Avaliação da Eficiência Fotossintética em Mutantes Fotorrespiratórios por Análise de Fluorescência de Clorofila

As condições de estresse abiótico comumente vistas nos campos dos agricultores podem afetar negativamente o rendimento das culturas, reduzindo a eficiência fotossintética. Condições ambientais prejudiciais, como ondas de calor, mudanças climáticas, seca e salinidade do solo, podem causar estresses abióticos que alteram a disponibilidade de CO₂ e reduzem a resposta de uma planta ao alto estresse leve. Os dois maiores fluxos de carbono terrestres são a fotossíntese e a fotorrespiração, que são essenciais para o crescimento das plantas e o rendimento das culturas. Muitas das importantes proteínas e enzimas envolvidas nesses processos foram caracterizadas em condições de laboratório e identificadas no nível genético¹. Embora muito progresso tenha sido feito na compreensão da fotossíntese e da fotorrespiração, muitas etapas, incluindo o transporte entre organelas vegetais, permanecem descaracterizadas ^2,3.

A fotorrespiração, o segundo maior fluxo de carbono nas plantas após a fotossíntese, começa quando a enzima Rubisco fixa oxigênio em vez de dióxido de carbono em ribulose 1,5 bisfosfato (RuBP), gerando o composto inibitório 2-fosfoglicolato (2PG)¹. Para minimizar os efeitos inibitórios do 2PG e reciclar o carbono previamente fixo, as plantas C3 desenvolveram o processo multiorganelar de fotorrespiração. A fotorrespiração converte duas moléculas de 2PG em uma molécula de 3-fosfoglicerato (3PGA), que pode reentrar no ciclo de fixação de carbono C3¹. Assim, a fotorrespiração converte apenas 75% do carbono previamente fixado a partir da geração de 2PG e consome ATP no processo. Como resultado, o processo de fotorrespiração é um arrasto significativo de 10% a 50% no processo fotossintético, dependendo da disponibilidade de água e das temperaturas da estação de crescimento⁴.

As enzimas envolvidas na fotorrespiração têm sido uma área de foco de pesquisa há décadas, mas apenas um pequeno número de proteínas de transporte tem sido caracterizado no nível genético, embora pelo menos 25 etapas de transporte estejam envolvidas no processo ^5,6,7. As duas proteínas de transporte que estão diretamente envolvidas no movimento de carbono gerado no processo de fotorrespiração são o glicolato plastídico/transportador de glicerato PLGG1 e o simportador de sódio de ácidos biliares BASS6, ambos envolvidos na exportação de glicolato do cloroplasto ^5,6.

Sob ambiente [CO₂], Rubisco fixa uma molécula de oxigênio para RuBP aproximadamente 20% do tempo¹. Quando as plantas são submetidas a baixas [CO 2], as taxas de fotorrespiração aumentam, tornando a baixa [CO₂] um ambiente ideal para testar mutantes que podem ser importantes sob estresse fotorrespiratório elevado. O teste de linhas adicionais de proteína T-DNA de transporte de cloroplasto sob baixo CO₂ por 24 h e a medição de alterações na fluorescência de clorofila levaram à identificação de linhas de plantas de bass6-1 que demonstraram um fenótipo mutante de fotorrespiração⁵. Caracterizações posteriores demonstraram que o BASS6 é um transportador de glicolato na membrana interna do cloroplasto.

Este artigo descreve em detalhes um protocolo semelhante ao que foi inicialmente usado para identificar o BASS6 como um transportador de fotorrespiração, que veio de uma lista de supostas proteínas de transporte localizadas dentro da membrana do cloroplasto⁸ Este protocolo pode ser usado em um experimento de alto rendimento caracterizando mutantes de T-DNA da Arabidopsis ou plantas mutantes geradas por EMS como uma maneira de identificar genes importantes para manter a eficiência fotossintética sob uma variedade de estresses abióticos, como calor, estresse de alta luminosidade, seca e disponibilidade de CO₂ . A triagem de mutantes vegetais usando fluorescência de clorofila tem sido usada no passado para identificar rapidamente genes importantes para o metabolismo primário⁹. Com até 30% do genoma da Arabidopsis contendo genes que codificam proteínas de função desconhecida ou mal caracterizada, a análise induzida pelo estresse da eficiência fotossintética poderia fornecer informações sobre funções moleculares não observadas em condições controladas em plantas mutantes¹⁰. O objetivo deste método é identificar mutantes da via fotorrespiratória usando uma triagem de baixo CO₂ . Apresentamos um método para identificar mutantes que interrompem a fotorrespiração após a exposição ao baixo CO₂. Uma vantagem deste método é que é uma triagem de alto rendimento para mudas que pode ser feita em um período relativamente curto de tempo. As seções do protocolo de vídeo fornecem detalhes sobre a preparação e esterilização de sementes, crescimento de plantas e tratamento com baixo teor de CO₂ , a configuração do sistema de imagem de fluorescência, a medição do rendimento quântico das amostras tratadas, resultados representativos e conclusões.

1. Preparação e esterilização de sementes

NOTA: A preparação de sementes consiste na absorção de sementes e esterilização de sementes. É importante notar que todas essas etapas devem ser realizadas em um exaustor de fluxo laminar para manter as condições estéreis. Todos os materiais, reagentes e meios de crescimento necessários devem ser autoclavados (consulte a Tabela de Materiais).

1. Absorção e estratificação de sementes
   NOTA: As linhas de sementes utilizadas são plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) e tipo selvagem (WT, Col-0).
   1. Dispense as sementes em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Absorva as sementes em água estéril em um exaustor de fluxo laminar e estratificar a 4 °C no escuro por 2 dias.
2. Esterilização de sementes
   1. Em condições estéreis, preparar 10 mL de solução de água sanitária a 50% (v/v) e adicionar aproximadamente 20 μL de Tween 20. Para esterilização de sementes, remova a água das sementes embebidas, adicione 1 mL de solução de água sanitária nos tubos de microcentrífuga e incube à temperatura ambiente por 5 min.
   2. Retire a solução de lixívia com uma pipeta.
   3. Lave as sementes em 1 mL de água estéril para ressuspender. Remova a água uma vez que as sementes tenham se depositado no fundo. Repita a etapa 1.6 e a etapa 1.7 sete vezes.
   4. Ressuspender as sementes em solução estéril de agarose a 0,1%.
3. Revestimento de sementes
   1. Faça um volume de 1 L de Murashige & Skoog Basal Medium com vitaminas e 1,0 g/L de ácido 2-(N-morfonônio)etanossulfônico (MS) adicionando 5,43 g do pó a 500 mL de água destilada. Ajuste o pH entre 5,6 a 5,8 usando hidróxido de potássio (KOH). Encher até 1 L com água destilada.
      1. Dividir a solução líquida em 500 ml e colocar cada metade num balão de 1 L contendo uma barra de agitação magnética. Adicionar 5 g de pó de ágar para obter uma solução de ágar a 1% p/v para cada balão.
      2. Autoclave a 121 °C e 15 psi por 30 min; em seguida, coloque à temperatura ambiente enquanto mexe lentamente. Quando resfriado, despeje 25 mL de ágar MS em uma placa de Petri quadrada. Deixe-o solidificar.
         NOTA: Estas placas Murashige & Skoog Basal Medium contêm 1% de MS médio com vitaminas e 1% de ágar para o cultivo dos mutantes de teste.
   2. Corte uma ponta de pipeta de 200 μL com uma lâmina de barbear. Colocar uma semente no centro da grelha quadrada designada para cada mutante ou genótipo de ensaio (1 cm² quadrados) de uma placa MS quadrada (Figura 1) utilizando uma micropipeta de 200 μL.
      NOTA: A grade quadrada de 1 cm x 1 cm ajuda a manter uma distância uniforme entre as plântulas e evitar sobreposições, o que será importante em imagens e análises de fluorescência posteriores.
   3. Uma vez que as sementes tenham sido chapeadas, envolva com fita cirúrgica ao redor da tampa para selar e coloque-a na câmara de crescimento em condições conforme descrito abaixo.

2. Crescimento das plantas e baixo tratamento com CO₂

1. Cultivar as plantas por 7-9 dias a 20 °C sob um ciclo de luz de 8 h de 120 μmol·m−²s⁻¹ e 16 h de escuridão a 18 °C. Verifique as plantas no 6º dia para determinar se elas são grandes o suficiente para imagens. No 8º dia após o revestimento, expor as plantas a baixo CO₂.
2. Tratamento com baixo teor de CO₂
   1. Após os 7-9 dias, coloque quatro das oito placas das condições da câmara de crescimento ambiente em condições fotorrespiratórias de 20 °C, níveis contínuos de luz de 200 μmol·m−2 s⁻¹ e baixo CO₂ por ¹²h.
   2. Construa a condição de baixo CO₂ usando um recipiente transparente hermético com 100 g de cal sodada colocada no fundo do recipiente. Coloque o recipiente dentro da mesma câmara de crescimento que o controle. Manter as plantas de controle abaixo de 120 μmol·m−2 s⁻¹ em CO₂ ambiente por ¹²h.

3. Configurando o sistema de imagem de fluorescência

1. Coloque uma placa de ensaio (preparada de acordo com as secções 1 e 2) centrada sob a câmara a uma distância fixa no sistema de imagiologia por fluorescência.
2. Dentro do software do instrumento, navegue até a Janela ao vivo e marque a caixa Flashes para ativar flashes de medição não actínicos.
3. Clique nas ferramentas Zoom e Foco até que uma imagem completa e nítida esteja visível. Para este fim, use um palco ou uma prateleira para ajustar a distância entre as plantas e a câmera. Mantenha o zoom, o foco e a distância da câmera constantes durante todo o experimento.
4. Defina o valor de El. Shutter como 0 e ajuste a sensibilidade para obter um sinal fluorescente na faixa de 200-500 unidades digitais.
   NOTA: Um valor mais baixo do obturador (0-1) garantirá que os flashes de medição não sejam actínicos, enquanto um valor mais alto (2) melhorará a resolução da imagem.
5. Coloque um medidor de luz na mesma posição usada para ajustar as configurações da câmera.
6. Na Janela ao vivo, marque a caixa Super para iniciar um pulso de saturação com duração de 800 ms. Lembre-se de marcar a caixa toda vez para um novo pulso.
7. Use o controle deslizante para ajustar a porcentagem de potência relativa para o super pulso até que o medidor de luz leia 6.000-8.000 μmol·m−²s⁻¹.

4. Projetar o programa de rendimento quântico

1. Importe ferramentas operacionais padrão para o sistema de geração de imagens.
   Incluir default.inc
   Incluir light.inc
   NOTA: A sintaxe do programa usada para referência neste experimento é para um sistema de imagem FluorCam.
2. Defina as seguintes variáveis globais de acordo com as configurações de luz configuradas:
   Obturador = 0
   Sensibilidade = 40
   Super = 65
3. Inclua a etapa de tempo para registrar dados:
   TS = 20ms
4. Coletar a medição de Fo por amostragem de fluorescência em um estado adaptado ao escuro.
   F0duração = 2s;
   F0período = 200ms;
   NOTA: F0duration define o intervalo de tempo durante o qual a fluorescência adaptada ao escuro é registrada. F0period define o intervalo de tempo durante o qual a medição de fluorescência adaptada ao escuro é repetida.
5. Registre as medições de Fo em tabelas de dados.
   <0,F0período.. F0duração>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Onde < , > representa o conjunto de valores de fluorescência indexados pelo tempo; => armazena medidas em um arquivo de sistema; mfmsub representa todo o conjunto de dados para o experimento; e o ponto de verificação cria um subconjunto para dados de medições específicas, como startFo.
6. Coletar e armazenar a medição de Fm por fluorescência de amostragem após um pulso de saturação.
   PulseDuration=960ms; ##
   a1=F0duração + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>ponto de verificação,"startFm"
   =>checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   Onde a1 e a2 são variáveis para coordenar o tempo de amostragem com o pulso de saturação; a1 representa a hora de início da medição de Fm; e a2 representa o ponto médio do tempo do pulso.

5. Medição do rendimento quântico das amostras tratadas

1. Logo após o tratamento, cubra as placas com papel alumínio por 15 min para adaptação ao escuro. Remova a folha para medir o rendimento quântico do fotossistema II com um fluorômetro modificado por amplitude de pulso. Em seguida, coloque a placa de mudas diretamente sob a câmera e execute o protocolo de rendimento quântico encontrado no repositório GitHub.
2. Baixe o protocolo quantum_yield do GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) ou use um programa de design semelhante na seção 4. Use o software do fluorômetro para abrir o arquivo de programa clicando no ícone de pasta e navegando até o local do arquivo.
3. Execute o programa de rendimento quântico clicando no ícone de relâmpago vermelho.
4. Após a conclusão do protocolo, navegue até a janela de pré-análise . Particione a placa em mudas individuais usando as Ferramentas de Seleção para realçar todos os pixels de cada muda na imagem da placa. Clique em Exclusão de plano de fundo para remover todos os pixels de plano de fundo realçados, deixando apenas a área de muda.
5. Clique em Analisar para gerar dados de fluorescência para cada muda na imagem da placa. Ajuste manualmente o intervalo de valores de fluorescência para exibir valores mínimos e máximos consistentes entre todas as placas.
6. Clique em Média numérica na guia Experimento | Exportação | Numérico. Selecione Todos os dados e por coluna e clique em Ok para gerar um arquivo de texto contendo medidas QY para cada muda.

6. Abrindo o arquivo de dados

1. Abra o arquivo de texto em uma planilha para análise. Dos títulos que mostram o número da área, tamanho dos pixels, Fm, Ft, Fq e QY, identifique o número da área para o genótipo central (WT ou mutante de teste) e QYmax. Realize um teste t pareada com relação ao tipo selvagem para determinar a significância. Os dados são interpretados como significativamente diferentes quando os valores de p estão abaixo de 0,05.

Os resultados mostram imagens em placas de imagens brutas e de fluorescência da triagem ambiente e de baixo CO2 de WT e mutantes de teste. Cada plantlet é rotulada por número de área, com as leituras de fluorescência correspondentes dadas como QY. Os dados são exportados como um arquivo de texto e podem ser abertos em uma planilha para análise (consulte a Tabela Suplementar S1). As linhagens mutantes plgg1-1 e abcb26 foram selecionadas para demonstrar a identificação positiva e negativa de genes associados ao estresse fotorrespiratório. PLGG1 codifica para o primeiro transportador na via após a oxigenação do RuBP6, enquanto o ABCB26 é pensado para codificar um transportador de antígeno que não se sabe estar envolvido na fotorrespiração11. As eficiências Fv/Fm QY adaptadas ao escuro de WT e mutantes são visualizadas por gráficos de caixa e bigode. Para testar a diferença estatística entre o WT e os mutantes de teste, foi utilizado um teste t pareado, com valor de p < 0,05. Aqui, foram utilizadas linhagens fotorrespiratórias mutantes com QY Fv/Fm reduzido como mutantes de teste para verificar a eficiência do método de triagem. Os resultados mostram que os mutantes de teste têm uma eficiência QY significativamente menor do que o WT. A Figura 3B mostra uma redução significativa na razão entre a variável e a fluorescência máxima (Fv/Fm) para plgg1-1 , mas não abcb26 em baixo CO2. Esse resultado é consistente com o papel do PLGG1 como transportador envolvido na fotorrespiração, enquanto o abcb26 não demonstra fenótipo diferente do controle do WT em condições de baixo CO2 . Assim, este método de triagem pode identificar mutantes fotorrespiratórios usando triagem de baixo CO2 .

Figura 1: Exemplo de esquema do layout da placa de semente. Duas repetições técnicas são mostradas com seis sementes colocadas em uma fileira. Sementes de controle WT colocadas acima de sementes mutantes. Abreviação: WT = tipo selvagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens Fv/Fm adaptadas ao escuro de mudas de 9 dias de idade. O controle do tipo selvagem é comparado a linhas mutantes de T-DNA em ambiente e baixo CO2. A escala de cores representa a média Fv/Fm de cada plântula. Barra da escala = 1 cm. Abreviaturas: Fv/Fm = razão entre a variável e a fluorescência máxima; WT = tipo selvagem; plgg1-1 = glicolato plastida/translocador de glicerato 1; abcb26 = de ligação ATP B26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Observações de fluorescência. Medições de rendimento quântico máximo (Fv/Fm) realizadas em plântulas em condições (A) ambiente e (B) de baixo CO2 . As caixas representam o intervalo entre os quartis internos, as linhas dentro das caixas representam as medianas e os bigodes representam as observações máximas e mínimas. * Indica diferença significativa com base em um teste t pareada em relação ao WT (n > 44, p < 0,05; Tabela Suplementar S2). Abreviaturas: Fv/Fm = razão entre a variável e a fluorescência máxima; WT = tipo selvagem; plgg1-1 = glicolato plastida/translocador de glicerato 1; abcb26 = de ligação ATP B26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar S1: Dados fluorescentes compilados de todas as placas de plântulas utilizadas no experimento. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S2: As estatísticas são relatadas a partir de um teste t entre o tipo selvagem e ambos os genótipos mutantes. Os mutantes são considerados significativamente diferentes do tipo selvagem quando o valor de p é menor que 0,05. A Tabela A representa os testes t realizados em plantas cultivadas em COambiente 2, enquanto a Tabela B representa os testes t realizados em plantas cultivadas em baixo CO2. Teste t: duas amostras assumindo variâncias iguais. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesse.