Técnicas de Dissecção e Amostragem Histológica do Coração em Modelos de Grandes Animais para Doenças Cardiovasculares

Resumo

Devido à anatomia complexa, um protocolo de dissecção e colheita consistentemente reprodutível para amostras cardíacas pode ser difícil de implementar. Este manuscrito apresenta os elementos-chave de alguns protocolos padrão de dissecção cardíaca, destacando tanto as abordagens de exame macroscópica quanto os locais de amostragem comumente utilizados para o exame histopatológico.

Resumo

O exame grosseiro padrão e a amostragem são elementos-chave na reprodutibilidade e sucesso de estudos experimentais de doenças cardiovasculares realizados em animais de grande porte. Considerando a complexa anatomia do coração, as diferenças entre espécies e os tipos de reações compensatórias e patológicas, protocolos consistentes são difíceis de implementar. A utilização de protocolos de dissecção múltipla é geralmente adaptada para se adequar à experiência do pró-setor, e a preferência pessoal continua a ser uma fonte de variabilidade experimental e interobservador. Aqui, o objetivo é apresentar as principais características anatômicas e marcos, protocolos de dissecção e padrões de amostragem histológica do coração em algumas espécies comumente utilizadas (incluindo cães, suínos, ruminantes e gatos) como modelos de doenças cardiovasculares.

Dois protocolos de exame grosseiro padrão são apresentados aqui. Primeiro, o método de entrada-saída, que segue a direção fisiológica do fluxo sanguíneo através do coração e grandes vasos (frequentemente usado em cães, ruminantes e porcos), e segundo, a técnica de dissecção de quatro câmaras (exemplificada em gatos). Ambas as técnicas podem ser adaptadas a qualquer espécie em determinadas circunstâncias experimentais. Os protocolos de amostragem incluem todas as áreas de interesse (linfonodo sinoatrial, ventrículos, septo interventricular, átrios, válvulas e aorta) e, se bem realizados, melhoram tanto a reprodutibilidade quanto a confiabilidade dos estudos experimentais.

Introdução

Devido à anatomia complexa e ao rigor precoce, que podem interferir na avaliação da espessura da parede cardíaca, o exame macroscópica do coração é desafiador e propenso a vários erros relacionados à técnica ou de interpretação. Isso é amplificado pelas variações morfológicas interespecíficas e pelo fato de que muitas patologias cardíacas clínicas importantes (incluindo casos precoces de doenças coronarianas, fibrose, arterite e amiloidose) não estão associadas a alterações macroscópicas, sendo, em essência, patologias histológicas. Um protocolo padronizado de dissecção e colheita histológica de amostras pode trazer consistência entre os observadores e, ao mesmo tempo, comparabilidade e reprodutibilidade de estudos experimentais de doenças cardiovasculares.

As amostras foram coletadas de dois cães (Canis lupus familiaris) (um buldogue francês macho de 3 anos de idade e uma mestiça fêmea de 8 anos), um gato (Felis catus) (um macho de 6 anos de idade, de pelo curto europeu macho), um porco doméstico (Sus scrofa domesticus) (um macho de 1 ano, macho Large White) e uma vaca (Bos taurus) (uma Holstein fêmea de 2 meses de idade). Cada uma das espécies escolhidas tem uso particular como modelo cardiovascular para uma doença diferente; por exemplo, os cães são um modelo preferido para a modelagem de arritmia; os gatos são preferidos para cardiomiopatia hipertrófica (CMH), por ser a espécie com maior prevalência de CMH; suínos são utilizados como modelo para infarto agudo do miocárdio; e os ruminantes são utilizados como modelo de intoxicação devido à sua exposição a toxinas que podem ser facilmente encontradas em prados¹¹.

Neste manuscrito, são apresentados um protocolo de necropsia e dois protocolos de dissecção do coração, destinados a melhorar o exame macroscópica e histológico do coração em doenças cardiovasculares experimentais. Os protocolos descritos foram desenvolvidos com base em informações de livros didáticos veterinários ^{1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12}, literatura de periódicos 3,13,14^, documentos oficiais 15 e webinars ^{16 ,17}. As amostras utilizadas neste estudo foram colhidas de cadáveres submetidos ao Departamento de Patologia da USAMV Cluj-Napoca para diagnóstico de autópsia de rotina.

Protocolo

O protocolo experimental recebeu acordo bioético (nº 311 de 2022) e foi aprovado pelo Comitê de Bioética da Universidade de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária Cluj-Napoca, em conformidade com a legislação nacional (Lei nº 43 de 2014) e europeia (Diretiva da UE nº 63 de 2010). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo.

1. Protocolo de necropsia

NOTA: Recomenda-se que o mesmo protocolo de necropsia seja utilizado para todas as espécies apresentadas, devido à facilidade de acesso quando realizada ^2,12. Os passos a seguir representam a necropsia realizada em um cão de tamanho médio. Adapte os passos ao realizar necropsias em diferentes sujeitos.

1. Pese o sujeito e coloque-o sobre a mesa de necropsia do lado esquerdo (Figura 1A). Proceder ao exame externo do sujeito (inspecionando e palpação da cútis e mucosas, observando todas as alterações de cor, consistência e volume).
2. Use uma faca (ou bisturi) e faça uma incisão de 7 cm na axila direita (Figura 1A).
3. Localizar a junção coxofemoral (Figura 1A,B). Abra a cápsula com uma faca. Corte do ligamento da cabeça do fêmur (Figura 1B).
4. Use a faca para estender a incisão cutânea na axila craniana para a sínfise mandibular e caudalmente para o períneo (Figura 1B).
5. Retirar a pele com o bisturi e expor a parede torácica e abdominal da linha média ventral até o nível dos processos transversais vertebrais (Figura 1B).
6. Com o bisturi e a pinça, crie um retalho através da parede abdominal, ventrocaudal ao arco costal direito. Abra a cavidade abdominal com tesoura - siga a face caudal do hipocôndrio direito (Figura 1B).
7. Estender a incisão caudalmente ao longo da área paralombar direita até a crista ilíaca externa. Depois, estenda a incisão até a inserção púbica da linha alba.
8. Resumidamente, examine os órgãos abdominais in situ (observando quaisquer alterações nas mudanças de cor, consistência, volume e posição dos órgãos).
9. Com o bisturi e a pinça, puncione o diafragma no ponto mais alto (Figura 1B).
10. Entre na cavidade torácica removendo a caixa torácica direita com duas seções longitudinais usando pinça de corte ósseo. Seção do segmento cartilaginoso paraesternal das costelas. Em seguida, corte o segmento dorsal das costelas, proximal às articulações costovertebrais (Figura 1C).
11. Examine o coração in situ (Figura 1C). Observe o tamanho, a posição, a cor, as conexões com os tecidos adjacentes e, por palpação, quaisquer alterações na consistência⁹.
    NOTA: Se uma trombose ou doença cardíaca congênita estiver presente, o coração deve ser dissecado in situ (esta abordagem permite o exame completo dos grandes vasos).
12. Use uma tesoura para examinar e abrir a cavidade pericárdica com uma seção longitudinal da base até o ápice do coração. Examine a cavidade pericárdica e o epicárdio (observando quaisquer alterações na cor, consistência e volume)¹².
13. Solte o coração com uma tesoura, produzindo cortes transversais da aorta, tronco pulmonar e ambas as veias cavas. Seção da veia cava superior pelo menos 1 cm acima da entrada no átrio direito para preservar a crista terminalis^11,13.
14. Examine o contorno externo do órgão, a aparência do epicárdio, o aparecimento do miocárdio pela transparência do epicárdio e a aparência externa dos grandes vasos (Figura 2A).
    NOTA: Em geral, a abertura e o exame do pericárdio apresentam algumas diferenças entre as espécies. O exame da cavidade pericárdica inicia-se com uma inspeção externa e avaliação através da transparência do pericárdio do conteúdo pericárdico global ^1,2. Em um gato ou cão, o pericárdio normalmente contém cerca de 0,25 mL/kg de líquido fino, límpido, translúcido a amarelo claro⁹. Se houver derrames patológicos, eles devem ser coletados com uma seringa estéril ou tubo vacutainer.

2. Protocolo de dissecação

NOTA: Várias técnicas de necropsia são usadas para o coração, cada uma com várias vantagens. Para este protocolo, foram escolhidas duas das técnicas mais utilizadas: 1) o "método de entrada-saída", que permite um melhor exame das valvas e do endocárdio e é um protocolo utilizado para a maioria das espécies 2,11,12,16, e²) a técnica de "dissecção de quatro câmaras"/"plano ecocardiográfico", tipicamente utilizada para gatos ou cães de pequeno porte ^{1, 17}.

1. O "método de entrada-saída" para dissecção cardíaca 2,11,12,16
   1. Coloque o coração com a face atrial para cima (Figura 2A).
   2. Use tesouras e pinças desdentadas para cortar amplamente da veia cava caudal ao longo do átrio direito (Figura 2B). Continue o corte até o apêndice auricular direito para expor a crista terminalis/nó sinoatrial (nó SA). Inspecione a valva tricúspide a partir da vista dorsal.
   3. Corte de um corte do átrio direito até a junção entre o ventrículo direito e o septo interventricular (Figura 2C). Exibir a válvula atrioventricular direita.
   4. Seção da parede livre do ventrículo direito ao longo do septo interventricular. Continue a secção até a origem do tronco pulmonar (Figura 2C,D).
   5. Examinar minuciosamente as valvas atrioventriculares direitas, incluindo as cordas tendíneas, e os músculos papilares (Figura 2D). Corte os acordes tendineae.
   6. Colocar pinça através do tronco pulmonar e cortá-lo longitudinalmente (Figura 2E). Examine a via de saída pulmonar, a origem do tronco pulmonar e as válvulas semilunares.
   7. Corte o átrio esquerdo das veias pulmonares até a ponta da aurícula esquerda (Figura 2F). Inspecione a válvula bicúspide (mitral) a partir da vista dorsal.
   8. Colocar o coração com o septo interventricular voltado para baixo (Figura 2F). Faça uma grande incisão na parede livre ventricular da base do ventrículo até o ápice cardíaco. Exibir completamente a válvula atrioventricular esquerda.
   9. Corte as cordas tendíneas da cúspide da valva atrioventricular esquerda.
   10. Colocar a pinça através da via de saída do ventrículo esquerdo e utilizá-la como orientação para abrir a aorta (Figura 2G).
   11. Use solução salina para remover todos os coágulos sanguíneos. Uma vez removidos todos os coágulos sanguíneos, avalie-se e compare o peso cardíaco com a massa corporal ou tabelas de peso cardíaco padrão (Tabela 1)^11,13.
   12. Pese o coração.
   13. Se apenas o nó SA for o ponto de interesse, após o exame do ventrículo esquerdo, coloque todo o coração inteiramente em formalina tamponada neutra (NBF) a 10% por 24 h e corte o átrio direito para coletar amostras da crista terminal.
       NOTA: Por esta técnica, os ventrículos esquerdo e direito podem ser facilmente apreciados. A razão entre a espessura da parede ventricular esquerda e direita é de 3:1, com pequenas diferenças por espécie e raça; para o coração do feto animal, a proporção é de 1:1¹².

3. Protocolo de amostragem para histologia¹⁶

1. Com bisturi, fazer dois cortes longitudinais paralelos (aproximadamente 5 mm de distância) envolvendo o átrio direito, a valva tricúspide e a parede livre do ventrículo direito (Figura 2I)
2. Realizar dois cortes longitudinais paralelos (aproximadamente 5 mm de distância) envolvendo o átrio esquerdo, valva mitral, músculo papilar dorsal e ventrículo esquerdo (Figura 2H).
3. Dentro do terço superior dorsal do coração, seccionar transversalmente a base do coração seguindo uma linha, incluindo o septo interventricular, átrio direito, aorta, valva aórtica e valva tricúspide (Figura 2J).
4. Realizar dois cortes longitudinais paralelos envolvendo a base da aorta e o septo interventricular (Figura 2J).
5. Aparar o átrio direito ao redor da crista terminal e fornecer várias seções paralelas orientadas transversalmente no eixo longitudinal da crista (aproximadamente 3-4 mm de distância) para obter seis peças do nó SA (Figura 3, Figura 4I e Figura 5H).
6. Aparar os tecidos obtidos em histológicas.
   NOTA: Protocolo de bloqueio recomendado: etapa 3.1.-bloqueio histológico 1 (a Figura 6 mostra o slide resultante deste bloco.), passo 3.2.-bloco histológico 2 (a Figura 7 mostra o slide resultante deste bloco), passo 3.4.-bloco histológico 3 (a Figura 8 mostra o slide resultante deste bloco), passo 3.5.-bloco histológico 4 (a Figura 9 mostra o slide resultante deste bloco).
7. Mergulhe os tecidos em 10% de NBF por pelo menos 48 h.

4. Amostragem de artérias coronárias 3,10,14

1. Use fórceps e bisturi para dissecar as artérias coronárias do sulco paraconal cardíaco (Figura 4K). Fixe a artéria coronária durante a noite em 10% NBF.
2. Se necessário, descalcificar adequadamente em uma mistura 1:1 de ácido fórmico a 8% e ácido clorídrico.
3. Faça vários cortes transversais em intervalos de 3 mm. Coloque as seções em um e, em seguida, coloque o em 10% NBF até a incorporação.
   NOTA: Os porcos podem ser usados como um modelo cardíaco para os seres humanos, especialmente quando se trata de doença cardíaca coronária. Assim, amostras suplementares e cortes histológicos de artérias coronárias são recomendados 3,10,14.

5. A técnica de dissecção do coração "quatro câmaras"/"plano ecocardiográfico" ^1,17

NOTA: A técnica de dissecção de quatro câmaras consiste em um corte da base até o ápice do coração para obter a visão padrão¹. A técnica de "quatro câmaras" é melhor aplicada a tecidos fixos.

1. Coloque todo o coração em 10% NBF por pelo menos 48 h.
2. Após a fixação do coração em NBF a 10% por pelo menos 48 h (Figura 10A), coloque duas pinças de dissecção retas desdentadas, uma através do crânio-átrio direito-valva tricúspide-ventrículo direito e a segunda através da veia pulmonar-átrio esquerdo-valva mitral-ventrículo esquerdo (Figura 10B).
3. Use o espaço entre os braços da pinça como orientação para a lâmina de corte da base até o ápice do coração (Figura 10C). Fornecer uma secção longitudinal adicional com aproximadamente 5 mm, para além da secção descrita na etapa 5.2. no segmento cardíaco, que inclui a aorta.
4. Com uma incisão transversal, separe completamente a base cardíaca do ápice. Coloque cada segmento de tecido em um histológico.
   NOTA: Protocolo de bloqueio recomendado: o bloqueio histológico ápice-cardíaco 5 (a Figura 11A mostra a lâmina resultante deste bloqueio), o bloco histológico de base cardíaca 6 (a Figura 11B mostra a lâmina resultante deste bloqueio).
5. Coloque as em 10% NBF até incorporar. Fixar todas as amostras cardíacas em NBF a 10% (mais de 10 vezes o volume de tecido), processá-las rotineiramente em cera de parafina, corte a 4 μm de espessura e coloração com hematoxilina e eosina (coloração H&E) seguindo um protocolo descrito anteriormente¹⁰.
   NOTA: Se houver suspeita de miocardite, "um pedaço de tecido cardíaco fresco deve ser retido em condições estéreis com material cirúrgico estéril e recipiente de amostra estéril para estudos microbiológicos e virais"¹³.

6. Documentação fotográfica

NOTA: A documentação fotográfica é uma etapa opcional no exame de necropsia. No entanto, fotografias e gravações de vídeo são essenciais para se ter uma "documentação precisa da anatomia normal e anormal"³.

1. Para documentação fotográfica adequada, tire imagens digitais durante a realização de "dissecção progressiva de tecidos cardíacos"¹³. Consulte as orientações para documentação fotográfica e fotografia¹⁵ a vista geral-anterior e posterior; uma fatia do coração; e quaisquer lesões suspeitas.

Resultados

Este protocolo foi utilizado para visualizar características anatômicas e coletar amostras para exame histológico do coração em quatro espécies diferentes (cão, gato, porco e vaca). O protocolo de necropsia foi repetido em cada uma das espécies acima mencionadas, mas ilustrado apenas em cães. O protocolo de necropsia inicia-se com um extenso exame externo do corpo (Figura 1A) (incluindo a pele, linfonodos exploráveis e mucosa externa), medindo o peso total e pontuando o estado geral do anima...

Discussão

Ao executar o protocolo atual, várias etapas críticas devem ser cuidadosamente consideradas para resultados consistentes. Em animais jovens, as medidas cardíacas são diferentes daquelas em adultos (incluindo a espessura da parede ventricular) e, geralmente, o coração representa maior proporção do peso corporal^11,12. O grau de hipertrofia ventricular pode ser quantificado pela aplicação de uma fórmula de peso geral, a razão entre o ventrículo esquerdo mais septo d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina a 0,9%	B. BRAUN MELSUNGEN AG		Para lavar todo o sangue e coágulos sanguíneos do coração.
10% de formalina tamponada neutra (NBF)	Caminho	Q 11699404	Materiais para coleta de amostras histopatológicas.
Pinça de corte ósseo	HELEN SRL	LS109HV	Instrumento robusto para cortar osso.
Tábua de cortar	Ambition	86304	Para uma manipulação mais fácil, e corte dos órgãos.
Solução descalcificante	Thermo Scientific TBD-2	6764004	mistura 1:1 de ácido fórmico a 8% e ácido clorídrico.
Câmera digital	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	Para documentação fotográfica e videográfica.
Fórceps	MKD-Medicale	15-430	Instrumentos de dissecação.
histológicos	Q Path	720-2215	Materiais para coleta de amostras histopatológicas. Dimensões: 3 &vezes; 2,5 &vezes; 0,4 cm
Faca	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Lâmina afiada para corte de tecidos moles.
Luvas de látex	MKD-Medicale	SANTEX-S	Equipamento de proteção.
Máscara	MKD-Medicale	21221	Equipamento de proteção.
Placas de Petri	MKD-Medicale	0598-1V	Materiais para coleta de amostras de testes auxiliares.
Recipientes de plástico	Corning Gosselin	TP200-02	Materiais para coleta de amostras histopatológicas.
Balança	ESPERANZA	MEEKS008	Para pesagem dos órgãos.
Balança	Branca Ofertas	72	Para pesar os assuntos.
Bisturi	MKD-Medicale	10322E	Lâmina afiada para cortar tecidos moles.
Tesoura	MKD-Medicale	13-260 Instrumentos de	dissecação.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Equipamento de proteção.
Seringas	MKD-Medicale	10573EU	Materiais para coleta de amostras de testes auxiliares.