Descrevemos uma abordagem para medir mudanças na eficiência fotossintética em plantas após tratamento com baixo CO2 usando fluorescência de clorofila.
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Artigo de método
Avaliação da Eficiência Fotossintética em Mutantes Fotorrespiratórios por Análise de Fluorescência de Clorofila
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fotossíntese e a fotorrespiração representam os maiores fluxos de carbono no metabolismo primário das plantas e são necessárias para a sobrevivência das plantas. Muitas das enzimas e genes importantes para a fotossíntese e fotorrespiração têm sido bem estudados há décadas, mas alguns aspectos dessas vias bioquímicas e sua conversa cruzada com vários processos subcelulares ainda não são totalmente compreendidos. Grande parte do trabalho que identificou os genes e proteínas importantes no metabolismo das plantas foi conduzido em ambientes altamente controlados que podem não representar melhor como a fotossíntese e a fotorrespiração funcionam em ambientes naturais e agrícolas. Considerando que o estresse abiótico resulta em eficiência fotossintética prejudicada, o desenvolvimento de uma tela de alto rendimento que possa monitorar tanto o estresse abiótico quanto seu impacto na fotossíntese é necessário.
Portanto, desenvolvemos um método relativamente rápido para rastrear alterações induzidas por estresse abiótico na eficiência fotossintética que podem identificar genes não caracterizados com papéis na fotorrespiração usando análise de fluorescência de clorofila e triagem de baixo CO2 . Este trabalho descreve um método para estudar mudanças na eficiência fotossintética em mutantes knockout transferidos de DNA (T-DNA) em Arabidopsis thaliana. O mesmo método pode ser usado para triagem de mutantes induzidos por metanossulfonato de etila (EMS) ou triagem supressora. A utilização deste método pode identificar candidatos a genes para um estudo mais aprofundado no metabolismo primário das plantas e nas respostas ao estresse abiótico. Os dados deste método podem fornecer informações sobre a função do gene que pode não ser reconhecida até a exposição a ambientes de estresse aumentado.
Introdução
As condições de estresse abiótico comumente vistas nos campos dos agricultores podem afetar negativamente o rendimento das culturas, reduzindo a eficiência fotossintética. Condições ambientais prejudiciais, como ondas de calor, mudanças climáticas, seca e salinidade do solo, podem causar estresses abióticos que alteram a disponibilidade de CO2 e reduzem a resposta de uma planta ao alto estresse leve. Os dois maiores fluxos de carbono terrestres são a fotossíntese e a fotorrespiração, que são essenciais para o crescimento das plantas e o rendimento das culturas. Muitas das importantes proteínas e enzimas envolvidas nesses processos foram caracterizadas em co....
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Protocolo
1. Preparação e esterilização de sementes
NOTA: A preparação de sementes consiste na absorção de sementes e esterilização de sementes. É importante notar que todas essas etapas devem ser realizadas em um exaustor de fluxo laminar para manter as condições estéreis. Todos os materiais, reagentes e meios de crescimento necessários devem ser autoclavados (consulte a Tabela de Materiais).
- Absorção e estratificação de sementes
NOTA: As linhas de sementes utilizadas são plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) e tipo selvagem (WT, Col-0).- Dispense as sementes em tubos de mi....
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Resultados
Os resultados mostram imagens em placas de imagens brutas e de fluorescência da triagem ambiente e de baixo CO2 de WT e mutantes de teste. Cada plantlet é rotulada por número de área, com as leituras de fluorescência correspondentes dadas como QY. Os dados são exportados como um arquivo de texto e podem ser abertos em uma planilha para análise (consulte a Tabela Suplementar S1). As linhagens mutantes plgg1-1 e abcb26 foram selecionadas para demonstrar a identificação positiva.......
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Discussão
Os métodos experimentais descritos neste artigo vêm com algumas vantagens e limitações. Uma vantagem é que este método pode filtrar muitas mudas de plantas, embora algumas precauções devam ser tomadas para evitar a contaminação da placa do meio da planta durante o processo de chapeamento e crescimento. Portanto, é fundamental selar as placas de Arabidopsis com fita cirúrgica. Outra vantagem deste experimento é que ele tem um período de estresse fotorrespiratório mais curto de 12 h em comparação com o trabalho publicado a.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesse.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada pelo Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | VWR | 10810-070 | recipiente para esterilização de sementes |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | produto químico utilizado para suspender sementes para facilitar o plaqueamento |
| Arabidopsis thaliana sementes (abcb26) | ABRC, encomendadas através da TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | sementes de arabidopsis utilizadas como grupo experimental |
| Sementes de Arabidopsis thaliana (plgg1-1) | ABRC, encomendadas através da TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | sementes parentais de arabidopsis |
| Arabidopsis thaliana sementes (WT) | ABRC, encomendadas através de TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis sementes do tipo selvagem usadas como grupo controle |
| alvejante | Alvejante genérico Clorox | Produto químico usado para esterilizar sementes | |
| S232-104-001 | Absorvente de CO2 absorvente | ||
| Sistemas de Fótons | Fechados FluorCam | Câmaras de Fluorescência | FC 800-C |
| FluoroCam FC 800-C | Câmaras de Sistemas de Fluorescência | Câmaras Fechadas FluorCam FC 800-C/1010-S | Câmaras de Fluorescência |
| FluoroCam7 | Instrumentos | Câmaras Fechadas FluorCam FC 800-C/1010- S | Software de análise de imagem de fluorescência |
| Gelzan (ágar de planta) | Phytotech labs | 71010-52-1 | químico usado para solidificar mídia MS como placas |
| frasco de vidro 1 L | Fisherbrand | recipiente FB5011000 | para fazer e autoclavar a câmara de crescimento de mídia MS |
| caron | 7317-50-2 | câmara de crescimento usada para cultivar plantas | |
| Murashige & Skoog Basal Medium com Vitaminas e 1,0 g/L MES (MS) | laboratórios Phytotech | M5531 | Meio de crescimento para mudas de Arabidopsis |
| Hidróxido de potássio (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | faz como solução de 1 M para luzes de aranha de ajuste de ph |
| XLG-100-H-AB | Mean Well Enterprises | usadas no ensaio de luz | |
| Placa de Petri Quadrada com Grade, estéril | Simport Scientific | D21016 | usado para segurar mídia MS para mudas de arabidopsis |
| fita cirúrgica | 3M | 1530-1 | fita usada para selar placas |
| entre 20 | biorad | 9005-64-5 | Surfactante usado para auxiliar na esterilização de sementes |
Referências
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 ....
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Reimpressões e permissões
