Name: Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprenda a produzir vírus da doença de Newcastle de alto título usando filtração tangencial e ultracentrifugação. Este protocolo garante rendimento superior a 6 × 10⁹ unidades formadoras de placa/mL para estudos in vivo seguros.

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J.G.E.Y foi o beneficiário de uma bolsa de doutorado da Faculdade de Veterinária de Ontário e uma bolsa de pós-graduação em Ontário. Este trabalho foi financiado pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants to SKW (grant #304737) e LS (grant #401127).

<ol><li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
<li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+paramyxoviruses%3A+mechanism+of+action%2C+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molekuliarnaia+Biologiia%22%5BJournal%5D)">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li>
<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
<li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li>
<li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219(2021).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+the+spike+protein+of+SARS-CoV-2+as+a+live+virus+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate.</a> EBioMedicine. 62, (2020).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
<li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic%3A+clinical-grade+production%2C+purification%2C+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).</li>
<li>Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).</li>
<li>Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+and+M+gene+junction+is+the+optimal+insertion+site+in+Newcastle+disease+virus+vaccine+vector+for+foreign+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression.</a> The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).</li>
<li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).</li>
<li>Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ulster+strain+Newcastle+disease+virus+hemagglutinin-neuraminidase+reveals+auto-inhibitory+interactions+associated+with+low+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).</li>
<li>Sheets, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+on+adventitious+agents+testing+for+vaccines%3A+Why+do+we+worry+so+much+about+adventitious+agents+in+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines.</a> Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).</li>
<li>Chung, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+allergies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Vaccine allergies.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50(2014).</li>
<li>Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+clinical+application+of+Newcastle+disease+virus%3A+time+to+celebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate.</a> Biomedicines. 4 (3), (2016).</li>
<li>Ajamian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL5+persists+in+RSV+stocks+following+sucrose-gradient+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).</li>
<li>Axis-Shield. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Axis-Shield+OptiPrepTM+The+ideal+density+gradient+medium+for+isolation+of+blood+cells%22">Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells</a>. , (2020).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li>
<li>Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+respiratory+syncytial+virus+by+ultracentrifugation+in+iodixanol+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient.</a> Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li>
<li>Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Os vírus utilizados como agentes terapêuticos em estudos pré-clínicos devem ser altamente purificados para evitar a toxicidade quando administrados in vivo15. Se agentes aventureiros ou contaminantes não forem removidos, isso pode levar a reações adversas graves negando o efeito terapêutico do agente viral28. Como o NDV é produzido em ovos de galinha embrionados, existem várias proteínas de ovos contaminantes, como a ovalbumina, que devem ser removidas antes de seu...

O Newcastle Disease Virus, também conhecido como Ortoavulavírus-1, é um paramyxovírus aviário envolto com potencial para ser usado tanto como um vírus oncolítico quanto como uma vacina viralvetorial 1,2,3,4,5,6,7. Mais recentemente, o NDV projetado para expressar a proteína de pico de SARS-CoV-2 tem sido caracterizado como uma vacina intranasal eficaz nos modelos de desafio de camundongos ehamsters 7,8,9. Quando usado como imunoterapia contra o câncer, resulta no recrutamento de células imunes inatas, especificamente células assassinas naturais, produção de interferon tipo I, e a geração de células T específicas do antitumoral 10,11,12,13. Além dessas potentes propriedades imunoestimulatórias, o NDV possui um forte perfil de segurança e um sistema genético reverso bem estabelecido14,15. Essas características desejáveis têm solicitado a avaliação do NDV em numerosos ensaios clínicos pré-clínicos e humanos (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Para avançar ainda mais este vetor viral altamente promissor e estimulante imunológico, métodos detalhados são necessários para produzir e purificar ndv ultra-puro de alta titer que pode ser administrado com segurança in vivo.
Como o NDV é um paramyxovírus aviário, é mais frequentemente amplificado em ovos de galinha embrionados. Embora existam sistemas baseados em células disponíveis para propagação de NDV, a maioria não foi capaz de produzir títulos semelhantes aos alcançados em ovos de galinha embrionados18. No entanto, existem algumas desvantagens na produção de NDV em ovos, incluindo o fato de que a produção à base de ovos é longa e não facilmente escalável, a fonte de grandes quantidades de ovos de galinha SPF pode ser problemática, e existe o potencial de contaminação com alérgenos de ovos 13,18,19,20 . Recentemente, um grupo mostrou que as células Vero cultivadas em suspensão em meio livre de soro podem suportar a replicação de NDV para titers comparáveis aos obtidos em ovos, antes da purificação21. No entanto, isso exigiu a passagem serial do vírus para adaptar o vírus às células Vero, e a otimização de um método para purificar o NDV das células Vero suspensas ainda é necessária21.
Como destacado anteriormente, os métodos utilizados para purificar o vírus de alto nível, in vivo de grau, variam dependendo do vírus na questão22. Existe um sistema genético reverso bem estabelecido disponível para a geração de NDV recombinante. Este processo, envolvendo o uso de um clone cDNA, plasmídeos auxiliares e um vírus auxiliar que expressa polimerase T7 RNA, foi descrito anteriormente em detalhes15,23. Este protocolo pode ser aplicado a NDV lentogênico ou mesogênico. O vírus descrito neste protocolo é um NDV mesogênico recombinante codificando a proteína fluorescente verde (GFP) da água-viva Aequorea victoria inserida entre genes P e M virais como uma unidade de transcrição individual, pois este foi descrito anteriormente como o local ideal para a inserção de transgenesestrangeiros 24.
Os métodos fechados descrevem a purificação do NDV com base em seu tamanho, variando de 100 a 500 nm, e sua densidade15. Isso permitiu que a geração de estoques NDV de alto nível e alto nível em aproximadamente 3 semanas, a partir de quando os ovos são recebidos até ter um título final. São descritas técnicas frequentemente utilizadas na produção em larga escala de vírus à base de ovos, como filtração de fluxo tangencial, filtração de profundidade e ultracentrifugação de gradiente de densidade, permitindo a tradução desses métodos para uma produção em maior escala. Técnicas descritas anteriormente para a purificação do NDV foram aprimoradas pela incorporação de um tampão estabilizador de vírus, uso de iodixanol durante a ultracentrifugação de gradiente de densidade e pela descrição de várias medidas de controle de qualidade para garantir a qualidade in vivo 15. Isso permitiu a purificação de NDV de grau vivo atingindo títulos de até 3 × 1010 PFU/mL de 0,8 a 1,0 L de fluido allantóico.

<table><tbody><tr><td>0,25% de tripsina</td><td>HyClone</td><td>SH30042,02</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Seringa de ponta deslizante</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Luer-Lok de 10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodopovidona a 10%</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 pol. Agulha de enchimento sem corte</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 in Agulha de Deslizamento de Precisão</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 5/8 in Agulha</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrilamida/Bis Solução 37.5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído-PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Seringa Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos de 96 Poços - Fundo Plano</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético, Glacial</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Goat-Anti-Mouse</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-14 Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante (5%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>Pinça larga e sem ponta serrilhada</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Titular</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Células</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>Gel de Dieta Recuperação</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Digital 1502 Incubadora de Ovos Sportsman</td><td>Berry Hill</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ovo Candler</td><td>Berry Hill</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>Solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8.0, 0.5 M in H2O</td> Conexões de T rosqueadas fêmeas <td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>, nylon, 1/8 pol NPT(F)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Alta Precisão de Ponta Fina</td> Microscópio Fluorescente <td>Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>Não é necessário se não estiver realizando IFA ou se NDV não codificar uma proteína fluorescente</td></tr><tr><td>Sistema de Liofilização Freezone 4.5</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX Gel Imager</td><td>Syngene</td><td></td><td>Imaging de géis de agarose</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcriptase reversa de cDNA de alta capacidade</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>High Glucose Dulbecco's Modified Essential Medium</td><td>Cytiva</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Umidade</td><td>Berry Hill</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60% (p/v) solução de iodixanol em água (estéril)</td></tr><tr><td>L-Lisina Monocloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>Macho e Fêmea Luer-Lok a 1/8 in rosca de tubo nacional, NPT</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>Bomba peristáltica com display digital</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Cabeça de bomba de carga fácil para tubulação de precisão</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de silício Masterflex (platina) L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>BioPharm Silicone curado com platina</td></tr><tr><td>MC Pro 5 Termociclador</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE fundido e executando appartus</td></tr><tr><td>Mouse-Anti-NDV</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>Clone 6H12</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Omega Membrane LV Centramate, 100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A Mini Sistema de Eletroforese em Gel</td><td>Thermo-Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X Solução</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Poli (Etilenoglicol) Mn Médio 20.000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>Modelo 1655050 - para eletroforese em gel de agarose</td></tr><tr><td>Q5 Alta Fidelidade 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer de Diálise (Força Extra), 10.000 MWCO 0.5-3 mL</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio (Pellets)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>Ovos livres de patógenos específicos</td><td>CFIA</td><td>NA</td><td>O fornecedor varia dependendo da localização</td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 Filtro de Profundidade</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td> <td>CirúrgicaThermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Rotor Sw41Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>Usado na etapa de protocolo 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td></tr><tr><td>SX4750 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>SxX4750 Adaptador para tubos de fundo concial</td><td>Beckman Coulter</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Ultraclear de parede fina ( 9/16 pol x 3 1/2 pol)</td> <td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Braçadeira de Parafuso de Tubulação</td><td>PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manômetros de Pressão de Utilidade</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de vírus da doença de newcastle recombinante de alta titer a partir de fluido allantóico

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

O vírus da doença de Newcastle (NDV), também conhecido como sorotipo-1 ortoavulavírus aviário, é um vírus de RNA de uma única faixa que foi desenvolvido tanto como um vírus oncolítico quanto uma vacina viral vetorial. O NDV é um agente terapêutico e profilático atraente devido ao seu sistema genético reverso bem estabelecido, propriedades imunostimulatórias potentes e excelente perfil de segurança. Quando administrado como um vírus oncílico ou uma vacina viral vetorial, o NDV provoca uma resposta imune robusta ou específica de antígeno, ativando os braços inatos e adaptativos do sistema imunológico. 
Dadas essas características desejáveis, o NDV tem sido avaliado em inúmeros ensaios clínicos e é um dos vírus oncolíticos mais bem estudados. Atualmente, existem dois ensaios clínicos registrados envolvendo NDV: um avaliando uma vacina recombinante de NDV vetored para SARS-CoV-2 (NCT04871737), e um segundo avaliando um NDV recombinante codificando Interleukin-12 em combinação com Durvalumab, um anticorpo antiPD-L1 (NCT04613492). Para facilitar o avanço desse vetor viral altamente promissor, são necessários métodos simplificados para gerar ndv de alto nível, in vivo e recombinante (rNDV). 
Este artigo descreve um procedimento detalhado para amplificar o rNDV em ovos de galinha embrionados sem patógenos especificados (SPF) e purificar o rNDV do fluido allantóico, com melhorias para reduzir a perda durante a purificação. Também estão incluídas descrições dos ensaios de controle de qualidade recomendados, que devem ser realizados para confirmar a falta de contaminantes e integridade do vírus. No geral, este procedimento detalhado permite a síntese, purificação e armazenamento de alto título, in vivo-grau, recombinante, lentogênico e mesogênico NDV para uso em estudos pré-clínicos.

Colheita de fluido allantóico Como o fluido allantóico é colhido de ovos de galinha embrionados, deve parecer claro e transparente. Se o fluido parecer opaco e amarelo, isso indica a presença de contaminantes. A inclusão desse fluido allantóico durante a purificação impedirá o processo de purificação, pois a pressão aumentará rapidamente e ultrapassará 10 psi, resultando na cisalhamento do vírus e perda do vírus infeccioso. Fluido allantóico que parece sangrento sugere que os ovos foram inoculados com...

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para produção, purificação e quantificação do vírus recombinante da doença de Newcastle. Este protocolo rende consistentemente > 6 × 109 unidades formadoras de placas/mL, fornecendo quantidades de vírus apropriadas para estudos in vivo em animais. Ensaios adicionais de controle de qualidade para garantir a segurança in vivo são descritos.

Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Este protocolo descreve as técnicas usadas para produzir o Newcastle Disease Virus para que possa ser administrado com segurança para camundongos e outros animais, como hamsters e ovelhas. O uso da filtragem de fluxo tangencial permite que grandes volumes iniciais sejam processados de forma mais eficiente em comparação com os procedimentos existentes que utilizam apenas processos de centrifugação. Este é um procedimento demorado envolvendo várias etapas complexas, o que significa que o gerenciamento do tempo pode ser um problema.Recomendo identificar todos os passos potenciais de pausa para que a técnica possa ser dividida adequadamente, minimizando o estresse. Demonstrando este procedimento estará Alex, um assistente de pesquisa do meu laboratório. Para a purificação do Newcastle Disease Virus ou NDV, primeiro, prime o sistema experimental previamente definido executando 50 mililitros de PBS através dele.Pare a bomba quando aproximadamente cinco mililitros de PBS forem deixados no tubo. Em seguida, conecte um filtro de profundidade com uma classificação de retenção de um a três micromolars à tubulação. Para desovendar o filtro, remova a segunda tampa do lado epical do filtro de profundidade e comece a executar mais 50 mililitros de PBS através do sistema.Uma vez que o PBS começa a fluir através da ventilação na parte superior do filtro, feche a porta e continue a fluir PBS através das linhas. Depois disso substitua o vaso de resíduo por um novo vaso de coleta estéril e comece a executar o fluido allantóico através do filtro de profundidade. Em seguida, configure a filtragem de fluxo tangencial ou sistema TFF em uma confirmação aberta e executada conforme descrito no manuscrito.Quando restam cerca de cinco mililitros de fluido no reservatório, pare a bomba e adicione o fluido allantóico filtrado de profundidade ao reservatório. Em seguida, retome o fluxo da bomba. Para evitar o estalação do vírus, é importante garantir que a pressão do sistema não exceda a força de 10 libras por polegada quadrada.Para aumentar a ilusão, deve-se usar uma combinação da velocidade da bomba peristáltica e do grampo C. 150 a 100 mililitros de fluido allantóico são deixados no reservatório, pausam a bomba e trocam o buffer adicionando 150 a 200 mililitros de tampão ML. Novamente, pare a bomba quando cinco a 10 mililitros de fluido são deixados no reservatório, em seguida, usando dois grampos C fechar a linha da cintura.Desacoplar a linha retented alimentando o reservatório e inseri-lo em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, retome o fluxo e pare quando houver poucas gotas de fluido no tanque do reservatório. Em seguida, remova os grampos C das linhas de resíduos e recoloque a linha de alimentação retented ao tanque do reservatório.Enquanto isso, para se preparar para a ultracentrifugação de gradiente de densidade idixanol, primeiro adicione um tubo de ultra centrífugas de 0,5 mililitros de 40% iodixanol a um tubo ultra centrífugo de parede fina de 13,2 mililitros. Em seguida, prepare a coluna com sucessivas adições de 2,5 mililitros de 20% iodixanol, e 2,5 mililitros de 10% iodixanol. Antes da ultracentrifugação, adicione cuidadosamente seis a 6,5 mililitros da solução de vírus aludindo do sistema TFF à coluna iodixanol sem perturbar o gradiente.Após a ultracentrifugação, remova os tubos com um par de fórceps estéreis. A banda-alvo deve ser uma grande banda entre os 10 e 20% gradientes. Em seguida, suspenda o tubo sobre o topo de um béquer usando um suporte de réplica.Depois disso, conecte uma agulha de 1,5 polegadas de calibre 18 a uma seringa de cinco mililitros e, em seguida, puna o lado do tubo ultracentrífuga com a agulha e remova a faixa alvo, estendendo lentamente o êmbolo. Depois de remover iodixanol da solução do vírus como descrito no manuscrito, use uma seringa para injetar cuidadosamente o vírus em um de diálise. Para concentrar a solução do vírus, remova o de diálise do tampão de diálise e coloque-o em um pequeno saco plástico vedado.Em seguida, adicione um 15 a 25 mililitros de 40% de polietileno glicol ao saco para que o de diálise fique completamente submerso. Após a diálise enxague brevemente o de diálise com PBS. Em seguida, encha uma seringa equipada com uma agulha de 1,5 polegadas com ar, insira a seringa no de diálise e empurre o êmbolo.Gire o aparelho para remover o vírus sem remover nenhum ar introduzido. Para desalojar o vírus residual aderindo à membrana, massageie cuidadosamente a membrana com dedos enluvados sem danificá-la. Para facilitar o processo de desalojador, remova parte do excesso de ar no de diálise.Para ensaios de controle de qualidade, primeiro, diluir a solução do vírus 100 vezes adicionando 10 microliters dele a 990 microliters de PBS em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, continue a diluição serial adicionando 100 microliters da diluição anterior a 900 microliters de PBS. Para ensaios de infecção, adicione 20 microliters de cada ilusão a cada poço de uma placa de 96 poços.Antes de examinar o efeito citopático da proteína de fluorescência verde, ou realizar um ensaio indireto de imunofluorescência, incubar a placa a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por pelo menos 48 horas. Utilizando este protocolo, o NDV altamente purificado foi obtido como demonstrado pela eletroforese de gel de poliacrilamida de sódio das proteínas virais. A infectividade do vírus purificada por este método também foi verificada pela dose de infecção por cultura de tecido de 50% ou ensaio TCID50 feito em 96 placas de poço.O TCID50 foi determinado a partir do número de poços positivos para cada diluição usando a calculadora Spearman-Karber. O ensaio de infecção revelou a diferença entre os efeitos citopáticos do NDV lentogênico e mesogênico em DF uma células em diferentes condições após 10 e 24 horas de incubação. O ensaio imuno florence também foi eficaz no estudo da infecção das células Vero pelo NDV lentogênico.Ao priming o sistema experimental, certifique-se de que as linhas são preparadas efetivamente como qualquer hidróxido de sódio residual irá inativar o vírus. Também é importante manter a integridade da membrana, pois comprometer isso prejudicará significativamente a purificação e o rendimento do vírus.

production-high-titer-recombinant-newcastle-disease-virus-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

Neste artigo, descrevemos a identificação da adeno-associated virus sorotipo 3 (AAV3) como o vetor mais eficiente para alvejar células humanas de câncer de fígado.

De Alta Eficiência Transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 Vetores

Recombinante adeno-associated virus (rAAVs) vetores estão se tornando cada vez mais valioso...

Produção e titulação de adeno-associados recombinantes Vetores Virais

Descrevemos aqui um protocolo baseado apenas em infecção de células, o que melhora a eficiência da produção de parvovírus recombinante por mais de 100 vezes em comparação com outros protocolos em uso. Este protocolo assenta na utilização de um adenovírus romance 5-base auxiliar contendo o parvovírus unidade de transcrição VP (Ad-VP).

Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Resgate de arenavírus recombinantes a partir de ADNc clonados, uma abordagem designada por genética reversa, permite aos investigadores para investigar o papel dos produtos de genes virais específicos, bem como a contribuição dos seus vários domínios e resíduos específicos, de diferentes aspectos da biologia do arenavírus . Da mesma forma, inverter técnicas de genética em linhas de células aprovadas pela FDA (Vero) para o desenvolvimento da vacina proporciona novas possibilidades para a...

Geração de Arenavirus recombinante de Desenvolvimento de Vacinas no FDA-approved células Vero

O vírus da doença de Newcastle (NDV) tem sido extensivamente estudada nos últimos anos de forma a desenvolver novos vectores para a vacinação e a terapia, entre outros. Estes estudos têm sido possível devido às técnicas para resgatar vírus recombinante a partir do cDNA, tais como aqueles aqui descrita.

Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Ovos férteis de galinha são amplamente utilizados para produzir grandes quantidades de vírus da gripe humana A, pois fornecem um sistema conveniente e econômico para provar altos rendimentos de vírus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

Um procedimento simplificado e padronizado para gerar vetores de vírus adeno-associados de alto título e alta qualidade utilizando uma plataforma de fábrica de células

Este artigo apresenta um método simplificado para preparar o antígeno de 4 unidades de hemaglutinação para o teste sorológico do vírus da doença de Newcastle. Ao determinar com precisão o título de hemaglutinação do antígeno, combinado com um método de titulação reversa mais rigoroso e um processo de ajuste bem definido, aumenta a eficiência do teste, reduz os falsos positivos e melhora a vigilância da doença em aves.

Otimização da preparação do antígeno para ensaio de inibição da hemaglutinação da sorologia do vírus da doença de Newcastle

Aprenda a produzir vírus da doença de Newcastle de alto título usando filtração tangencial e ultracentrifugação. Este protocolo garante rendimento superior a 6 × 10⁹ unidades formadoras de placa/mL para estudos in vivo seguros.

Produção de Vírus da Doença de Newcastle Recombinante de Alta Titer a partir de fluido allantóico

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