Visualizando o desenvolvimento da cicatriz usando o ensaio SCAD - Um ensaio de cicatrização de pele ex-situ

Resumo

Este protocolo descreve a geração de uma explanta de fáscia de pele chamada "SCar like tissue in A Dish" ou SCAD. Este modelo permite uma visualização sem precedentes de fibroblastos únicos durante a formação da cicatriz.

Resumo

A resposta global dos mamíferos à vedação de feridas profundas de tecido é através da formação de cicatrizes e contração tecidual, mediada por fibroblastos especializados de fáscia. Apesar da significância clínica da formação da cicatriz e da cicatrização prejudicada da ferida, nossa compreensão da dinâmica do fibroblasto de fáscia na cicatrização das feridas é superficial devido à falta de ensaios relevantes que possibilitem a visualização direta da coreografia e dinâmica do fibroblasto em ambientes complexos, como nas feridas da pele. Este artigo apresenta um protocolo para gerar cicatrizes de pele ex-situ usando SCAD ou "Tecido semelhante a SCar em Um Prato" que emulam o ambiente complexo de feridas cutâneas. Neste ensaio, a pele de 2 mm de espessura total é extirpada e cultivada de cabeça para baixo na mídia por 5 dias, durante os quais cicatrizes e contraturas de pele se desenvolvem uniformemente. Essa metodologia, aliada aos modelos específicos de camundongos transgênicos da linhagem do fibroblasto, permite a visualização de linhagens individuais de fibroblasto em todo o processo de reparação da ferida. No geral, esse protocolo auxilia os pesquisadores na compreensão de processos fundamentais e mecanismos de reparação de feridas, explorando diretamente os efeitos dos moduladores nos desfechos de cicatrização de feridas.

Introdução

A cicatrização de feridas é um processo de restauração de feridas violadas. Lesões teciduais em invertebrados resultam em regeneração parcial ou completa. Em contraste, os mamíferos respondem a ferimentos profundos por cicatrizes, um processo adaptado para selar rapidamente feridas com densas fibras matriciais que minimizam a área rompida e, ao mesmo tempo, deformam permanentemente o local^{ferido 1,2,3}. Queimaduras de pele grandes ou feridas profundas abertas em mamíferos resultam em fenótipos patológicos, como cicatrizes hipertróficas ou queloides

Protocolo

O modelo apresentado abaixo fornece uma descrição detalhada passo a passo da geração de ensaio SCAD, conforme descrito brevemente em Jiang et al., 2020¹³. Os preparativos da amostra SCAD foram realizados após o sacrifício dos animais, de acordo com as diretrizes internacionais e do Governo da Alta Baviera. Os animais estavam alojados na instalação de animais do Centro Helmholtz de Munique. Os quartos foram mantidos com umidade ideal e temperatura constante com ciclo de luz de 12 horas. Os animais eram abastecidos com comida e água ad libitum.

1. Preparação do tecido SCAD

1. Sacrificar....

Resultados

A geração de SCADs pode ser separada em três etapas essenciais: a colheita da pele de volta de camundongos P0-P1, gerando socos de biópsia de espessura total, e cultura subsequente de scads individuais até 5 dias em placas de 96 poços. Como leitura, este ensaio pode ser aplicado ainda para analisar os aspectos espaciais e temporais das cicatrizes. A análise espacial utiliza rotulagem imune 2D e 3D de tecidos para estudar a localização espacial de componentes celulares e maticiais dentro do tecido cicatricial em desenvolv.......

Discussão

Vários modelos já foram desenvolvidos para entender a formação da cicatriz após lesão. Embora muitos avanços tenham sido apresentados a este respeito, mas, os mecanismos reais ainda não estão claros. Em contraste com a técnica anterior, o modelo SCAD incorpora todos os tipos de células e camadas cutâneas, mantendo assim a complexidade da pele nativa ^18,19. Essa metodologia é capaz de gerar conjuntos de dados fundamentais que são importantes na compreensão de meca.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% Tween 20, Detergente não iônico	Biorad Laboratories	1610781
Albumina de soro bovino, Fract de etanol frio	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, sem vermelho de fenol-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat Thermo	Lâminas de Adesão Scientific
Epredia SuperFrost Plus	Lâminas de Adesão Fisher scientific	J1800AMNZ
Soro Fetal Bovino, qualificado, inativado por calor, aprovado pela UE, Origem da América do Sul-500 mL	LIFE Technologies
Fluoromount-G com DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Meio de montagem com pinça DAPI
curvada com pontas finas com pino-guiaaço inoxidável (pinças)	Fisher Scientific	12381369
Gelatina de pele suína	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, cálcio, magnésio, sem vermelho de fenol-500 mL	de gás LIFE Technologies	14025092
Ibidi para CO2 e O2	Ibidi	11922
Sistema de aquecimento Ibidi	Ibidi	10915
Microscópio vertical Leica SP8 - Excitação multifotônica 680– 1300 nm	Leica		Equipado com uma objetiva de imersão em água de 25x (HC IRAPO L 25x/1.00  W) em combinação com um laser sintonizável (Spectra-Physics, InSight DS +  Único)
Aminoácidos Não Essenciais	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose, 25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Matriz de Incorporação	Carlroth	6478.1
Paraformaldeído, 16% P/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Tesoura de Dissecção Reta Afiada/Afiada 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%– 101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 microscópio vertical	Zeiss