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Artigo de método

Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína

2K vistas

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DOI:

10.3791/63834

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1 de abril de 2022

 ,  , 
1Department of Craniofacial Biology, School of Dental Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.

Resumo

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. Essas alterações morfológicas são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Aqui, são fornecidos dois exemplos de contextos fisiologicamente relevantes para estudar a fosforilação de proteínas durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilarres E11,5, e células de mesenquime palatina palatina embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5. Para superar a barreira comum da desfosforilação durante o isolamento de proteínas, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento das fosfoproteínas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de fosfoproteínas após a mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinas, podem ser usadas para obter maior percepção sobre a dinâmica e os papéis de várias fosfoproteínas ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

Introdução

O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. No camundongo, esse processo começa no dia embrionário (E) 9.5 com a formação da proeminência frontonasal e pares de processos maxilares e mandibulares, cada um dos quais contém células de crista neural craniana pós-migratória. Os processos nasais laterais e mediais surgem do destaque frontonasal com o aparecimento das covas nasais e eventualmente se fundem para formar as narinas. Além disso, os processos nasais medial e processos maxilarários se fundem para gerar o lábio superior. Simultaneamente, a palatogênese é iniciada com a formação de crescimentos distintos - as prateleiras palatais secundárias - do lado oral dos processos maxilares em E11,5. Com o tempo, as prateleiras palatais crescem para baixo em ambos os lados da língua, elevam para uma posição oposta acima da língua, e eventualmente se fundem na linha média para formar um paladar contínuo que separa as cavidades nasais e orais por E16,51.

Essas alterações morfológicas ao longo do desenvolvimento craniofacial são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Por exemplo, receptores de membrana celular, como subfamílias de fator de crescimento transformador (TGF)-β receptores, incluindo receptores de proteína morfogenética óssea (BMPRs), e várias famílias receptoras de tyrosina quinase (RTK), são autofosforilados sobre ligação de ligante e ativação em células de crista neural craniana 2,3,4 . Além disso, o receptor de transmembrano acoplado à proteína G Smoothened torna-se fosforilado em células de crista neural craniana e ectoderme craniofacial a jusante do ligante de ouriço Sonic (SHH) ligado ao receptor Patched1, resultando em acúmulo de liso na membrana ciliar e ativação da via SHH5. Tais interações ligantes-receptor podem ocorrer através de sinalização autocrina, paracrina e/ou justacrina em contextos craniofaciais. Por exemplo, BMP6 é conhecido por sinalizar de forma autocririna durante a diferenciação de condrocito6, enquanto o fator de crescimento do fibroblasto (FGF) 8 é expresso no arco faringeal e se liga aos membros da família FGF de RTKs expressas no arco faringeal mesenchyme de forma paracrina para o início do padrão e crescimento do arco faringeal7, 8,9,10. Além disso, a sinalização de Entalhe é ativada em condrócitos e osteoblastos durante o desenvolvimento esquelético craniofacial através da sinalização justacririna quando os ligantes delta e/ou irregulares se ligam aos receptores de notch transmembrano em células vizinhas, que são posteriormente cortados e fosfoilados11. No entanto, existem outros pares de ligantes e receptores importantes para o desenvolvimento craniofacial que têm a flexibilidade de funcionar tanto na sinalização autocrina quanto na paracrina. Como exemplo, durante a morgênese dentária murina, o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-AA foi demonstrado para sinalizar de forma autocrina para ativar o RTK PDGFRα no epitélio do órgão de esmalte12. Em contraste, nos processos faciais murinos durante a gestação média, as transcrições que codificam os ligantes PDGF-AA e PDGF-CC são expressas no ectoderme craniofacial, enquanto o receptor PDGFRα é expresso no mesenchyme craniano-derivado, resultando em sinalização paracrina 13,14,15, 16,17 . Independentemente do mecanismo de sinalização, esses eventos de fosforilação receptora frequentemente resultam no recrutamento de proteínas adaptadoras e/ou moléculas de sinalização, que frequentemente se tornam fosforilatos para iniciar cascatas de quinase intracelular, como a via de quinase de proteína ativada por mitogênio (MAPK)18,19.

Os efeitos intracelulares terminais dessas cascatas podem então fosforilarar uma matriz de substratos, como fatores de transcrição, RNA-binding, citoskeletal e proteínas de matriz extracelular. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 e Sox926 estão entre os fatores de transcrição fosfoilados no contexto do desenvolvimento craniofacial. Essa modificação pós-translacional (PTM) pode afetar diretamente a suscetibilidade a PTMs alternativos, dimerização, estabilidade, decote e/ou afinidade de vinculação de DNA, entre outras atividades 20,21,25,26. Além disso, a proteína de ligação de RNA Srsf3 é fosfoilada no contexto do desenvolvimento craniofacial, levando à sua translocação nuclear27. Em geral, a fosforilação de proteínas de ligação de RNA tem sido demonstrada para afetar sua localização subcelular, interações proteína-proteína, ligação RNA e/ou especificidade de sequência28. Além disso, a fosforilação da actomiose pode levar a rearranjos citosqueletal em todo o desenvolvimento craniofacial29,30, e a fosforilação de proteínas da matriz extracelular, como pequenas ligatérias integrinas ligadas à N-proteína, contribui para a biomineralização durante o desenvolvimento esquelético31. Através dos exemplos acima e numerosos, é evidente que há amplas implicações para a fosforilação proteica durante o desenvolvimento craniofacial. Adicionando um nível adicional de regulação, a fosforilação proteica é ainda mais modulada por fosfattases, que neutralizam as quinases removendo grupos de fosfato.

Esses eventos de fosforilação nos níveis de receptor e molécula de efeitos são críticos para a propagação de vias de sinalização e, em última instância, resultam em mudanças na expressão genética no núcleo, conduzindo atividades celulares específicas, como migração, proliferação, sobrevivência e diferenciação, que resultam na formação adequada da face mamífera. Dada a especificidade do contexto das interações proteicas com quinases e fosfates, as mudanças resultantes nos PTMs e seus efeitos sobre a atividade celular, é fundamental que esses parâmetros sejam estudados em um cenário fisiologicamente relevante para obter uma compreensão completa da contribuição dos eventos fosforilação para o desenvolvimento craniofacial. Aqui, são fornecidos exemplos de dois contextos para estudar a fosforilação de proteínas e, assim, a ativação de vias de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilares E11,5, e células mesenquima palatinas embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5 - ambas primárias32 e imortal33 . Na E11.5, os processos maxilarianos estão em processo de fusão com os processos nasais laterais e mediais1, representando assim um ponto de tempo crítico durante o desenvolvimento craniofacial do rato. Além disso, processos maxilares e células derivadas das prateleiras palatais foram escolhidos aqui porque essas últimas estruturas são derivadas da primeira, proporcionando aos pesquisadores a oportunidade de interrogar a fosforilação proteica em ambientes vivos e in vitro em contextos relacionados. No entanto, este protocolo também é aplicável a processos faciais alternativos e pontos de tempo de desenvolvimento.

Um problema crítico no estudo de proteínas fosfoiladas é que elas são facilmente desfosforiladas durante o isolamento de proteínas por fosfattases ambientais abundantes. Para superar essa barreira, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento de proteínas fosforilaladas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de proteínas fosforilalatadas. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinos, podem ser usadas para obter maior visão sobre a dinâmica e os papéis de várias vias de sinalização ativas durante o desenvolvimento craniofacial.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz e realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos institucionais. Camundongos 129S4 femininos com 1,5-6 meses de idade e alojados a uma temperatura sub-termoneutral de 21-23 °C foram usados para colheitas de embriões. Um fluxo de trabalho esquemático do protocolo está representado na Figura 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos, softwares, reagentes e animais utilizados neste protocolo.

1. Colheita de embriões de camundongos E11.5

  1. Eutanize o camundongo gestante 11,5 dias após a detecção de plugue vaginal durante o acasalamento cronometrado em uma câmarade CO 2 usando a taxa de fluxo de CO2 aprovada pela IACUC necessária para aproximadamente 50% de deslocamento (2,95 L/min em um 360 em3 câmara) e duração da exposição (ver Tabela de Materiais). Realizar luxação cervical como método secundário de eutanásia. Prossiga imediatamente para dissecção.
  2. Coloque o corpo do rato em uma placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima. Pulverize o abdômen do rato com 70% de etanol.
  3. Abra a cavidade abdominal beliscando e levantando a pele anterior à abertura vaginal com fórceps semken retos e cortando a pele levantada e camadas subjacentes com tesoura cirúrgica de lâmina reta em um ângulo de 45° em ambos os lados para gerar uma forma "V" que se estende a cada superfície lateral aproximadamente no meio do caminho entre os membros dianteiros e os retas.
  4. Usando as fórceps Semken, segure um dos chifres uterinos e corte abaixo do oviduto e acima do colo do útero com a tesoura cirúrgica. Corte o mesometrium para permitir a remoção completa do chifre uterino.
  5. Transfira o chifre uterino dissecado para 10 mL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) [0,137 M NaCl, 2,68 mM KCl, 1,76 mM KH2PO4 monobásico, 10,14 mM Na2HPO4 dibasic, pH 7.4] em uma placa de Petri de 10 cm.
  6. Remova o segundo chifre uterino no lado oposto da cavidade abdominal usando o mesmo procedimento descrito nas etapas 1.4-1.5.
  7. Coloque a placa de Petri de 10 cm contendo ambos os chifres uterinos no gelo se não proceder imediatamente à dissecção de embriões individuais (ou seja, se um segundo rato fêmea for dissecado).
  8. Sob um microscópio estéreo dissecado, disseca cuidadosamente cada embrião dos chifres uterinos com fórceps finos Dumont #5. Lentamente afastar o miométrio, decidiua e chorão. Rasgue e remova o amnion relativamente transparente ao redor do embrião, e corte o cordão umbilical que liga o embrião à placenta.
  9. Transfira cada embrião dissecado para 2,5 mL de histologia PBS em um poço individual de uma placa de cultura celular de 12 poços no gelo usando uma tubulação de transferência de plástico cortada ou uma colher de embrião.
    NOTA: Se trabalhar com uma ninhada que possa conter embriões de mais de um genótipo, salve o amnion em torno de cada embrião para genotipagem colocando cada um em seu próprio tubo de microcentrifuuge de 0,5 mL pré-rotulado no gelo.

2. Dissecando processos maxilares de embriões de camundongos E11.5

  1. Prepare três pratos petri de 10 cm contendo 10 mL de histologia PBS e mantenha-as no gelo para serem usadas em rotação entre embriões.
  2. Transfira um embrião de um poço individual da placa de cultura celular de 12 poços para uma das placas de Petri de 10 cm com histologia PBS no gelo usando um tubo de transferência de plástico cortado ou uma colher de embrião.
  3. Sob o microscópio de dissecação, separe cada processo maxilar do rosto usando as fórceps finas. Primeiro, corte o lado anterior de um processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo nasal lateral e o processo maxilar (Figura 2A).
  4. Em segundo lugar, corte o lado posterior do processo maxilar ao longo da recuo natural que separa o processo maxilar e o processo mandibular (Figura 2A).
  5. Em terceiro lugar, para separar completamente o processo maxilar, faça um corte vertical dos lados anterior para posterior do processo maxilar no lado dos olhos do processo maxilar onde as entradas naturais referenciadas acima da extremidade (Figura 2A-C).
  6. Repita estes três cortes para o processo maxilar no lado oposto do rosto.
  7. Usando uma tubulação Pasteur de 9" com uma pequena lâmpada de látex de 2 mL, transfira o par dissecado de processos maxilarias e uma pequena gota de aproximadamente 30 μL de histologia PBS para uma placa de Petri de 35 mm rotulada no gelo (Figura 2D).
  8. Siga os passos 2.3-2.7 para cada embrião, girando as três placas de Petri de 10 cm contendo histologia PBS no gelo entre embriões. Coloque pares individuais de processos maxilares dissecados em placas de Petri separadas de 35 mm no gelo.
    NOTA: A separação do ectoderme do processo maxilar e do mesenquime (etapas 2.9-2.17) pode ser realizada após dissecar os processos maxilais de todos os embriões na ninhada. Se forem desejados processos maxilais intactos contendo o ectoderme e o mesenchyme, proceda à etapa 2.18 abaixo.
  9. Prepare 250 μL de 2% de trippsina fresca na cultura tecidual PBS e 250 μL de 10% de soro bovino fetal (FBS) na cultura tecidual PBS e armazenar no gelo.
  10. Coloque uma segunda gota pequena de aproximadamente 30 μL de 2% de trippsina na placa de Petri de 35 mm separada da primeira gota pequena da histologia PBS contendo os processos maxilais. Transfira o par de processos maxilarários para a pequena gota de 2% de trippsina usando a pipet Pasteur (Figura 2D).
  11. Incubar o prato no gelo por 15 minutos.
  12. Retire a placa de Petri de 35 mm do gelo e coloque sob o microscópio de dissecação.
  13. Utilizando as fórceps finas, retire lentamente e cuidadosamente a camada de ectoderm de cada processo maxilar (Figura 2E).
    NOTA: Se o ectoderme não estiver se separando do mesenquime em uma folha intacta, incubar em 2% a trippsina à temperatura ambiente (RT) por até 5 minutos adicionais antes de continuar com a separação. Se o tecido começar a se desintegrar na trippsina de 2%, mova os processos maxilais para o FBS de 10%, como descrito abaixo para neutralizar a trippsina e terminar a separação do ectoderme e do mesenquime.
  14. Uma vez separados o ectoderme do processo maxilar e o mesenquime (Figura 2F), transfira os tecidos desejados do par de processos maxilarianos para uma terceira gotícula pequena de aproximadamente 30 μL de 10% FBS - separada das duas gotículas pequenas anteriores - usando o tubo Pasteur (Figura 2D).
  15. Coloque a placa de Petri de 35 mm no gelo para parar a trippsinização.
  16. Incubar os tecidos do processo maxilar no gelo em 10% FBS por 1-2 min, e depois transferir os tecidos de ambos os processos maxilarianos para uma quarta gota pequena de aproximadamente 30 μL de histologia pré-aplacida PBS no gelo - separada das três gotículas pequenas anteriores - usando o tubo Pasteur (Figura 2D).
  17. Incubar os tecidos de processo maxilar na histologia PBS por 1 min enquanto gira suavemente a histologia PBS em torno dos tecidos de processo maxilar com a ponta da tubulação Pasteur para garantir que todo fbs seja enxaguado do tecido.
  18. Transfira o par de tecidos de processo maxilar para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL rotulado no gelo usando o tubo Pasteur, minimizando a transferência da histologia PBS. Remova qualquer excesso de histologia PBS no tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL com a tubulação Pasteur.
  19. Siga os passos acima para dissecar os processos maxilarários de cada embrião na ninhada.
  20. Processe as amostras imediatamente para isolar as proteínas celulares inteiras (abaixo) ou armazenar a -80 °C a longo prazo. Antes do armazenamento a longo prazo, congele o tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL em um banho de EtOH 100% em gelo seco por 5 minutos.

3. Isolar proteínas celulares inteiras de processos maxilares de camundongos

  1. Se os processos maxilarários foram previamente congelados a -80 °C, descongele-os no gelo.
  2. Adicione 0,1 mL de tampão de lise NP-40 gelado (20 mM Tris HCl pH 8, 150 mM NaCl, 10% glicerol, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA; armazenado a 4 °C) com inibidores de protease e fosfatase (1x coquetel inibidor de mini-protease completo [dissolvido em água; armazenado a -20 °C], 1 mM PMSF [dissolvido em isopropanol; armazenado a 4 °C], 10 mM NaF [armazenado a -20 °C; evite congelar/descongelar], 1 mM Na3VO4 [armazenado a -20 °C], 25 mM β-glicerofofofesfato [armazenado a 4 °C]) adicionado imediatamente antes do uso no gelo.
    NOTA: O fracionamento celular pode ser realizado alternativamente para isolar frações citoplasmáticas, nucleares, membranas ou proteínas mitocondriais.
  3. Pipet para cima e para baixo 10 vezes com um pipetman de 200 μL.
  4. Vórtice para 10 s, e depois pipet para cima e para baixo 10 vezes com um pipetman de 200 μL. Evite gerar bolhas.
  5. Incubar a 4 °C por 2h enquanto gira a extremidade sobre a extremidade usando uma raquete de 1,5 mL/2 mL com um revólver de tubo.
  6. Centrifugar as amostras a 13.500 × g por 20 min a 4 °C.
  7. Colete o supernatante a um novo tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL no gelo com um pipetman de 200 mL.
  8. Quantifique a concentração de proteína com o kit de ensaio proteico, utilizando 10 μL de proteína lysate + 10 μL de tampão de lise NP-40 para amostras experimentais e 3-5 diluições de albumina de soro bovino (fração V) (BSA) em NP-40 lysis buffer em uma faixa de 0,25-2,0 mg/mL como padrão de proteína.
  9. Proceda com a eletroforese de gel de sulfato-poliacrilamida de sódio de sódio (SDS-PAGE) (passo 5) ou congele rapidamente os demais lises em gelo seco e armazene a -80 °C a longo prazo.

4. Isolar as células inteiras de proteínas celulares das células primárias e/ou imortalizadas do mesenquime palatal do camundongo (MEPM)

NOTA: O isolamento e a cultura das células mepm primárias dos embriões de camundongos E13.5 e das células MEPM imortalizadas foram descritos anteriormente 32,33,34. A estimulação de células com fator de crescimento (etapas 4.1-4.7) pode ser realizada antes da lise celular. Se forem desejadas células não estimuladas, siga para a etapa 4.8 abaixo.

  1. Aspire o meio de crescimento [O meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 10% FBS] das células MEPM a ~70% de confluência em um prato de cultura celular de 6 cm usando um tubo pasteur de 5,75" anexado a um sistema de vácuo.
  2. Lave as células com 1 mL de cultura tecidual PBS.
  3. Adicione 3 mL de meio de fome sárica [DMEM com 50 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 0,1% FBS] pré-enlagada em um banho de água de 37 °C.
  4. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 23 h.
  5. Substitua o meio de fome de soro por 3 mL de meio de fome de soro fresco e pré-armado.
  6. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 1h.
  7. Estimule as células com o fator de crescimento escolhido em uma concentração empiricamente determinada pelo tempo desejado.
  8. Aspire o meio das células MEPM a 80%-100% de confluência usando uma tubulação Pasteur de 5,75" ligada a um sistema de vácuo.
  9. Lave as células duas vezes com cultura de tecido gelado PBS (1 mL para um prato de cultura celular de 6 cm); incline a placa para o lado durante a última lavagem para garantir que toda a cultura do tecido PBS seja aspirada.
  10. Lise as células adicionando tampão de lise NP-40 gelado com inibidores de protease e fosfatase adicionados imediatamente antes do uso (0,1 mL para um prato de cultura celular de 6 cm) no gelo.
  11. Incubar a placa no gelo por 5 minutos com rotação aproximadamente cada minuto para garantir a cobertura completa da placa.
  12. Raspe as células da placa usando um levantador de células pré-cozido e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge pré-cozido de 1,5 mL no gelo.
  13. Incubar a suspensão da célula a 4 °C por 30 min enquanto gira a extremidade sobre a extremidade usando uma pás de 1,5 mL/2 mL com um revólver de tubo.
  14. Prossiga com as etapas 3.6-3.9 descritas acima.

5. Mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de camundongos e/ou células MEPM para fosfoproteínas

  1. Prepare amostras inteiras de proteína celular para SDS-PAGE.
    1. Determinar a quantidade de proteína a ser carregada, dependendo da abundância de proteínas no tecido/célula; 12,5 μg é geralmente suficiente para proteínas robustamente expressas em proteínas celulares inteiras.
    2. Adicione um volume igual de tampão laemmli 2x [20% glicerol, 4% SDS, 0,004% azul bromofenol, 0,125 M Tris HCl pH 6.8] com 10% β-mercaptoetanol adicionado imediatamente antes do uso.
      ATENÇÃO: β-mercaptoetanol é corrosivo de pele ou olho corrosivo, tóxico, perigoso se engolido, e tem toxicidade aquática. Manuseie luvas, um casaco de laboratório, escudo facial e óculos de segurança em um capuz de fumaça química. Descarte de acordo com as diretrizes de Saúde e Segurança Ambiental.
    3. Misture por vórtice.
    4. Aqueça as amostras a 100 °C por 5 min em um mini banho seco.
    5. Misture por vórtice e coloque as amostras no gelo.
    6. Centrifugar a 9.400 × g por 5 min a 4 °C.
    7. Coloque as amostras brevemente no gelo antes de carregar em gel SDS-PAGE ou armazene a -20 °C a longo prazo.
  2. Execute o SDS-PAGE usando uma célula de eletroforese com um gel de proteína pré-moldado de 4%-15% e tampão de eletroforese35.
  3. Eletrotransfera as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinida (PVDF) utilizando tampão de transferência com 0%-20% de metanol (0%-10% para proteínas superiores a 100 kDa; 20% para proteínas inferiores a 100 kDa) adicionadas imediatamente antes do uso35.
  4. Bloqueie a membrana e a sonda para fosfoproteína de interesse.
    1. Após a transferência, lave a membrana em 1x trifás-tampão (TBS) [20 mM Tris, 0,137 M NaCl, pH 7.6] por 5 min em uma caixa de mancha ocidental.
    2. Incubar a membrana em 5 mL de tampão de bloqueio [1x TBS, 0,1% Interpol 20, 5% c/v BSA; misturado bem e filtrado através de um filtro de seringa de 25 mm com poros de 0,2 μm usando uma seringa de 10 mL com ponta de lunte] por 1 h em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um shaker orbital.
      NOTA: Não use o leite como agente de bloqueio ao caracterizar fosfoproteínas, pois contém a fosfoproteína caseína, que pode causar um sinal de fundo alto e não específico.
    3. Lave a membrana três vezes por 5 min cada em TBS-T [1x TBS, 0,1% Interpol 20] em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    4. Incubar a membrana em 5 mL de anticorpo primário diluído no tampão de bloqueio a 4 °C durante a noite em um tubo cônico de 50 mL usando uma pá de 50 mL com um revólver de tubo.
      NOTA: Consulte a ficha técnica de anticorpos para obter a concentração adequada para a mancha ocidental.
    5. Lave a membrana três vezes em RT por 5 min cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    6. Incubar a membrana em 5 mL de peroxidase de rabanete apropriada (HRP) anticorpo secundário conjugado diluído em tampão de bloqueio por 1 h em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    7. Lave a membrana três vezes por 5 minutos cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    8. Incubar a membrana em substrato de manchas ocidentais de chemiluminescência aprimorada (ECL) ocidental [misturando volumes iguais das garrafas 1 e 2; 0,5 mL de cada para membranas grandes (8,6 cm x 6,7 cm) por 1 min, garantindo que toda a membrana esteja continuamente exposta ao substrato de manchas ocidentais da ECL.
    9. Escorra a membrana do substrato de manchas ocidentais ECL em excesso e desenvolva-se imediatamente usando um imager de quimiomina.
  5. Retire a membrana e a reprovação para a proteína total de interesse.
    1. Coloque a membrana PVDF em uma bolsa transparente com revestimento de polietileno contendo 5 mL de tampão de descascamento [2% SDS, 62,5 mM Tris HCl pH 6.8] com 8 μL/mL de β-mercaptoetanol adicionado imediatamente antes do uso.
    2. Incubar a 50 °C por 30 min com balanço em forno de hibridização a 11 revoluções por minuto.
    3. Lave a membrana três vezes em RT por 5 min cada em TBS-T em uma caixa de mancha ocidental com agitação em um agitador orbital.
    4. Prossiga com as etapas 5.4.2-5.4.9 descritas acima.
  6. Quantitam as densidades de banda de blot ocidental usando o software ImageJ, normalizando os níveis da proteína fosfoilada de interesse para os níveis da proteína total de interesse36.

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Resultados

Ao tentar caracterizar a fosforilação de proteínas isoladas dos processos faciais do camundongo e/ou células de mesenquima palatal cultivadas, os resultados representativos revelarão idealmente uma faixa distinta e reprodutível após a mancha ocidental com um anticorpo antifosfoproteína que corre na altura ou perto da altura da faixa de proteína total correspondente (Figura 3 ). No entanto, se ocorrer uma fosforilação extensiva da proteína, pode haver uma ligeira mudança ascendente da banda d...

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Discussão

O protocolo descrito aqui permite que os pesquisadores testem eventos críticos de sinalização dependentes de fosforilação durante o desenvolvimento craniofacial de forma robusta e reprodutível. Existem várias etapas críticas neste protocolo que garantem a coleta adequada de dados e análise dos resultados. Seja isolando fosfoproteínas de processos faciais de camundongos e/ou células de mesenquime palatal cultivadas, é imperativo mover-se de forma rápida e eficiente, mantendo todos os reagentes e materiais no gelo quando i...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os ratos 129S4 foram um presente do Dr. Philippe Soriano, da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado com recursos dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH)/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 para K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 para B.J.C.D.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipment
imagem ChemiDoc XRS+ com software Image LabGerador de imagens de quimioluminescênciaBio-Rad1708265
incubadora de CO2, camisa de arVWR10810-902
placa, 11 x 13 pol.Fisher Scientific09 002 12
Célula de eletroforese, 4 gels, para mini géis pré-moldados com módulo mini trans-blotBio-Rad1658030
Microcentrífuga UVP95003001 Fisher Scientific 5415 D com rotor F45-24-11 (Eppendorf)Sigma AldrichZ604062
International Corp400780
Agitador orbitalVWR89032-092
Medidor de pHVWR89231-662
Fonte de alimentação para SDS-PAGEBio-Rad1645050
Panela de gelo retangular, maxi 9 LFisher Scientific07-210-093
Stemi 508 microscópio estéreo com suporte K Lab, anel de luz LEDZeissmicroscópiode dissecação
TimerVWR62344-641
Revólver de tuboFisher Scientific11 676 341
Misturador de vórticeFisher Scientific02 215 414
Banho-mariaVWR89501-472
Caixa de mata-borrão ocidentalFisher ScientificNC9358182
MateriaisPlacas de
células, 6 cmFisher Scientific12-565-95
Placas de cultura de células, 12 poçosFisher Scientific07-200-82
Elevadores de célulasFisher Scientific08-100-240
CO2AirgasCD USP50
Tubos cônicos, polipropileno, 50 mLFisher Scientific05-539-13
Dumont #5 pinça finaFine Science Tools11254-20
Colher de embriõesFine Science Tools10370-17
Tubos de microcentrífuga, 0,5 mLVWR89000-010
Tubos de microcentrífuga, 1,5 mLVWR20170-038
Pipeta de Pasteur, 5,75"Fisher Pipeta Pasteur Scientific13-678-6A
, 9"VWR14672-380
Placas de Petri, 10 cmFisher Scientific08-757-100D
Placas de Petri, 35 mmFisher ScientificFB0875711YZ
Bolsas, transparente, forro de polietilenoFisher Scientific01-812-25B
Membrana PVDFFisher Pinça CientíficaIPVH00010
SemkenFine Science Tools11008-13
Pequena lâmpada de látex, 2 mLVWR82024-554
Tesoura cirúrgicaFine Science Tools14002-12
Filtro de seringa, 25 mm, 0.2 μ m tamanho do poroFisher Scientific09-740-108
Seringa com ponta luer, 10 mLVWRBD309604
Pipeta de transferênciaFisher Scientific13-711-22
Alavanca de abertura de Western blotBio-Rad4560000
Papel de cromatografia Whatmann 3MM chrFisher Scientific05-714-5
Reagentes
4-15% Géis de proteína pré-moldados, 10 poços, 30 µ LBio-Rad4561083
β-glicerofosfato sal dissódico hidratoSigma AldrichG5422-25Gconcentração de estoque 1 M
β-mercaptoetanolSigma AldrichM3148-100ML
Albumina de soro bovino, fração V, testada contra choque térmico FisherScientificBP1600-100
Azul de bromofenolFisher Scientific
Coquetel completo de inibidor de mini proteaseSigma Aldrich11836153001concentração estoque 25x
kit de ensaio de proteína DC IIBio-Rad500-0112
DMEM, alta glicoseGibco11965092
E7, anticorpo primário monoclonal de beta tubulina de camundongo, concentrado 0,1 mLEstudos de desenvolvimento Hybridoma BankE71:1.000
Substrato de western blotting ECLFisher ScientificPI32106baixa faixa de picograma
Substrato de western blotting ECLGenesee Scientific20-302Bbaixa faixa de femtograma
Tampão de eletroforese, 5 LBio-Rad1610772concentração de estoque 10x
Etanol, 200 provas, 1 galãoDecon Laboratories, Inc.2705HCEtOH
Ácido etilenodiaminotetracético, Di Na sal di-hidratado. (powd. cristalino/eletrophor.)Fisher ScientificBP120-500EDTA
Soro fetal bovino, caracterizado, origem americana, 500 mLHyCloneSH30071.03
Glicerol (certificado ACS)Fisher ScientificG33-4
Anticorpo secundário conjugado com HRP, cabra anti-camundongo IgGJackson ImmunoResearch Laboratories115-035-1461:20.000
Anticorpo secundário conjugado com HRP, cabra anti-coelho IgGJackson ImmunoResearch Laboratories111-035-0031:20.000
Solução de ácido clorídrico, 6N (certificado)Fisher ScientificSA56-500HCl
Igepal Ca - 630 detergente não iônicoFisher ScientificICN19859650Nonidet P-40
Isopropanol (HPLC)Fisher ScientificA451-1
L-glutaminaGibco25030081concentração de estoque 200 mM
MetanolFisher ScientificA454-4
p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primárioTecnologia de Sinalização Celular9102S1:1.000; anti-Erk1/2
PDGF-BB ligante recombinante, ratoFisher Scientific520BB050
Receptor PDGF β anticorpo primárioTecnologia de Sinalização Celular3169S1:1.000
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140122concentração estoque 100 U/mL, 100 µ g/mL
de fluoreto de fenilmetanossulfonil, 99%Fisher ScientificAC215740100PMSF; concentração de estoque 100
mM Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primárioTecnologia de Sinalização Celular9101S1:1.000, anti-fosfo-Erk1/2
Receptor de Fosfo-PDGF &alfa; /Receptor de PDGF β anticorpo primárioTecnologia de Sinalização Celular3170S1:1.000
Cloreto de potássio (cristais brancos)Fisher ScientificBP366-500KCl
Fosfato de potássio monobásico (cristais brancos)Fisher ScientificBP362-500KH2PO4
SDS solução, 10%Bio-Rad161-0416
Cloreto de sódio (cristalino/biológico, certificado)Fisher ScientificS671-3NaCl
Fluoreto de sódio (pó/ACS certificado)Fisher ScientificS299-100NaF; alíquota para uso único; concentração de estoque 1 M
Ortovanadato de sódio, 99%Fisher ScientificAC205330500Na3VO4; concentração de estoque 100 mM
Fosfato de sódio dibásico anidro (granular ou em pó/ACS certificado)Fisher ScientificS374-500Na2HPO4
Cultura de tecidos PBSFisher Scientific21-031-CV
Tampão de transferência, 5 LBio-Rad1610771concentração de estoque 10x
base Tris (cristais brancos ou pó cristalino/biologia molecular)Fisher ScientificBP152-1
TripsinaBioWorld21560033
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Western blot marcador de peso molecularBio-Rad1610374
Software
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Animais
Fêmeas camundongos129S4presente do Dr. Philippe Soriano, Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai
Block para mini banho seco Research Products International Corp 400783 sistema de Forno de hibridização Mini banho seco Produtos de pesquisa 4350649020000000 cultura de AC403140050

Referências

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