Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico

O Newcastle Disease Virus, também conhecido como Ortoavulavírus-1, é um paramyxovírus aviário envolto com potencial para ser usado tanto como um vírus oncolítico quanto como uma vacina viral^vetorial 1,2,3,4,5,6,7. Mais recentemente, o NDV projetado para expressar a proteína de pico de SARS-CoV-2 tem sido caracterizado como uma vacina intranasal eficaz nos modelos de desafio de camundongos e^{hamsters 7,8,9}. Quando usado como imunoterapia contra o câncer, resulta no recrutamento de células imunes inatas, especificamente células assassinas naturais, produção de interferon tipo I, e a geração de células T específicas do antitumoral 10,11,12,13. Além dessas potentes propriedades imunoestimulatórias, o NDV possui um forte perfil de segurança e um sistema genético reverso bem estabelecido^14,15. Essas características desejáveis têm solicitado a avaliação do NDV em numerosos ensaios clínicos pré-clínicos e humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)^16,17. Para avançar ainda mais este vetor viral altamente promissor e estimulante imunológico, métodos detalhados são necessários para produzir e purificar ndv ultra-puro de alta titer que pode ser administrado com segurança in vivo.

Como o NDV é um paramyxovírus aviário, é mais frequentemente amplificado em ovos de galinha embrionados. Embora existam sistemas baseados em células disponíveis para propagação de NDV, a maioria não foi capaz de produzir títulos semelhantes aos alcançados em ovos de galinha embrionados¹⁸. No entanto, existem algumas desvantagens na produção de NDV em ovos, incluindo o fato de que a produção à base de ovos é longa e não facilmente escalável, a fonte de grandes quantidades de ovos de galinha SPF pode ser problemática, e existe o potencial de contaminação com alérgenos de ovos 13,18,19,20 . Recentemente, um grupo mostrou que as células Vero cultivadas em suspensão em meio livre de soro podem suportar a replicação de NDV para titers comparáveis aos obtidos em ovos, antes da purificação²¹. No entanto, isso exigiu a passagem serial do vírus para adaptar o vírus às células Vero, e a otimização de um método para purificar o NDV das células Vero suspensas ainda é necessária²¹.

Como destacado anteriormente, os métodos utilizados para purificar o vírus de alto nível, in vivo de grau, variam dependendo do vírus na questão²². Existe um sistema genético reverso bem estabelecido disponível para a geração de NDV recombinante. Este processo, envolvendo o uso de um clone cDNA, plasmídeos auxiliares e um vírus auxiliar que expressa polimerase T7 RNA, foi descrito anteriormente em detalhes^15,23. Este protocolo pode ser aplicado a NDV lentogênico ou mesogênico. O vírus descrito neste protocolo é um NDV mesogênico recombinante codificando a proteína fluorescente verde (GFP) da água-viva Aequorea victoria inserida entre genes P e M virais como uma unidade de transcrição individual, pois este foi descrito anteriormente como o local ideal para a inserção de transgenes^{estrangeiros 24}.

Os métodos fechados descrevem a purificação do NDV com base em seu tamanho, variando de 100 a 500 nm, e sua densidade¹⁵. Isso permitiu que a geração de estoques NDV de alto nível e alto nível em aproximadamente 3 semanas, a partir de quando os ovos são recebidos até ter um título final. São descritas técnicas frequentemente utilizadas na produção em larga escala de vírus à base de ovos, como filtração de fluxo tangencial, filtração de profundidade e ultracentrifugação de gradiente de densidade, permitindo a tradução desses métodos para uma produção em maior escala. Técnicas descritas anteriormente para a purificação do NDV foram aprimoradas pela incorporação de um tampão estabilizador de vírus, uso de iodixanol durante a ultracentrifugação de gradiente de densidade e pela descrição de várias medidas de controle de qualidade para garantir a qualidade in vivo ¹⁵. Isso permitiu a purificação de NDV de grau vivo atingindo títulos de até 3 × 10¹⁰ PFU/mL de 0,8 a 1,0 L de fluido allantóico.

Todo o trabalho envolvendo o uso de animais foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Guelph, de acordo com o Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Todo o trabalho é realizado em um laboratório biossegurança nível 2 (BSL2) no Canadá, onde o NDV mesogênico é um Patógeno do Grupo de Risco 2. Todas as etapas envolvidas na amplificação e purificação do NDV devem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica tipo IIA para fins de segurança e esterilidade.

1. Amplificação do NDV utilizando ovos de galinha embrionários sem patógenos especificados

1. Inoculação de ovos de galinha embrionados SPF
   NOTA: Normalmente, oito dúzias de ovos de galinha embrionados SPF são usados para gerar um lote in vivo de NDV. Peça uma ou duas dúzias de ovos extras para responder por danos durante o transporte, bem como variabilidade na viabilidade. Os ovos de galinha embrionados são materiais biológicos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes institucionais. No entanto, uma vez que os embriões não são eclodidos, a aprovação institucional do Comitê de Cuidados com Animais não é necessária.
   1. Após receber ovos de galinha embrionados spf, incubar em uma incubadora de ovos a 37 °C, 60% de umidade durante 9 dias. Certifique-se de que a incubadora está configurada para balançar/girar automaticamente os ovos a cada hora.
      NOTA: Os ovos podem ser armazenados à temperatura ambiente por até 24h ou 4 °C por até 72 h; no entanto, isso pode diminuir a viabilidade do embrião.
   2. Após 8-11 dias de incubação (idealmente no dia 9), velas os ovos para determinar a viabilidade do embrião. Procure vasculatura semelhante à web (Figura 1A) e movimento de embriões como indicadores de embriões viáveis. Descarte os ovos que não possuem essas características (Figura 1B).
   3. Nos ovos viáveis, marque a interface entre o saco de ar e o embrião a lápis com um 'X' (Figura 1A). Certifique-se de que este local de injeção não causaria perfuração da vasculatura. Devolva os ovos marcados para a incubadora enquanto o inóculo estiver preparado.
   4. Calcule a quantidade de vírus necessária para injetar todos os ovos de galinha embrionados do FPS. Certifique-se de que cada ovo receba 100 PFU de vírus em um volume de 100 μL; diluir o vírus em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) para uma concentração de 1 × 10³ PFU/mL. Prepare 20% a mais do inóculo para responder por imprecisões na administração do vírus.
   5. Com um lenço antiestático, limpe os topos dos ovos marcados com uma solução de iodo de 10%, diluído em 70% de etanol. Aguarde aproximadamente 1-2 min para que a solução seque.
   6. Fure cuidadosamente a casca usando um par de pinças afiadas estéreis. Higienize as pinças em 70% de etanol entre os ovos.
   7. Utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 25 G, injete 100 μL do inóculo preparado na etapa 1.1.4 na cavidade corioallantónica (Figura 1C). Aproxime-se com a agulha em um ângulo de quase 90° para o ovo. Insira a agulha apenas no topo da membrana corioallantónica.
   8. Após a inoculação, use esmalte para cobrir o local da punção e devolva os ovos à incubadora. Certifique-se de que a configuração de balanço está ON até 24 horas após a inoculação.
   9. Verifique a viabilidade do óvulo 24h após a inoculação. Descarte ovos mortos que não tenham vasculatura na membrana corioallantónica e movimento do embrião (Figura 1B).
      NOTA: Estes ovos morreram devido ao processo de inoculação e não ao NDV.
   10. Devolva os ovos à incubadora, com o roqueiro desligando para evitar a contaminação do fluido allantóico com proteínas de ovos.
   11. Verifique os ovos a cada 12-24 h, conforme descrito na etapa 1.1.9 para identificar ovos mortos. Mova os ovos que morrem após 24h após a inoculação para 4°C para minimizar a autolise. Colher o fluido allantóico dentro de 2-12 h de resfriamento.
   12. Incubar os ovos por pelo menos 72 h.
       NOTA: Se a propagação de uma cepa mesogênica de NDV, o tempo ideal de incubação é de 60-72 h, pois tempos de incubação prolongados podem prejudicar o processo de purificação devido à clareza reduzida do fluido allantóico. Esta questão não é tão importante na propagação de cepas ndv lentogênicas como demoram muito mais para matar o embrião.
   13. Após o período de incubação adequado, mova os ovos restantes para 4 °C por 2-12 h antes de colher o fluido allantóico.
2. Colheita de fluido allantóico contendo NDV
   1. Mova os ovos resfriados para o armário de biossegurança. Limpe os topos dos ovos com 70% de etanol.
   2. Use pinças estéreis e tesouras cirúrgicas para quebrar o lado apical do ovo onde o saco de ar está localizado.
   3. Remova a casca para revelar a membrana corioallantóica (Figura 1D).
   4. Puna cuidadosamente a membrana e descasque-a para expor a cavidade allantónica (Figura 1E). Certifique-se de que o saco de gema não seja acidentalmente perfurado, assim como isso vai estragar o ovo.
   5. Use fórceps sem cortes para pegar o embrião e abrir o saco embrionário.
      NOTA: O fluido dentro do saco embrionário também contém NDV.
   6. Deprimir o embrião com os fórceps e coletar o fluido allantóico usando uma pipeta sorológica de 10 mL.
   7. Armazene o fluido allantóico no gelo em tubos cônicos de 15 mL até o esclarecimento.
      NOTA: Se o fluido allantóico for amarelo, o saco de gema foi comprometido e o fluido allantóico deve ser descartado.
   8. Centrifugar os tubos cônicos contendo o fluido allantóico a 1.500 × g por 10 min a 4 °C.
   9. Ponto de pausa: Aliquot o fluido allantóico esclarecido em tubos cônicos de 50 mL e armazene-os a -80 °C para armazenamento a longo prazo (por exemplo, semanas a meses), complementando o fluido com sacarose a uma concentração final de 5% para proteger o vírus dos efeitos severos do congelamento. Alternativamente, para armazenamento de curto prazo (por exemplo, 1-3 dias), suplementar o fluido allantóico com sacarose (final 5%) ou com tampão 3x Mannitol-Lysine (ML) tampão (15% mannitol, 3% lysine; ver Tabela Suplementar S1 para receitas tampão) para produzir uma concentração final de 1x (5% Mannitol, 1% Lysine) antes do armazenamento a 4 °C.

2. Purificação de NDV do fluido allantóico

1. Filtragem de profundidade do fluido allantóico
   1. Armazene o líquido allantóico esclarecido a -80 °C e descongele-o a 4 °C na noite anterior à purificação.
   2. Em um armário de segurança biológica, configure a tubulação e a bomba peristáltica, como mostrado na Figura 2.
   3. Se ainda não for realizado, combine o fluido allantóico com tampão 3x ML a uma concentração final de 1x.
   4. Antes de anexar o filtro de profundidade, esterilize a tubulação passando 50 mL de 0,5 M NaOH através do sistema em um vaso de resíduos.
   5. Enxágüe a tubulação passando 100 mL de água estéril e molecular através do sistema e para dentro do vaso de resíduos.
      NOTA: Como o NaOH vai inativar o NDV, é importante que as linhas sejam adequadamente lavadas antes de introduzir o fluido allantóico contendo vírus.
   6. Prime o sistema executando 50 mL de PBS através dele, parando a bomba quando há aproximadamente 5 mL de PBS deixados no tubo.
   7. Conecte o filtro de profundidade com uma classificação de retenção de 1-3 μM à tubulação e remova a segunda tampa do lado apical do filtro de profundidade para ventilar o filtro. Comece a executar um adicional de 50 mL de PBS através do sistema.
   8. Uma vez que o PBS comece a fluir através da ventilação na parte superior do filtro, feche a porta e continue a fluir PBS através das linhas.
      NOTA: Bolhas de ar menores são aceitáveis, mas a presença de grandes quantidades de ar exigirá que o filtro seja ventilado novamente, conforme descrito nas etapas 2.1.7 e 2.1.8.
   9. Pare a bomba quando houver aproximadamente 5 mL de PBS restantes no tubo.
   10. Substitua o vaso de resíduos por um novo recipiente de coleta estéril e comece a executar fluido allantóico através do filtro de profundidade.
       NOTA: A pressão não deve exceder 10 psi, pois isso resulta na tesoura do vírus. A pressão pode ser manipulada diminuindo ou aumentando a vazão da bomba. Se a pressão começar a exceder 10 psi e a taxa de fluxo não puder ser diminuída mais, um novo filtro de profundidade deve ser usado. Neste caso, as etapas 2.1.6-2.1.8 devem ser realizadas antes de retomar o fluxo de fluido allantóico.
   11. Uma vez que todo o fluido allantóico tenha passado pelo filtro, execute 50 mL de tampão 1x ML através das linhas para maximizar a recuperação do vírus.
   12. Colecione o líquido até que as linhas sequem. Armazene o vírus durante a noite ou até 36 h a 4 °C.
       NOTA: Uma vez filtrado a profundidade do vírus, continue o processo de purificação dentro de 36 horas após a filtragem da profundidade completa.
   13. Desconecte o filtro de profundidade e higienize o tubo executando 100 mL de 0,5 M NaOH, 400 PPM de alvejante prewed a 42 °C através do sistema antes do armazenamento em 0,5 M NaOH.
2. Filtragem de fluxo tangencial para a concentração de NDV
   1. Monte os componentes do como descrito na Figura 3A (e como mostrado anteriormente²⁵) em um gabinete de segurança biológica.
      NOTA: O coletor e a placa endplate devem ser lavados em detergente e secos antes de usar. As juntas de silício são reutilizáveis e devem ser armazenadas em 0,5 M NaOH com o.
   2. Configure o sistema de filtragem de fluxo tangencial (TFF) (também conhecido como filtragem de fluxo cruzado) em uma conformação 'aberta' (Figura 3B).
      1. Se usar um pela primeira vez, monte o TFF na conformação de Elução e lave com 100 mL de água estéril e molecular (Figura 3C).
      2. Uma vez que reste apenas 5 mL de água no reservatório, pare a bomba e altere a configuração do sistema TFF para uma conformação fechada (Figura 3D).
      3. Adicione 100 mL de 0,5 M NaOH, 400 PPM alvejante pré-armado a 42 °C ao reservatório e pedale através do sistema por 30-60 min.
      4. Pausa o fluxo e devolva o sistema TFF para a configuração de eluição, retomando o fluxo para elutar a solução de limpeza.
      5. Quando sobrarem aproximadamente 5 mL no reservatório, pare a bomba e adicione 100 mL de água estéril e molecular para enxaguar o sistema.
      6. Quando sobrarem aproximadamente 5 mL no reservatório, pause a bomba e coloque o sistema TFF na conformação aberta (Figura 3B). Continue com o passo 2.2.3.
   3. Esterilize o e o tubo passando 100 mL de 0,5 M NaOH através do sistema usando a bomba peristáltica. Certifique-se de que a pressão não exceda 30 psi para manter a integridade do.
   4. Pare a bomba quando houver aproximadamente 5 mL de 0,5 M NaOH deixados no reservatório.
   5. Adicione 100 mL de água estéril e molecular ao reservatório e retome a passagem do fluido através do. Gire o reservatório para lavar todo o NaOH das laterais do reservatório para evitar a inativação do vírus. Repita o passo de lavagem do reservatório.
   6. Quando houver aproximadamente 5 mL de água estéril e molecular deixada no reservatório, pare a bomba.
   7. Adicione 100 mL de PBS ao reservatório, girando para garantir que a água estéril de grau molecular seja lavada dos lados. Retome o fluxo de líquido através do.
   8. Quando houver aproximadamente 5 mL no reservatório, pause a bomba, adicione fluido allantóico filtrado de profundidade ao reservatório e retome o fluxo da bomba.
   9. Monitore o medidor de pressão 1 (Figura 3B) para garantir que ele não exceda 10 psi para evitar o arremesso do vírus. Use uma combinação da velocidade da bomba peristáltica e o uso de grampos C para aumentar a eluição ao desperdício.
      NOTA: A combinação da velocidade da bomba peristáltica e dos grampos C resultará em aumento da pressão.
   10. Quando houver 50-100 mL de fluido allantóico deixado no reservatório, pausar a bomba para realizar uma troca de buffer adicionando 150-200mL de 1x ML tampão.
   11. Retome o fluxo da bomba, monitorando novamente o medidor de pressão 1 (Figura 3B) para garantir que não exceda 10 psi.
   12. Quando sobrarem 5-10 mL no reservatório, pare a bomba.
   13. Utilizando dois grampos C, feche as duas linhas de resíduos como mostrado na Figura 3C.
   14. Desacoplar a linha de retentate alimentando o reservatório e inseri-lo em um tubo cônico de 50 mL (Figura 3C).
   15. Retome o fluxo da bomba, parando quando houver algumas gotas de fluido no tanque do reservatório.
   16. Remova os grampos C das linhas de resíduos e recoloque a linha de alimentação retentate ao tanque do reservatório (Figura 3B).
   17. Adicione 20-25 mL de tampão 1x ML e retome o fluxo da bomba até que haja aproximadamente 5 mL no tanque do reservatório.
   18. Repetição de passos 2.2.13 a 2.2.16.
       NOTA: Uma eluição^{de 3 dias} pode ser feita repetindo as etapas 2.2.17 e 2.2.13 a 2.2.16 para aumentar a produção do vírus. No entanto, a maior parte do vírus está presente nas duas primeiras eluções.
   19. Após o término das eluções, coloque o vírus no gelo ou a 4 °C.
   20. Para limpar as linhas, configure o sistema de tal forma que se seja um formato de loop fechado (Figura 3D) com as linhas de resíduos se alimentando de volta para o reservatório, como retratado na Figura 3D.
   21. Prossiga para limpar o sistema adicionando 250 mL de 0,5 M NaOH, 400 PPM alvejante pré-armado a 42 °C.
   22. Flua a solução de limpeza pelo sistema durante a noite.
       NOTA: Ao recircular a solução de limpeza, se a bomba estiver em execução a uma velocidade de 50 mL/min, deve-se observar uma pressão de cerca de 5 psi. Se a pressão exceder isso, o estará sujo, e a solução de limpeza deve ser substituída, e o processo se repetir.
   23. Elute a solução de limpeza direcionando ambas as linhas de resíduos e a linha de retentate em um recipiente de resíduos.
   24. Adicione 400-500 mL de água estéril ao reservatório e flua através do sistema e nos vasos de resíduos.
   25. Quando aproximadamente 5 mL for deixado no reservatório, pare a bomba e adicione 100-200 mL de 0,5 M NaOH ao tanque do reservatório, rodando a solução para lavar o recipiente do reservatório.
   26. Uma vez que o reservatório esteja quase vazio, repita o passo 2.2.23 mais duas vezes.
   27. Desmonte a configuração TFF, armazenando o TFF e as juntas em um pequeno volume de 0,5 M NaOH em um saco plástico ressealizável a 4 °C.
       NOTA: A tubulação pode ser armazenada à temperatura ambiente submersa em 0,5 M NaOH.
3. Ultracentrifugação de gradiente de densidade iodixanol
   1. Ligue o ultracentrifuugar e coloque-o em pré-cólquio para 4 °C. Pré-cozinhe o rotor desejado a 4 °C também (veja a Tabela de Materiais).
      NOTA: Os rotores devem ser armazenados a 4 °C.
   2. Use o estoque 60% de solução iodixanol (concentração no momento da compra) para gerar 40%, 20% e 10% soluções iodixanol diluindo com PBS e 3x ML Buffer para uma concentração final de 1x de tampão ML.
   3. Em um tubo ultracentrifuge de parede larga, de 13,2 mL, de paredes largas, sobrepõem 0,5 mL, 2,5 mL e 2,5 mL das soluções de 40%, 20% e 10% de iodixanol, respectivamente (Figura 4A).
      NOTA: Inclinar o tubo ultracentrífuga de lado e expulsar lentamente a solução reduzirá significativamente o risco de misturar as duas camadas gradientes. A separação de cada camada deve ser evidente, com um "halo" visível entre cada camada do gradiente.
   4. Use uma caneta marcadora para marcar as interfaces das várias camadas gradientes.
   5. Camada 6-6,5 mL do vírus elucido do procedimento TFF sobre o gradiente de densidade. Adicione o vírus cuidadosamente conforme descrito na etapa 2.3.3 para evitar perturbar o gradiente de densidade.
   6. Carregue os tubos de ultracentrifuagem nas pastilhas para o rotor do balde balançando (veja a tabela de materiais) usando uma balança de topo aberto para equilibrar as pastilhas dentro de 0,01 g uma da outra. Use PBS ou eluent de vírus extra para explicar as diferenças de peso.
   7. Uma vez que os tubos estejam equilibrados, tampa os tubos e carrega-os no rotor.
   8. Centrifugar para 1,5 h a 125.000 × g a 4 °C.
      NOTA: Isso pode ser realizado durante a noite se um ultracentrifuuge com capacidade de início de atraso estiver disponível.
   9. Após a ultracentrifugação, remova os tubos usando um par de fórceps estéreis. Procure a banda-alvo- uma banda grande entre os gradientes de 10% e 20% (Figura 4B).
   10. Suspenda o tubo sobre o topo de um béquer usando um suporte de réplica.
   11. Conecte uma agulha de 18 G x 1,5 polegadas a uma seringa de 5 mL e puna a lateral do tubo ultracentrífuga.
       NOTA: O tubo deve ser perfurado ligeiramente abaixo da faixa alvo, com a agulha em um ângulo ascendente e bisbida para cima de tal forma que ele viajaria para a faixa alvo.
   12. Estenda lentamente o êmbolo para remover a faixa alvo.
       NOTA: Mova a agulha dentro da faixa de destino para maximizar o vírus extraído. Tenha cuidado para que outras bandas ou detritos não se misturem com a banda alvo, e evite tomar solução em excesso, pois isso levará ao uso de mais fitas de diálise.
   13. Uma vez que a faixa alvo tenha sido extraída, remova a agulha e permita que a solução restante escorra para o béquer de resíduos. Distribua a faixa alvo em um tubo cônico de 50 mL até que todas as bandas de todos os outros tubos ultracentrífugas tenham sido extraídas.
   14. Repetição de passos 2.3.10-2.3.13 até que todas as bandas-alvo tenham sido extraídas de todos os tubos ultracentrífugas.
   15. Abordagem alternativa para extrair as faixas-alvo conforme descrito nas etapas 2.3.10 a 2.3.13
       1. Remova lentamente o líquido sobrepondo a faixa alvo usando uma pipeta. Uma vez na faixa alvo, extraia usando uma pipeta e armazene o vírus em um tubo cônico de 50 mL.
          NOTA: Isso permite que os tubos ultracentrífugas sejam reutilizados.
4. Remoção de iodixanol da solução de vírus
   NOTA: A faixa contendo NDV aparece em uma densidade iodixanol entre 15% e 16%. A concentração de iodixanol na solução pode ser determinada medindo a absorvância a 340 nm em referência a uma curva padrão (Figura Suplementar S1). Esta etapa pode ser omitida, pois não foram observados efeitos adversos ou toxicidade aguda quando soluções iodixanol dessa concentração foram administradas em camundongos C57BL/6.
   1. Prewet um de diálise molecular de 0,5-3 mL 10 kDa, submergindo-o na PBS por 1 min.
      NOTA: A membrana de diálise deve mudar de lisa para ter uma aparência babada ou esburacada. Se o volume do vírus extraído exceder 10 mL, devem ser utilizados dois de diálise de 0,5-3 mL ou um de diálise de 5-12 mL.
   2. Conforme aplicável, use uma seringa de 5 ou 10 mL e uma agulha de enchimento contundente de 18 G x 1,5 polegadas para coletar o vírus do tubo cônico de 50 mL.
   3. Use a seringa para entrar no de diálise, tomando cuidado para não perfurar a membrana, e injete o vírus.
      NOTA: O de diálise pode ser girado para manipular o posicionamento do bolsão de ar no. O bolsão de ar deve ser removido antes de remover a agulha do.
   4. Encha um béquer 1 L com PBS 1x estéril, coloque uma barra de mexes e o de diálise dentro, e cubra. Incubar a 4 °C com agitação suave.
      NOTA: Use espuma de poliestireno extrudada e uma faixa elástica para fixar o de diálise para que ele flutue no PBS. O pode inchar ligeiramente devido ao tampão ML.
   5. Depois de 1-2 h, substitua por pbs fresco 1x e continue incubando a 4 °C por mais 8-10 h com leve agitação.
      NOTA: Isso também pode ser feito durante a noite.
   6. Substitua por pbs 1x fresco mais uma vez, incubando à temperatura ambiente por 1-2 h.
5. Concentração de solução de vírus
   1. Remova o de diálise do tampão de diálise (Figura 4C) e coloque-o em um pequeno saco plástico vedado. Adicione 15-25 mL de 40% 20.000 MW de polietileno glicol para que o de diálise fique completamente submerso.
   2. Incubar em temperatura ambiente com balanço. Verifique o volume do vírus no periodicamente usando uma seringa de 5 ou 10 mL e uma agulha de preenchimento contundente de 18 G x 1,5 polegadas.
      NOTA: A quantidade de tempo necessária para concentrar o vírus varia de acordo com o volume inicial e o volume final desejado. Normalmente, o volume final desejado é entre 1 e 1,5 mL, independentemente do volume inicial do fluido allantóico. Ao verificar o volume, tenha cuidado para não usar a mesma porta que isso comprometerá a integridade da porta e pode resultar na mistura da solução de polietileno glicol e do vírus.
   3. Antes de remover o vírus concentrado do de diálise, enxágue brevemente o em PBS 1x e encha uma agulha de preenchimento contundente de 18 G x 1,5 polegadas com ar.
   4. Insira a seringa cheia de ar no de diálise e deprimir o êmbolo. Gire o aparelho para que o vírus concentrado possa ser removido sem remover nenhum ar introduzido.
   5. Distribua o vírus concentrado em um tubo cônico de 50 mL, observando o volume dispensado.
   6. Usando a mesma seringa e agulha, injete uma quantidade apropriada de 60% de sacarose no de diálise para que, quando combinado com o vírus previamente removido, esteja em uma concentração final de 5% de sacarose.
   7. Use dedos enluvados para massagear a membrana para desalojar o vírus residual que pode ter aderido à membrana, tomando cuidado para não danificá-la. Remova parte do excesso de ar na fita de diálise para facilitar o processo de desalojá.
   8. Combine esta lavagem com o vírus já no tubo cônico de 50 mL.
      NOTA: O vírus está agora em 5% de sacarose e pronto para ser dispensado em 20 μL, 50 μL, 100 μL ou 200 μL aliquots e armazenado a -80 °C. Alternativamente, para armazenamento a longo prazo, o NDV pode ser liofilizado e armazenado a 4 °C, conforme descrito na seção 2.6.
6. Lyofilização do NDV
   1. Liophilize o vírus aliquotado em tubos de centrífugas de 1,5 mL ou tubos cônicos de 15 mL a 44 × ^10-3 MBAR e -52 °C por 16 h.
   2. Armazene as amostras liofilizadas a 4 °C sem redução significativa no título viral.

3. Ensaios de controle de qualidade

1. Isolamento viral do RNA e PCR de transcrição reversa para confirmação de genoma
   1. Descongele uma alíquota de vírus de 20 μL. Siga o protocolo de isolamento viral do RNA fornecido com o kit.
   2. Use imediatamente o RNA isolado como um modelo para PCR de transcrição reversa (RT-PCR) ou armazene-o a -80 °C.
   3. Prepare as reações de transcrição reversa conforme descrito no protocolo fornecido pelo fabricante.
   4. Use o cDNA resultante como modelo para várias reações de PCR de controle de qualidade para confirmar o pathótipo NDV (Tabela 1, conjunto de primer de proteína F) e a presença de elementos de controle genético necessários (Tabela 1, conjunto de primer Transgene).
      NOTA: Os primers devem ser projetados com base na cepa de NDV que está sendo propagada.
      1. Para sequenciar o local de decote da proteína F, o principal determinante do pathótipo, use o conjunto de primer de proteína F (Tabela 1). Procure um produto PCR de 435 pares de base de comprimento.
         NOTA: Aqui, os primers foram projetados com base na cepa LaSota de NDV (adesão genbank AF077761.1). É bem estabelecido que a expressão transgênica ideal ocorre quando um transgene estrangeiro é inserido entre os genes P e M²⁴.
      2. Use o conjunto de primer transgene para confirmar a integridade do gene start e gene end elementos do transgene. Sequencia o produto PCR para confirmar a integridade da sequência de genes e de fim genético.
   5. Envie os produtos PCR para sequenciamento de DNA e compare-os com o modelo para homologia.
2. Coloração de PÁGINA SDS e Coomassie para detectar proteínas contaminantes
   1. Lance um gel SDS PAGE de gradiente de densidade, preparando primeiro soluções de poliacrilamida de 6% e 15% (Tabela Suplementar S1). Use uma pipeta de 10 mL para elaborar 5 mL da solução de 15%, seguido por 5 mL da solução de 6%.
   2. Remova a pipeta da solução e gere uma bolha de ar desenhando brevemente o ar.
      NOTA: À medida que a bolha de ar viaja para cima, isso mistura a solução para criar o gradiente SDS PAGE.
   3. Dispense a solução no aparelho de fundição e deixe-a solidificar por 30 minutos.
   4. Em um volume final de 20 μL, combine uma alíquota de vírus com tampão redutor de 4x (Tabela Suplementar S1) de modo que a concentração final seja de 1x, e ferva por 10 min a 95 °C em um termociclador. Carregar pelo menos 1 × 10⁷ PFU do vírus.
   5. Submerse a PÁGINA do SDS no buffer de execução (Tabela Suplementar S1) e carregue as amostras.
   6. Execute o gel a 120 V por 1-1,5 h.
   7. Remova o gel do buffer de execução e transfira-o para um recipiente menor.
   8. Adicione a solução de coloração Coomassie (Tabela Suplementar S1) para cobrir o gel. Incubar em temperatura ambiente por 4-5 h.
   9. Remova a solução de coloração e adicione a solução destain (Tabela Suplementar S1), incubando por 4-8 h em temperatura ambiente com agitação. Mude a solução de desestabilização de três a quatro vezes.
      NOTA: O gel deve ser claro e sua cor deve ser como era antes da coloração.
   10. Imagem do gel em uma configuração colorimétrica. Consulte a Figura 5 para obter uma imagem representativa de um gel SDS PAGE manchado de Coomassie contendo amostras de fluido allantóico e vírus purificado.
3. Quantificação de titulação viral infecciosa por dose infecciosa de cultura tecidual mediana (TCID₅₀) e ensaio de imunofluorescência
   NOTA: As células Vero podem ser usadas como alternativa às células DF1; no entanto, o efeito citopático (CPE) é menos pronunciado em células Vero. NDV abrigando a mutação L289A, que aumenta a fusogenicidade, e expressando GFP entre os genes P e M está sendo usado neste ensaio.
   1. Semente uma placa de 96 poços de células DF1 a 20.000 células/bem em um volume de 80 μL no dia anterior usando DMEM suplementado com 2% de soro bovino fetal (FBS) e 125 μg/mL trypsin. Incubar as células a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. No dia seguinte, descongele uma alíquota de 20 μL de vírus no gelo.
   3. Use tubos de 1,5 mL para preparar diluições seriais. Comece diluindo 10 μL do vírus com 990 μL de PBS para preparar uma diluição de ^10-2 . Prepare todas as outras diluições, até ^10-10 no mínimo, feitas com 900 μL de PBS e a adição de 100 μL da diluição anterior.
      NOTA: Use uma nova ponta de pipeta ao se mover entre diluições.
   4. Use 20 μL de cada diluição para infectar cada poço da placa de 96 poços, conforme mostrado na Figura 6.
      NOTA: O volume final em cada poço será de 100 μL.
   5. Incubar a placa por pelo menos 48h a 37 °C e 5% de CO₂, antes de examinar para a presença de CPE/GFP ou realizar um ensaio de imunofluorescência indireta (IFA).
      NOTA: Nessas condições culturais, a CPE fica evidente após 10 h (Figura 7A-D), aumentando ao longo das próximas 24 horas (Figura 7E-H). A placa pode ser incubada por mais tempo para melhorar a intensidade do CPE se a pontuação por GFP ou CPE.
      1. Se marcar por CPE ou GFP e NÃO realizar IFA, pule para a etapa 3.3.18.1.
   6. Se realizar IFA, enxágue as células duas vezes com 100 μL de 1x PBS.
   7. Adicione 100 μL de 4% de paraformaldeído diluído em PBS a cada poço e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente.
   8. Lave as células 3x 5 min cada uma com 100 μL de 1x PBS, 0,1% Tween 20 (0,1% PBS-T).
   9. Permeabilize as células pela adição de 100 μL de 0,1% NP-40 em PBS e incubando-as em temperatura ambiente por 10 minutos .
   10. Lave as células 3x 5 min com 100 μL de 0,1% PBS-T.
   11. Adicione 100 μL de tampão de bloqueio composto por 5% (V/V) soro normal de cabra diluído em 0,1% PBS-T por 1h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
   12. Adicione 100 μL por poço de anticorpo anti-NDV ribonucleoproteína do camundongo primário diluído em 0,1% PBS-T a 1 μg/mL, incubando por 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
   13. Lave as células 3x por 5 min em 100 μL de 0,1% PBS-T.
   14. Adicione 100 μL de um anticorpo anti-rato de cabra AlexaFluor 488 diluído em 0,1% PBS-T a 2 μg/mL. Incubar por 1h à temperatura ambiente.
   15. Lave as células 3x por 5 min em 100 μL de 0,1% PBS-T.
   16. Após a lavagem final, deixe as células em 100 μL de 0,1% PBS-T.
   17. Imagem dos poços usando um microscópio fluorescente invertido.
   18. Ao realizar ifa, procure fluorescência maior do que a vista nos poços de controle negativo, indicando que o poço é positivo para NDV como mostrado na Figura 8.
       1. Procure a presença de sincronia e células grandes e arredondadas que caracterizam o NDV CPE. Se a pontuação de poços infectados com um vírus que expressa GFP, procure a presença de GFP.
   19. Insira as informações apropriadas na calculadora de titer Spearman-Karber²⁶ para determinar o PFU/mL do vírus (Tabela 2). Consulte a Figura 6 para um exemplo TCID₅₀ placa de titer.
4. Quantificação do título viral por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)
   NOTA: Recomenda-se um kit qRT-PCR de uma etapa para economizar tempo e reduzir a manipulação das amostras. Um ensaio baseado em sonda é usado para aumentar a especificidade da detecção de sequências de vírus.
   1. Crie uma curva padrão de uma quantidade conhecida das sequências de vírus (Figura Suplementar S2A,B).
      NOTA: Isso pode ser feito comprando um fragmento de DNA sintético de 500 bp de dupla retida do gene NDV L. A sequência para um fragmento de 500 bp do gene NDV L pode ser vista em Figura Suplementar S2C.
   2. Converta a quantidade do fragmento de DNA do vírus (geralmente fornecido como nanogramas ou femtomoles pelos fabricantes) para o número de moléculas ou cópias de fragmento de DNA usando o número de Avogadro e as verrugas para a fórmula de moléculas (Eq (1)).
      (1)
   3. Prepare as amostras de curva padrão preparando uma série de diluição de dez vezes de cópias conhecidas de fragmentos de DNA do vírus, começando de 1,00 ×^{10 10} cópias até 1,00 × 10⁰ cópias.
   4. Para determinar a quantidade de RNA NDV em amostras desconhecidas, extraia ndv RNA usando um kit de extração de RNA. Siga o protocolo fornecido com o kit. Uma vez extraído o RNA, proceda com o protocolo recomendado fornecido no kit qRT-PCR de uma etapa.
   5. Executar as reações em um instrumento PCR em tempo real com as seguintes condições de temperatura e ciclismo: 1) um ciclo de transcrição reversa a 55 °C por 10 min; 2) um ciclo de desnaturação inicial a 95 °C por 1 min; e 3) 40 ciclos de desnaturação (95 °C para 10 s), extensão (60 °C para 30 s) e aquisição de sinal fluorescente.
   6. Uma vez concluído o ensaio qRT-PCR, gere a curva padrão com base nas amostras de curva padrão usando o software de instrumento PCR em tempo real (Figura Suplementar S2A,B).
      NOTA: O software também calculará a quantidade de RNA NDV em amostras desconhecidas com base na curva padrão.
5. Testes de segurança para toxicidade aguda em camundongos
   1. Injete 1 × 10⁸ PFU de vírus por via intravenosa através da veia da cauda em três camundongos BALB/C de 8 semanas de idade para avaliar a toxicidade aguda.
   2. Monitore os camundongos para eventos adversos como perda de peso (>20%), postura curvada, casacos de babados, letargia e mudanças na respiração. Avalie três a quatro vezes por dia durante as primeiras 48 horas. Como os ratos devem começar a se recuperar depois das 48h, monitore-os uma a duas vezes por dia até que esteja totalmente recuperado.
      1. Administrar o cuidado salino subcutâneamente e de suporte conforme necessário. Por exemplo, suplemente com gel diet de recuperação, manteiga de amendoim ou use discos de calor. Eutanize camundongos que atingiram critérios de ponto final, conforme descrito pelas diretrizes institucionais de cuidados com animais, por overdose de isoflurane seguido de deslocamento cervical.

Colheita de fluido allantóico
Como o fluido allantóico é colhido de ovos de galinha embrionados, deve parecer claro e transparente. Se o fluido parecer opaco e amarelo, isso indica a presença de contaminantes. A inclusão desse fluido allantóico durante a purificação impedirá o processo de purificação, pois a pressão aumentará rapidamente e ultrapassará 10 psi, resultando na cisalhamento do vírus e perda do vírus infeccioso. Fluido allantóico que parece sangrento sugere que os ovos foram inoculados com muitos PFU de vírus. O rendimento deste lote de ovos será significativamente menor do que o esperado e é improvável que este vírus possa ser usado in vivo. Os ovos inoculados com NDV lentogênico ainda devem ter vasculatura evidente após 72 h e os embriões não deveriam ter morrido, como visualizado na Figura 1. Se o fizeram, isso sugere que o embrião foi danificado ou contaminado de alguma forma.

Ultracentrifugação de gradiente de densidade iodixanol
Após a ultracentrifugação, uma banda de alto nível, branca e contendo NDV deve estar localizada entre os gradientes de 10% e 20% (Figura 4B).

Mancha coomassie de géis SDS-PAGE
A Figura 5 demonstra a diferença entre um estoque de vírus não purificado (Pista 2) e um vírus purificado (Pista 3). Uma comparação entre as duas mostra uma diminuição significativa na intensidade das bandas de proteínas contaminantes e no surgimento de bandas dominantes de NDV no estoque de vírus purificados.

Quantificação de titer viral por TCID50
Se utilizar as condições recomendadas ao se concentrar em um estoque concentrado de NDV, a CPE deve ser evidente após as 24h (Figura 6). Em comparação com uma cepa lentagênica NDV de titulação semelhante, o CPE é mais pronunciado na cepa mesogênica ao mesmo tempo.

Análise de toxicidade aguda em camundongos BALB/C de 8 semanas
Quando 1 × 108 PFU foram administrados por via intravenosa, os camundongos devem ser monitorados para efeitos adversos como perda de peso > 20%, casaco de babados, postura curvada e respiração anormal. Dentro das primeiras 24-36 h, os ratos começarão a perder peso e provavelmente desenvolverão casacos de babados e uma postura curvada. No entanto, se o vírus é suficientemente puro, os camundongos começam a se recuperar, como observado pelo ganho de peso e melhora na postura e condição do casaco após 36 h. Os camundongos que não apresentam esses sinais de recuperação até 36 h devem continuar a ser monitorados de perto para critérios de ponto final. Normalmente, isso tem acontecido por causa de uma titulação imprecisa, potencialmente devido à agregação de partículas de vírus.

Figura 1: Infecção e colheita de NDV de ovos de galinha embrionados sem patógenos especificados. (A) Vasculatura semelhante à Web (setas) que deve ser aparente após 9 dias de incubação, além do movimento do embrião. 'X' denota a interface entre a membrana corioallantóica e a cavidade do ar, e onde o orifício deve ser criado para a inoculação do ovo. (B) Imagem representando um embrião morto. Note a ausência de vasculatura weblike. Também será observada falta de movimento de embrião. (C) Diagrama dos componentes de um ovo de galinha embrionado mostrando as localizações da cavidade de ar, saco de gema, saco amniótico, membrana corioallantóica e fluido allantóico. (D) Remoção da concha para expor a membrana coriallantónica. (E) Ilustra como o fluido allantóico e o embrião devem parecer após a abertura da membrana corioallantónica. Abreviação: NDV = Vírus da doença de Newcastle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Esquemático delineando a assembleia geral do aparelho utilizado para filtragem de profundidade. Certifique-se de que o medidor de pressão está instalado a montante do filtro de profundidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Configuração de filtragem de fluxo tangencial em suas diferentes configurações. As setas mostram a direção do fluxo de fluidos. (A) Ilustração de como o TFF é montado. (B) Esquema do sistema TFF em sua configuração "aberta" utilizada durante a purificação e concentração de fluido. (C) Esquema da configuração TFF quando o fluido está sendo elucido do sistema, como usado durante a eluição do vírus e solução de limpeza. (D) Esquema do sistema TFF em sua configuração "fechada", que é usada durante a limpeza do sistema TFF. Abreviação: TFF = Filtração de fluxo tangencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Ultracentrifugação gradiente de densidade e diálise do vírus concentrado de TFF. (A) Esquemático mostrando a composição do gradiente de densidade iodixanol. (B) Padrão de banda de vírus após a ultracentrifugação do vírus produzido usando tampão ML durante o processo de purificação. A principal banda contendo vírus é denotada por um oval negro. (C) Tamanho típico de um de diálise carregado com 10 mL de vírus preparado através de um gradiente iodixanol no final do procedimento de diálise. Abreviação: TFF = Filtração de fluxo tangencial; ML = Mannitol-Lysine. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Gel SDS-PAGE manchado de coomassie. Gel compara a presença de proteínas contaminantes entre os estoques de NDV mesogênicos não purificados (pista 2) quando 1 × 105 PFU foram carregados. Faixas 1 e 4 = escada de peso molecular (MW). NDV HN, F0, e suas subunidades seguindo o decote, F1 e F2, juntamente com seus respectivos pesos moleculares27 são mostrados em fonte branca. Abreviaturas: SDS-PAGE = sulfato de sulfato-poliacrilamida de sódio eletroforese; NDV = Vírus da doença de Newcastle; PFU = unidades formadoras de placas; HN = hemaglutina; F0 = Fusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Exemplo de um layout de placa de 96 poços usado para determinar o titulação do vírus pelo TCID50. A placa é dividida em 12 colunas, com cada coluna representando uma diluição serial diferente. Os poços positivos (conforme determinado por CPE, expressão transgênica ou IFA) são indicados em cinza. Dado o número de poços positivos neste exemplo, o titer esperado após o uso da calculadora de titer Spearman-Karber (Tabela 2) está listado tanto em TCID50/mL quanto PFU/mL. Abreviaturas: TCID50 = dose infecciosa da cultura tecidual mediana; CPE = efeito citopático; IFA = ensaio de imunofluorescência; PFU = unidades formadoras de placas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Comparação do CPE após infecção de células DF1 com NDV lentogênico ou mesogênico. Um MOI de 0,5 foi utilizado após 10 h de incubação (A-D) ou 24 h de incubação (E-H) em diferentes condições culturais de DMEM + 15% FBS, DMEM + 15% FBS + 5% de fluido allantóico, ou DMEM + 2% FBS + 125 μg/mL trypsin. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: CPE = efeito citopático; NDV = Vírus da doença de Newcastle; MOI = multiplicidade de infecção; FBS = soro bovino fetal; DMEM = Meio de Águia Modificada de Dulbecco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Um exemplo de situação em que a IFA é necessária para titer a lentogenic NDV sem um transgene GFP. As células vero foram cultivadas em DMEM contendo 2% de FBS e 125 μg/mL trypsin. As imagens foram tiradas da diluição em série 10-7 . (A) Imagem brightfield de células infectadas. (B) Ilustra a aparência típica de células manchadas quando a IFA é usada para detectar vírus. (C) Uma imagem mesclada de (A) e (B). Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: IFA = ensaio de imunofluorescência; NDV = Vírus da doença de Newcastle; GFP = proteína fluorescente verde; FBS = soro bovino fetal; DMEM = Meio de Águia Modificada de Dulbecco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Primers PCR e RT-qPCR para detecção de segmentos genéticos de vírus da doença de Newcastle. Conjuntos de primer utilizados para a amplificação específica de duas regiões do genoma NDV. O conjunto de primer de proteína F resulta na amplificação de uma região da proteína F que abrange o local de decote da proteína F. O conjunto de primer transgene amplifica a região intergênica entre os genes fosfoproteína e matriz, o local ideal de inserção transgênica. Esta tabela também contém as sequências de primer que visam o gene Lviral 21 e o teste genético L usado no ensaio qRT-PCR. Abreviaturas: PCR = reação em cadeia de polimerase; RT-qPCR = PCR quantitativo de transcrição reversa; NDV = Vírus da doença de Newcastle. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Calculadora de titer Spearmann-Karber. Esta planilha interativa contém o fluxo de trabalho apropriado e equações para determinar a concentração de vírus usando os resultados do TCID50 com base no bem inóculo em mL, esquema de diluição e o número de réplicas por diluição. A concentração é relatada como volume em mL necessário para infectar 50% da cultura tecidual (TCID50) e unidades formadoras de placas por mL de suspensão do vírus. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura Suplementar S1: Determinação de concentrações iodixanol. (A) Curva padrão gerada a partir da absorção de soluções de concentração de iodixanol conhecida a 340 nm. (B) A curva padrão e a equação de (A) foram utilizadas para determinar a concentração de iodixanol na solução após a ultracentrifugação gradiente de densidade, diálise e concentração de polietilenoglicol. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S2: Amplificação e curva padrão gerada a partir do ensaio qRT-PCR do fragmento de DNA sintético de 500 bp de dupla retração do gene NDV L. A amplificação (A) e a curva padrão (B) foram criadas a partir de amostras contendo diluição serial de dez vezes (1,0 × 109 cópias para 1,0 × 100 cópias) do fragmento de DNA. Para a amplificação e curva padrão, as amostras contendo 1,0 × 101 cópias e 1,0 × 100 cópias estavam abaixo do limiar e não produziam um valor de ponto de cruzamento abaixo de 35 Cp. A curva padrão final foi gerada com base em amostras contendo 1,0 × 109 cópias para 1,0 × 102 cópias do fragmento de DNA. (C) sequência de DNA do fragmento genético NDV L nucleotídeo de 500 nucleotídeos usado para gerar a curva padrão no protocolo qRT-PCR. Abreviaturas: PCR = reação em cadeia de polimerase; RT-qPCR = PCR quantitativo de transcrição reversa; NDV = Vírus da doença de Newcastle; Cp = ponto de travessia. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S3: Carregamento e extração de NDV do de diálise. (A) O tamanho típico de um de diálise após ser carregado com aproximadamente 10 mL de solução contendo vírus isolado de um gradiente de densidade de sacarose e imageado no final da etapa de diálise. (B) Um exemplo dos resultados obtidos ao usar ultracentrifugação de gradiente de densidade iodixanol sem suplementação de tampão de ML. Encircled é a banda de vírus alvo para remoção. Indicada pelas setas é uma banda adicional que pode conter virions danificados. Observe que após a incorporação do tampão ML no processo de purificação, esta banda não é mais aparente. Abreviaturas: NDV = Vírus da doença de Newcastle; ML = mannitol-lysine. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Tabela Suplementar S1: Fornece as etapas necessárias para a geração de soluções de manchas ocidentais e tampão ML utilizado durante o processo de purificação. Abreviaturas: SDS-PAGE = sulfato de sulfato-poliacrilamida de sódio eletroforese; TEMED = tetrametetilenodiamina; ML = Mannitol-lysine. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.