Aqui fornecemos um procedimento detalhado para produção, purificação e quantificação do vírus recombinante da doença de Newcastle. Este protocolo rende consistentemente > 6 × 109 unidades formadoras de placas/mL, fornecendo quantidades de vírus apropriadas para estudos in vivo em animais. Ensaios adicionais de controle de qualidade para garantir a segurança in vivo são descritos.
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Artigo de método
Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico
Neste artigo
Resumo
Resumo
O vírus da doença de Newcastle (NDV), também conhecido como sorotipo-1 ortoavulavírus aviário, é um vírus de RNA de uma única faixa que foi desenvolvido tanto como um vírus oncolítico quanto uma vacina viral vetorial. O NDV é um agente terapêutico e profilático atraente devido ao seu sistema genético reverso bem estabelecido, propriedades imunostimulatórias potentes e excelente perfil de segurança. Quando administrado como um vírus oncílico ou uma vacina viral vetorial, o NDV provoca uma resposta imune robusta ou específica de antígeno, ativando os braços inatos e adaptativos do sistema imunológico.
Dadas essas características desejáveis, o NDV tem sido avaliado em inúmeros ensaios clínicos e é um dos vírus oncolíticos mais bem estudados. Atualmente, existem dois ensaios clínicos registrados envolvendo NDV: um avaliando uma vacina recombinante de NDV vetored para SARS-CoV-2 (NCT04871737), e um segundo avaliando um NDV recombinante codificando Interleukin-12 em combinação com Durvalumab, um anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar o avanço desse vetor viral altamente promissor, são necessários métodos simplificados para gerar ndv de alto nível, in vivo e recombinante (rNDV).
Este artigo descreve um procedimento detalhado para amplificar o rNDV em ovos de galinha embrionados sem patógenos especificados (SPF) e purificar o rNDV do fluido allantóico, com melhorias para reduzir a perda durante a purificação. Também estão incluídas descrições dos ensaios de controle de qualidade recomendados, que devem ser realizados para confirmar a falta de contaminantes e integridade do vírus. No geral, este procedimento detalhado permite a síntese, purificação e armazenamento de alto título, in vivo-grau, recombinante, lentogênico e mesogênico NDV para uso em estudos pré-clínicos.
Introdução
O Newcastle Disease Virus, também conhecido como Ortoavulavírus-1, é um paramyxovírus aviário envolto com potencial para ser usado tanto como um vírus oncolítico quanto como uma vacina viralvetorial 1,2,3,4,5,6,7. Mais recentemente, o NDV projetado para expressar a proteína de pico de SARS-CoV-2 tem sido caracterizado como uma vacina intranasal eficaz nos modelos de desafio de camundongos ehamsters
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Protocolo
Todo o trabalho envolvendo o uso de animais foi aprovado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Guelph, de acordo com o Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Todo o trabalho é realizado em um laboratório biossegurança nível 2 (BSL2) no Canadá, onde o NDV mesogênico é um Patógeno do Grupo de Risco 2. Todas as etapas envolvidas na amplificação e purificação do NDV devem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica tipo IIA para fins de segurança e esterilidade.
1. Amplificação do NDV utilizando ovos de galinha embrionários sem patógenos especificados
- Inoculação de ovos de galinha embrio....
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Resultados
Colheita de fluido allantóico
Como o fluido allantóico é colhido de ovos de galinha embrionados, deve parecer claro e transparente. Se o fluido parecer opaco e amarelo, isso indica a presença de contaminantes. A inclusão desse fluido allantóico durante a purificação impedirá o processo de purificação, pois a pressão aumentará rapidamente e ultrapassará 10 psi, resultando na cisalhamento do vírus e perda do vírus infeccioso. Fluido allantóico que parece sangrento sugere que os ovos foram inoculados com.......
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Discussão
Os vírus utilizados como agentes terapêuticos em estudos pré-clínicos devem ser altamente purificados para evitar a toxicidade quando administrados in vivo15. Se agentes aventureiros ou contaminantes não forem removidos, isso pode levar a reações adversas graves negando o efeito terapêutico do agente viral28. Como o NDV é produzido em ovos de galinha embrionados, existem várias proteínas de ovos contaminantes, como a ovalbumina, que devem ser removidas antes de seu.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
J.G.E.Y foi o beneficiário de uma bolsa de doutorado da Faculdade de Veterinária de Ontário e uma bolsa de pós-graduação em Ontário. Este trabalho foi financiado pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants to SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,25% de tripsina | HyClone | SH30042,02 | |
| 1 mL Seringa de ponta deslizante | BD | 309659 | |
| Seringa Luer-Lok de 10 mL | BD | 302995 | |
| Solução de iodopovidona a 10% | LORIS | 109-08 | |
| Tubos cônicos de 15 mL | Thermo-Fisher | 14955240 | |
| 18G x 1 1/2 pol. Agulha de enchimento sem corte | BD | 305180 | |
| 18G x 1 1/2 in Agulha de Deslizamento de Precisão | BD | 305196 | |
| 25 G x 5/8 in Agulha | BD | 305122 | |
| 2-Mercaptoetanol | Thermo-Fisher | 03446I-100 | |
| 30% Acrilamida/Bis Solução 37.5:1 | BioRad | 1610158 | |
| 4% Paraformaldeído-PBS | Thermo-Fisher | J19943-K2 | |
| 5 mL Seringa Luer-Lok | BD | 309646 | |
| Placa de Cultura de Tecidos de 96 Poços - Fundo Plano | Greiner Bio One | 655180 | |
| Ácido Acético, Glacial | Thermo-Fisher | A38-212 | |
| Agarose | Froggabio | A87-500G | |
| Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse | Invitrogen | A11001 | |
| Allegra X-14 Centrífuga | Beckman Coulter | B08861 | |
| Persulfato de Amônio | BioRad | 161-0700 | |
| Alvejante (5%) | Thermo-Fisher | 36-102-0599 | |
| Pinça larga e sem ponta serrilhada | Thermo-Fisher | 09-753-50 | |
| Bromofenol Azul | Sigma-Aldrich | 114405-25G | |
| Centramate Titular | PALL | CM018V | |
| ChemiDoc XRS+ | BioRad | 1708265 | |
| CO2 Incubadora | Thermo-Fisher | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-259 | Thermo-Fisher | BP101-50 | |
| DF1 Células | ATCC | CRL-12203 | |
| Gel de Dieta Recuperação | ClearH2O, INC | 72-01-1062 | |
| Digital 1502 Incubadora de Ovos Sportsman | Berry Hill | 1502W | |
| D-Manitol | Sigma-Aldrich | M4125-500G | |
| Ovo Candler | Berry Hill | A46 | |
| Etanol (70%) | Thermo-Fisher | BP82031GAL | |
| Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8.0, 0.5 M in H2O | Thermo-Fisher | BP2482-500 | |
| , nylon, 1/8 pol NPT(F) | Cole-Parmer | 06349-50 | |
| Soro Fetal Bovino | Gibco | 12483-020 | |
| Pinça de Alta Precisão de Ponta Fina | Thermo-Fisher | 22-327379 | |
| ZEISS AXIO | Não é necessário se não estiver realizando IFA ou se NDV não codificar uma proteína fluorescente | ||
| Sistema de Liofilização Freezone 4.5 | LABCONCO | ||
| GiBOX Gel Imager | Syngene | Imaging de géis de agarose | |
| Glycerol | Thermo-Fisher | G33-1 | |
| Glycine | Thermo-Fisher | BP381-5 | |
| Kit de transcriptase reversa de cDNA de alta capacidade | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium | Cytiva | SH30022.01 | |
| Kit de Umidade | Berry Hill | 3030 | |
| Iodixanol | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (p/v) solução de iodixanol em água (estéril) |
| L-Lisina Monocloridrato | Sigma-Aldrich | 62929-100G-F | |
| Macho e Fêmea Luer-Lok a 1/8 in rosca de tubo nacional, NPT | Cole-Parmer | 41507-44 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | RK-07522-20 | Bomba peristáltica com display digital |
| Masterflex L/S Cabeça de bomba de carga fácil para tubulação de precisão | Cole-Parmer | RK-07514-10 | |
| Tubulação de silício Masterflex (platina) L/S 16 | Cole-Parmer | 96420-16 | BioPharm Silicone curado com platina |
| MC Pro 5 Termociclador | Eppendorf | EP950040025 | |
| Metanol | Thermo-Fisher | A412-4 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | SDS-PAGE fundido e executando appartus |
| Mouse-Anti-NDV | Novus Biologicals | NBP2-11633 | Clone 6H12 |
| Soro de cabra normal | Abcam | AB7481 | |
| NP-40 | Thermo-Fisher | 85124 | |
| Omega Membrane LV Centramate, 100K | PALL | OS100T02 | |
| Ultracentrífuga Optima XE-90 | Beckman Coulter | A94471 | |
| OWL Easycast B1A Mini Sistema de Eletroforese em Gel | Thermo-Fisher | B1A | |
| PBS 10X Solução | Thermo-Fisher | BP399-20 | |
| Poli (Etilenoglicol) Mn Médio 20.000 | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| PowePac 300 | BioRad | Modelo 1655050 - para eletroforese em gel de agarose | |
| Q5 Alta Fidelidade 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492S | |
| QIA Amp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| RedSafe | Thermo-Fisher | 50999562 | |
| Slide-a-lyzer de Diálise (Força Extra), 10.000 MWCO 0.5-3 mL | Thermo-Fisher | 66380 | |
| Dodecil Sulfato de Sódio | Thermo-Fisher | BP166-500 | |
| Hidróxido de Sódio (Pellets) | Thermo-Fisher | S318-10 | |
| Ovos livres de patógenos específicos | CFIA | NA | O fornecedor varia dependendo da localização |
| Sucarose | Thermo-Fisher | S5-3 | |
| Supracap 50 Filtro de Profundidade | PALL | SC050V100P | |
| Tesoura | CirúrgicaThermo-Fisher | 08-951-5 | |
| Rotor Sw41Ti | Beckman Coulter | 331362 | Usado na etapa de protocolo 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 |
| SX4750 Rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| SxX4750 Adaptador para tubos de fundo concial | Beckman Coulter | 359472 | |
| TEMED | Invitrogen | 15524-010 | |
| Tubos de centrífuga Ultraclear de parede fina ( 9/16 pol x 3 1/2 pol) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris Base | Thermo-Fisher | BP152-5 | |
| Braçadeira de Parafuso de Tubulação | PALL | 88216 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-1L | |
| Manômetros de Pressão de Utilidade | Cole-Parmer | 68355-06 |
Referências
- Kim, S. H., Samal, S. K. Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines. Viruses. 8 (7), (2016).
- Kortekaas, J., et al. Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector. V....
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Reimpressões e permissões
