Provocando a interação entre células assassinas naturais e neurônios nociceptores

Resumo

Os neurônios nociceptores e as células NK interagem ativamente em um contexto inflamatório. Uma abordagem de co-cultura permite estudar essa interação.

Resumo

Os neurônios somatossensoriais evoluíram para detectar estímulos nocivos e ativar reflexos defensivos. Ao compartilhar meios de comunicação, os neurônios nociceptores também ajustam as defesas do hospedeiro, controlando a atividade do sistema imunológico. A comunicação entre esses sistemas é principalmente adaptativa, ajudando a proteger a homeostase, também pode levar a, ou promover, o aparecimento de doenças crônicas. Ambos os sistemas co-evoluíram para permitir essa interação local, como encontrado nos tecidos linfoides primários e secundários e na mucosa. Estudos recentes demonstraram que os nociceptores detectam e respondem diretamente a antígenos estranhos, citocinas derivadas de células imunes e micróbios.

A ativação do nociceptor não só resulta em hipersensibilidade à dor e coceira, mas reduz o limiar de disparo do nociceptor, levando à liberação local de neuropeptídeos. Os peptídeos que são produzidos e liberados a partir dos terminais periféricos dos nociceptores podem bloquear a quimiotaxia e a polarização dos linfócitos, controlando a localização, a duração e o tipo de inflamação. Evidências recentes mostram que os neurônios sensoriais interagem com células imunes inatas através do contato célula-célula, por exemplo, envolvendo receptores de grupo 2D (NKG2D) em células natural killer (NK).

Dado que as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores, é concebível que os nociceptores usem neuropeptídeos para controlar a atividade das células NK. Aqui, elaboramos um método de co-cultura para estudar as interações entre o neurônio nociceptor e as células NK em um prato. Usando essa abordagem, descobrimos que os neurônios nociceptores lombares diminuem a expressão de citocinas de células NK. No geral, esse método reducionista poderia ser útil para estudar como os neurônios inervantes de tumores controlam a função anticancerígena das células NK e como as células NK controlam a eliminação de neurônios lesionados.

Introdução

Os corpos celulares dos neurônios sensoriais se originam nos gânglios da raiz dorsal (DRG). Os DRG estão localizados no sistema nervoso periférico (SNP), entre o corno dorsal da medula espinhal e os terminais nervosos periféricos. A natureza pseudo-unipolar dos neurônios DRG permite a transferência de informações do ramo periférico, que inerva o tecido alvo, para o ramo central, que transporta a informação somatossensorial para a medula espinhal¹. Usando receptores de canais iônicos especializados, os neurônios de primeira ordem detectam ameaças representadas por patógenos, alérgenos e poluentes², levando ao influxo de c....

Protocolo

Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Université de Montréal (#22053, #22054) aprovaram todos os procedimentos para animais. Consulte a Tabela 1 para uma lista de soluções e sua composição e a Tabela de Materiais para uma lista de materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo.

1. Isolamento, cultura e estimulação de células NK

1. Gerar neurônio nociceptor intacto (controle de companheiro de ninhada; TRPV1^wt::D TA fl/wt) e camundongos ablados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando camundongos com toxina lox-stop-lox-diphtheria (DTA fl/^fl

Resultados

As células NK foram purificadas magneticamente a partir de esplenócitos de camundongos controle de ninhada (TRPV1 wt::D TA^fl/wt) e estimuladas (48 h) com IL-2 e IL-15. As células NK foram então cultivadas isoladamente ou co-cultivadas com neurônios DRG colhidos do neurônio nociceptor intacto (controle littermate; TRPV1^wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1^cre::D TA^fl/wt). As células foram então expostas ao agonista TRPV1 capsaicina (1 μM) ou seu veículo........

Discussão

Davies et ^al.11 encontraram que os neurônios lesados regulam positivamente a RAE1. Através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram então capazes de identificar e eliminar neurônios RAE1⁺ , que por sua vez limitam a dor crônica¹¹. Dado que as células NK também expressam vários receptores neuropeptídicos, e que esses neuropeptídeos são conhecidos por suas capacidades imunomoduladoras, parece cada vez mais importante estudar a inte.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-rato CD16/32	Jackson Laboratory	Cat nº: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat nº: 009669
Albumina de soro bovino (BSA) grau de cultura	World Precision Instruments	Cat nº: 504167
BV421 anti-rato NK-1.1	Fisher Scientific	Cat nº: 12430112
Filtro de células (50 μ m)	Fisher Scientific	Cat nº: A3160702
Colagenase IV	Fisher Scientific	Cat nº: 15140148
Toxina difteriafl/fl	Fisher Scientific	Cat nº: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat nº: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat nº: 07-200-95
Kit de isolamento de células NK de camundongo EasySep	Sigma	Cat nº: CLS2595
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma	Cat nº: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat nº: 04942078001
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma	Cat nº: 806552
FITC anti-camundongo NKp46	Sigma	Cat nº: L2020
Placa de fundo plano de 96 poços	Sigma	Cat nº: 03690
Pipeta Pasteur de vidro	Sigma	Cat nº: 470236-274
Fator neurotrófico derivado da linha de células gliais (GDNF)	VWR	Cat nº: 02-0131
Laminina	Cedarlane	Nº de gato: 03-50/31
L-Glutamina	Gibco	Nº de gato: A14867-01
Rato IL-15 recombinante	Gibco	Cat no: 22400-089
IL-2 recombinante de camundongo	Gibco	Cat no: 21103-049
Fator de crescimento nervoso (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Mídia neurobasal	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicilina e Estreptomicina	PeproTech	Cat nº: 210-15
Pilões	células-tronco	Nº do gato: 19855
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Biolegend	Cat nº: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 mídia	Biolegend	Cat nº: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat nº: 505406	Clone MP1-22E9
Pinças e ferramentas de dissecação.	Biolegend	Cat nº: 65-0865-14
Placa de 96 poços com fundo em forma de U	Biolegend	Cat nº: 101319
Corante de Viabilidade eFlour-780	Becton Dickinson