Summary
O espalhamento dinâmico de luz (DLS) surgiu como um ensaio adequado para avaliar o tamanho de partículas e a distribuição de complexos ferro-carboidratos administrados por via intravenosa. No entanto, os protocolos carecem de padronização e precisam ser modificados para cada complexo ferro-carboidrato analisado. O presente protocolo descreve a aplicação e considerações especiais para a análise da sacarose ferrosa.
Abstract
Complexos de nanopartículas ferro-carboidrato administrados por via intravenosa são amplamente utilizados para tratar a deficiência de ferro. Esta classe inclui vários complexos de nanopartículas estruturalmente heterogêneos, que exibem sensibilidade variável às condições requeridas para as metodologias disponíveis para caracterizar físico-quimicamente esses agentes. Atualmente, os atributos críticos de qualidade dos complexos ferro-carboidrato ainda não estão totalmente estabelecidos. O espalhamento dinâmico de luz (DLS) surgiu como um método fundamental para determinar o tamanho e a distribuição de partículas intactas. No entanto, ainda existem desafios em relação à padronização de metodologias entre laboratórios, modificações específicas necessárias para produtos individuais de ferro-carboidrato e como a distribuição de tamanho pode ser melhor descrita. É importante ressaltar que o diluente e as diluições seriadas utilizadas devem ser padronizados. A grande variância nas abordagens para preparação de amostras e relato de dados limita o uso de DLS para a comparação de agentes ferro-carboidratos. Neste artigo, detalhamos um protocolo robusto e facilmente reprodutível para medir o tamanho e a distribuição de tamanho do complexo ferro-carboidrato, a sacarose de ferro, usando a média Z e o índice de polidispersidade.
Introduction
Sacarose de ferro (IS) é uma solução coloidal composta por nanopartículas consistindo de um complexo de um núcleo polinuclear de ferro-oxihidróxido e sacarose. O SI é amplamente empregado para tratar a deficiência de ferro entre pacientes com uma ampla variedade de estados patológicos subjacentes que não toleram a suplementação oral de ferro ou para os quais o ferro oral não é eficaz1. O SI pertence à classe de fármacos complexos definida pela Food and Drug Administration (FDA), que é uma classe de fármacos com química complexa compatível com os biológicos2. A avaliação regulatória de fármacos complexos pode requerer métodos físico-químicos ortogonais adicionais e/ou estudos pré-clínicos ou clínicos para comparar com precisão os fármacos complexos de follow-on 3,4. Isso é importante porque vários estudos relataram que o uso de SI versus um produto de SI de acompanhamento não produz os mesmos desfechos clínicos. Isso ressalta a criticidade do uso de técnicas de caracterização novas e ortogonais adequadas para detectar diferenças nas propriedades físico-químicas entre os produtos de SI 5,6.
A elucidação precisa do tamanho e da distribuição de tamanho do SI é de importância clínica, uma vez que o tamanho das partículas é um importante fator influente na taxa e extensão da opsonização, o primeiro passo crítico na biodistribuição desses complexos fármacos 7,8. Mesmo pequenas variações no tamanho de partículas e distribuição de tamanho de partículas têm sido relacionadas a mudanças no perfil farmacocinético de complexos nanoparticulados de óxido de ferro 9,10. Um estudo recente de Brandis e col. mostrou que o tamanho das partículas medidas pela DLS foi significativamente diferente (14,9 nm ± 0,1 nm vs. 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) quando comparados um medicamento de referência listado e um produto genérico de gluconato férrico de sódio, respectivamente11. A qualidade, a segurança e a eficácia consistentes de lote a lote dos produtos de carboidrato de ferro dependem inteiramente do aumento da escala do processo de fabricação, e a possível deriva de fabricação deve ser cuidadosamente considerada9. O processo de fabricação pode resultar em sacarose residual, que varia de acordo com o fabricante12. Quaisquer modificações nas variáveis do processo de fabricação podem levar a mudanças significativas no produto final do fármaco complexo no que diz respeito à estrutura, estabilidade complexa e disposição in vivo 9.
Para avaliar a consistência do fármaco e predizer o comportamento in vivo do fármaco, metodologias analíticas ortogonais contemporâneas são necessárias para determinar as propriedades físico-químicas de nanomedicamentos complexos. No entanto, há falta de padronização das metodologias, o que pode resultar em um alto grau de variação interlaboratorial no relato dos resultados13. Apesar do reconhecimento desses desafios pelas autoridades regulatórias globais e pela comunidade científica14, a maioria das características físico-químicas dos SI permanece pouco definida, e o complemento completo dos atributos críticos de qualidade no contexto dos documentos de orientação regulatória disponíveis não foi definido15. Os rascunhos de documentos de orientação específicos de produtos emitidos pelo FDA para complexos ferro-carboidrato sugerem a DLS como um procedimento para avaliar o tamanho e a distribuição de tamanho dos produtos de follow-on16,17.
Várias publicações têm detalhado protocolos de DLS estabelecidos para determinar as dimensões das nanopartículas deSI13,18. No entanto, como a preparação da amostra, as condições do procedimento, a instrumentação e os parâmetros de ajuste da instrumentação são diferentes entre os métodos publicados, os resultados do DLS não podem ser diretamente comparados na ausência de um método padronizado para interpretar os resultados13,18. A diversidade de metodologias e abordagens de relato de dados limita a avaliação adequada dessas características para fins comparativos19. É importante ressaltar que muitos dos protocolos de DLS publicados anteriormente para avaliar o SI não explicam o efeito da difusão da sacarose na suspensão devido à presença de sacarose livre, que demonstrou elevar espuriosamente os raios hidrodinâmicos calculados pela média Z das nanopartículas em soluções coloidais13,18. O presente protocolo visa padronizar a metodologia para a medição do tamanho de partícula e distribuição do SI. O método foi desenvolvido e validado para este fim.
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Protocol
1. Operação da máquina
- Iniciando a máquina e o software
NOTA: A Figura Suplementar S1A-D descreve as etapas para iniciar a máquina e o software.- Ligue o instrumento pelo menos 30 minutos antes de iniciar as medições e, em seguida, ligue o PC.
- Clique duas vezes no ícone do software do instrumento para iniciar o programa.
- Digite o nome de usuário e a senha na janela de login. Certifique-se de que cada usuário tenha sua própria conta.
- Aguarde até que as três barras pretas no canto inferior direito acendam verde, indicando que a unidade está pronta para operação.
- No caso de longos períodos de inatividade, quando o usuário for desconectado automaticamente, em Segurança, clique em Login e digite novamente a senha.
- Criando um arquivo de medição
NOTA: Um novo arquivo de medição é criado no início de cada dia de medição. Todas as medições são listadas e armazenadas no arquivo de medição. Para obter detalhes desse procedimento, consulte Figura suplementar S2A-B.- Crie um novo arquivo de medição clicando em Arquivo | Novo | Arquivo de medição. Na janela aberta, selecione o local de armazenamento e nomeie o arquivo de medição. Confirme os detalhes clicando em Salvar.
- Para abrir um arquivo, clique em Arquivo | Aberto | Arquivo de medição. Selecione o arquivo de medição na janela aberta, confirme os detalhes clicando em Abrir, selecione o nome do arquivo e clique em Salvar.
- Imprimindo os resultados
- Imprimir ou guardar os resultados do teste de adequação do sistema (TSM) (ver passo 1.5) e o valor médio da medição da amostra de acordo com a Figura Suplementar S3.
- Marque a(s) medida(s) na Visualização de Registros do Arquivo de Medição.
- Clique com o botão direito do mouse em Batch Print e aguarde até que outra pequena janela seja aberta.
- Selecione o relatório de Intensidade PSD nas opções e confirme-o clicando em OK.
- Procedimento geral para iniciar uma medição
NOTA: O procedimento para iniciar uma medição é descrito na Figura suplementar S4A-D. Siga o caminho descrito abaixo para o arquivo de parâmetro de unidade necessário (conhecido como SOP):- Selecione o SOP necessário na lista suspensa. Como os POPs usados mais recentemente são exibidos na lista, se um SOP mais antigo for necessário, selecione Procurar SOP e confirme clicando na seta verde. Assim que o local de armazenamento dos POPs for aberto, prossiga com a etapa 1.4.2.
NOTA: Para obter detalhes sobre os parâmetros importantes do sistema específicos para a sacarose de ferro (por exemplo, tempo de equilíbrio de um atenuador), consulte a Tabela 1. - Na janela aberta, faça as entradas necessárias em Nome do exemplo e Anotações. Confirme clicando em OK e aguarde até que a janela de medição seja aberta automaticamente.
- Inicie a medição clicando no botão verde Iniciar .
- Quando um sinal acústico soar no final da medição, feche a janela de medição .
- Selecione o SOP necessário na lista suspensa. Como os POPs usados mais recentemente são exibidos na lista, se um SOP mais antigo for necessário, selecione Procurar SOP e confirme clicando na seta verde. Assim que o local de armazenamento dos POPs for aberto, prossiga com a etapa 1.4.2.
- Medição do teste de adequação do sistema (TSM)
NOTA: Não toque na parte inferior da cubeta (zona de medição). No início e no final da sequência, meça o padrão de partículas de 20 nm.- Encha ~1 mL do padrão de partículas não diluídas em uma cubeta de poliestireno e feche com a tampa.
NOTA: O padrão diluído preparado na etapa 1.5.1 pode ser usado por 1 mês. - Após o enchimento, feche a cubeta e verifique se há bolhas de ar. Remova as bolhas de ar batendo levemente na cubeta.
- Coloque a cubeta no suporte da célula do instrumento com a marca de seta voltada para a frente e feche a tampa da câmara de medição.
- Carregue o parâmetro de unidade SOP e insira os seguintes dados na janela inicial:
Nome da amostra: SST 20 nm padrão de partícula
Em seguida, adicione uma observação: Número identificador e data de validade do padrão - Inicie a medição.
- Após o término da medição, quando soar o sinal acústico, feche a janela de medição.
- Imprimir o relatório (ver ponto 1.1.3).
NOTA: O SST é passado se o tamanho da partícula Z-média corresponde ao valor do certificado de análise ± 10%.
- Encha ~1 mL do padrão de partículas não diluídas em uma cubeta de poliestireno e feche com a tampa.
- Medição da solução de sacarose de ferro
- Pipetar 0,5 ml de uma solução de SI com um teor de ferro de 2% m/V para um balão volumétrico de 25 ml e encher até ao traço com água de baixas partículas (por exemplo, recém-desionizada e filtrada [tamanho dos poros 0,2 μm]); esta solução contém 0,4 mg Fe/ml.
NOTA: A preparação da amostra na etapa 1.6.1. com esta diluição específica foi estabelecida durante o desenvolvimento do método, e esta foi determinada como a diluição ideal para este fim. - Para limpeza preliminar, encha a cubeta de poliestireno aproximadamente 3/4 cheia com a solução de medição preparada, gire suavemente e, em seguida, esvazie o mais completamente possível.
NOTA: Não toque na parte inferior da cubeta (zona de medição) e evite bolhas de ar não agitando a cubeta. - Para a medição, pipetar 1 mL da solução de medição para a cubeta e colocar uma tampa.
- Verifique se há bolhas de ar na solução de medição na cubeta. Se houver bolhas de ar, remova-as batendo levemente na cubeta.
- Pipetar 0,5 ml de uma solução de SI com um teor de ferro de 2% m/V para um balão volumétrico de 25 ml e encher até ao traço com água de baixas partículas (por exemplo, recém-desionizada e filtrada [tamanho dos poros 0,2 μm]); esta solução contém 0,4 mg Fe/ml.
- Realizando a medição
- Coloque a cubeta de plástico com a solução de medição no dispositivo com a marca de seta virada para a frente e feche a tampa.
- Carregue o parâmetro SOP (consulte a etapa 1.4.1) e insira os seguintes dados na janela inicial:
Nome da amostra: Número do lote - Inicie a medição.
- Após o término da medição, quando o sinal acústico soar, feche a janela de medição .
- Calcular o valor médio das seis medidas individuais de acordo com a Figura Suplementar S5. Marque as medidas individuais na Exibição de Registros do Arquivo de Medição, clique com o botão direito do mouse em Criar Resultado Médio, adicione o nome do valor médio em Nome da Amostra e confirme clicando em OK.
- Aguarde até que o software crie um novo registro no final da lista e procure o nome inserido e o resultado médio nesse registro.
- Imprima o relatório (consulte a etapa 1.1.3).
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Representative Results
O método descrito foi validado de acordo com a ICH Q2(R1)20, que envolveu a medição de soluções de teste sob condições variadas. A precisão foi de apenas 0,5% RSD para o tamanho Z-médio, enquanto um máximo de 3,5% RSD foi calculado para o PDI. Os resultados médios dos diferentes analistas e dias diferiram apenas 0,4% para o tamanho médio Z e 1,5% para o PDI. As estatísticas foram calculadas a partir de 12 medições realizadas por dois analistas em dias variados. Nem as alterações na concentração de ensaio no intervalo de 50%-200% nem o armazenamento das soluções de ensaio até 5 dias em condições refrigeradas tiveram impacto no resultado final.
Parâmetros analisados
Tamanho médio Z
O diâmetro hidrodinâmico é dado como o tamanho médio das partículas Z, e o método para determinar isso é definido na ISO 22412:201717. O tamanho da média Z é um parâmetro também conhecido como média cumulativa. A média-Z é o parâmetro de tamanho DLS preferido, pois o cálculo da média-Z é matematicamente estável, e o resultado da média-Z é insensível ao ruído. Segundo a EMA e FDA, o tamanho médio Z juntamente com o PDI são os valores recomendados para a caracterização de nanomedicamentos15,16,21. O tamanho médio da partícula Z só é comparável com o tamanho medido por outras técnicas se a amostra tiver uma forma monomodal, esférica ou quase esférica, for monodispersa e for preparada em um dispersante adequado. Isso ocorre porque o tamanho médio da partícula Z é sensível até mesmo a pequenas mudanças na preparação da amostra. O tamanho médio das partículas Z é um parâmetro hidrodinâmico e, portanto, só é válido para partículas em dispersão ou para moléculas em solução.
Índice de polidispersão
Esse índice é um número calculado a partir de um ajuste simples de dois parâmetros aos dados de correlação (a análise cumulativa). O índice de polidispersidade é adimensional e dimensionado de tal forma que valores menores que 0,05 raramente são vistos, exceto em padrões altamente monodispersos. Valores superiores a 0,7 indicam que a amostra tem uma distribuição granulométrica muito ampla e provavelmente não é adequada para a técnica de DLS. Vários algoritmos de distribuição de tamanho podem funcionar com dados que se enquadram entre esses dois extremos. Os cálculos para esses parâmetros são definidos no documento da norma ISO 22412:201717.
Distribuição de tamanho por intensidade/volume/número
Gráficos típicos de distribuição de tamanho (intensidade, volume, número) são mostrados na Figura 1. Os gráficos de resultados mostram seis amostras preparadas independentemente de 605211 do lote de SI na concentração de 0,4 mg Fe/mL. Para a visualização da Figura 1, os dados brutos retirados do software DLS foram plotados com software estatístico, sem modificaçõesposteriores 9. Uma distribuição de tamanho por intensidade impactada por um segundo pico é fornecida como um exemplo de um resultado ruim na Figura 1A. A Figura 2 exibe dados de baixa qualidade mostrando um sinal adicional a 5.000 nm.
Figura 1: Distribuição de tamanhos: (A) intensidade, (B) volume e (C) número13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Dados representativos de baixa qualidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A solução teste do lote IS 0371022A (0,4 mg Fe/mL), que foi armazenada por 5 dias à temperatura ambiente, mostrou um sinal adicional em ~5.000 nm, que é indicativo de algumas partículas adicionais (por exemplo, poeira ou precipitação). Assim, o PDI originalmente determinado em 0,130 foi deslocado para 0,184, enquanto a média Z ainda estava próxima do valor original (i.e., 11,33) em 11,99 nm (dados não publicados).
A precisão foi testada por dois técnicos de laboratório em dias separados. O valor médio de 12 repetições foi de 11,32 nm com RSD de 0,4% e 0,125 com RSD de 1,5% para a média Z e PDI, respectivamente, para os dois técnicos. Os critérios de aceitação foram atendidos (NMT 5% para a média Z, NMT 20% para o PDI) (dados não publicados).
Comparação de parâmetros analisáveis
Além de calcular os parâmetros básicos - média Z e polidispersidade -, o software do aparelho DLS também permite o cálculo de distribuições de tamanho que podem ser ponderadas de acordo com a intensidade do sinal do detector ou o volume (ou número) de partículas espalhadas. A relevância da comparação desses parâmetros fica evidente nos resultados apresentados na Tabela 2. Enquanto a distribuição de tamanho por número diferiu em até um fator de 2 da média Z baseada em intensidade proposta, apenas valores ligeiramente menores foram calculados pela distribuição de tamanho por volume. Deve-se notar, no entanto, que o relato de resultados baseado em intensidade pode ser impreciso se as soluções do complexo ferro-carboidrato contiverem partículas ou agregados maiores13.
Tabela 1: Parâmetros do sistema para o DLS. Abreviações: IR = índice de refração; DLS = espalhamento dinâmico de luz13. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Exemplos de como a determinação do tamanho das partículas pelo SI é afetada pela abordagem de relatório de dados. Esta tabela é adaptada de Di Francesco e Borchard13. Abreviaturas: DP = desvio padrão; RSD = desvio padrão relativo; PDI = índice de polidispersidade; IS = ferro-sacarose. Clique aqui para baixar esta tabela.
Figura suplementar S1: Etapas operacionais do sistema. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Criando um arquivo de medição. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S3: Teste de adequação do sistema. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S4: Iniciando uma nova medição. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S5: Cálculo das medições. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A DLS tornou-se um ensaio fundamental para a determinação do tamanho e distribuição de tamanho de nanopartículas para aplicações no desenvolvimento de fármacos e avaliação regulatória. Apesar dos avanços nas técnicas de DLS, ainda existem desafios metodológicos em relação à seleção de diluentes e preparação de amostras, que são especialmente relevantes para complexos ferro-carboidrato em soluções coloidais. É importante ressaltar que os métodos DLS para nanomedicamentos ferro-carboidrato ainda não foram estudados extensivamente no meio biológico (por exemplo, o plasma)22. Portanto, ainda há uma necessidade crítica de harmonização dos protocolos de melhores práticas dependendo da seleção do diluente. A seleção do diluente é importante, pois o uso de água purificada versus soluções salinas isotônicas pode afetar a estabilidade da suspensão coloidal16.
Deve-se notar também que os complexos ferro-carboidrato não devem ser diluídos abaixo das recomendações de informações de prescrição em um esforço para mitigar os desafios de ter uma solução escura e opaca. Diluições excessivas não são biorelevantes e podem afetar a estabilidade da suspensão coloidal por meio de mudanças na blindagem iônica, o que pode levar a precipitação potencial e relatórios de resultados imprecisos. Várias diluições e diluentes (dados não publicados) foram testados durante o desenvolvimento deste método, e a preparação da amostra descrita na etapa 1.6.1 do protocolo foi determinada e validada como a diluição ideal para EI. Várias modificações devem ser consideradas para a análise de DLS de complexos ferro-carboidrato. Por exemplo, a preparação de soluções de teste precisa ser realizada na ausência de qualquer tipo de agitação de alta velocidade. O uso de misturadores vortex deve ser evitado, pois induz a criação de agregados ferro-sacarose. Para a preparação das soluções de teste, as soluções IS são suavemente misturadas em água com uma pipeta automática. Além disso, ao executar as amostras para análise DLS, o recurso de calibração automática deve ser desativado.
Existem várias limitações inerentes à análise de DLS para nanopartículas de ferro-carboidrato. Devido à natureza dos ângulos de espalhamento de luz e à saída média Z, os diâmetros hidrodinâmicos relatados são enviesados para partículas maiores na solução de medição. Assim, o tamanho da partícula pode ser superestimado, e a verdadeira distribuição do tamanho da partícula pode estar subestimada13. Técnicas de relato de resultados devem ser consideradas no contexto do tamanho das partículas do complexo ferro-carboidrato e do potencial de agregação nas condições experimentais. Também deve ser levado em conta que os resultados das distribuições de tamanho ponderadas por intensidade, volume e número podem diferir muito entre diferentes unidades DLS do mesmo fabricante ou de fabricantes diferentes, já que diferentes fabricantes usam algoritmos diferentes para o cálculo. Portanto, ISO22412 só recomenda o uso da média-Z e da polidispersidade, pois o algoritmo para seu cálculo é padronizado. As agências reguladoras também recomendaram o relato de tamanho médio Z16. Deve-se notar também que pequenas modificações serão necessárias (por exemplo, o manuseio do software, o procedimento de medição e a preparação dos dados) quando esse protocolo for aplicado a outros instrumentos.
Mesmo à luz dos desafios associados à DLS, esta técnica representa um avanço significativo em relação às metodologias analíticas anteriores e adiciona dados convincentes para a caracterização de complexos ferro-carboidrato. Tem sido endossado por colaborações de cientistas e agências reguladoras16,18,19,21. Esforços futuros na aplicação da análise de DLS a complexos ferro-carboidrato devem se concentrar principalmente na harmonização global de protocolos para sua aplicação no desenvolvimento de medicamentos e avaliação regulatória, incluindo a garantia de bioequivalência. De modo geral, o protocolo analítico aqui descrito visa padronizar a metodologia para a medição do tamanho de partículas e distribuição de SI e pode ser uma ferramenta útil para a avaliação da qualidade do SI.
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Disclosures
M.B., E.P., M.W. e A.B. são funcionários da Vifor Pharma. G.B. é consultor da Vifor Pharma.
Acknowledgments
Nenhum
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | NA | equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry |
| Materials | |||
| Disposable plastic cuvettes | |||
| LLG-Disposable plastic cells | LLG labware | LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011 | |
| low-particle water | (The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended). | ||
| Microlitre pipette | |||
| Venofer 100 mg/5 mL | Vifor Pharma | ||
| Volumetric flask 25 mL | |||
| Nanosphere | Thermo | 3020A | Particle Standard |
| Software | |||
| Origin Pro v.8.5 | Origin Lab Corporation |
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