/C marcada com SNAP (ciano)). (H) Visão ampliada. (I,J) Visualizações de canais individuais de H. Observe que o fundo citoplasmático em G é causado pelo anticorpo anti-NUP153. As taxas de expansão de comprimento para imagens em A-B: 4,7, C-D: 4,4, E-F: 4,5 e G-J é de 4,5. Barras de escala,1 μm para A, 200 nm para B e F, 500 nm para C-E, 2 μm para G e 500 nm para H, I e J. Todas as barras de escala estão em unidades de pré-expansão. Todas as imagens são obtidas utilizando-se um microscópio confocal de disco giratório (Nikon CSU-W1) com objetivo de imersão em água de 60x (NA1.27). Esse número foi modificado a partir de Shi et al.1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados representativos do LR-ExM em amostras de tecido. (A) Imagem confocal LR-ExM de corte cerebral de camundongo indiretamente imunocorada para o marcador pré-sináptico Fagote (magenta) e o marcador pós-sináptico Homer1 (verde). (B,C) Imagens ampliadas de sinapses. (D,E) Perfis de intensidade transversal ao longo dos eixos longos da caixa amarela. O fagote é marcado com anticorpos secundários conjugados com NHS-MA-DIG, e o Homer1 é marcado com anticorpos secundários conjugados com NHS-MA-biotina. Todas as amostras são coradas após a expansão com estreptavidina-AF488 e ou anti-digoxina-AF594. As taxas de expansão de comprimento para imagens em A-C são de 4,2. Barras de escala, 1 μm (A) e 200 nm (B,C). Todas as barras de escala estão em unidades de pré-expansão. Todas as imagens são obtidas utilizando-se um microscópio confocal de disco giratório (Nikon CSU-W1) com objetivo de imersão em água de 60x (NA1.27). Esse número foi modificado a partir de Shi et al.1. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Produtos químicos e tampões Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Solução de monômero Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Solução de gelificação Clique aqui para baixar esta Tabela.

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.