O protocolo apresenta um método para isolar os lises de proteínas celulares inteiras de processos faciais de embriões de camundongos dissecados ou células de mesenquime palatina embrionárias cultivadas e realizar posteriormente manchas ocidentais para avaliar os níveis de proteína fosfoilada.
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Artigo de método
Isolamento de Lysatos de Proteína Celular Inteira de Processos Faciais de Camundongos e Células de Mesenchyme Palatal cultivadas para análise de fosfoproteína
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. Essas alterações morfológicas são iniciadas e sustentadas através de diversas interações de sinalização, que muitas vezes incluem fosforilação proteica por quinases. Aqui, são fornecidos dois exemplos de contextos fisiologicamente relevantes para estudar a fosforilação de proteínas durante o desenvolvimento craniofacial dos mamíferos: processos faciais de camundongos, em particular processos maxilarres E11,5, e células de mesenquime palatina palatina embrionárias cultivadas derivadas de prateleiras palatais secundárias E13,5. Para superar a barreira comum da desfosforilação durante o isolamento de proteínas, são discutidas adaptações e modificações nos métodos laboratoriais padrão que permitem o isolamento das fosfoproteínas. Além disso, as melhores práticas são fornecidas para análise adequada e quantificação de fosfoproteínas após a mancha ocidental de lises de proteínas celulares inteiras. Essas técnicas, particularmente em combinação com inibidores farmacológicos e/ou modelos genéticos murinas, podem ser usadas para obter maior percepção sobre a dinâmica e os papéis de várias fosfoproteínas ativas durante o desenvolvimento craniofacial.
Introdução
O desenvolvimento craniofacial dos mamíferos é um processo morfológico complexo durante o qual várias populações celulares se coordenam para gerar o esqueleto frontonasal. No camundongo, esse processo começa no dia embrionário (E) 9.5 com a formação da proeminência frontonasal e pares de processos maxilares e mandibulares, cada um dos quais contém células de crista neural craniana pós-migratória. Os processos nasais laterais e mediais surgem do destaque frontonasal com o aparecimento das covas nasais e eventualmente se fundem para formar as narinas. Além disso, os processos nasais medial e processos maxilarários se fundem para gerar o lábio superior. Simultaneamente, ....
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz e realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos institucionais. Camundongos 129S4 femininos com 1,5-6 meses de idade e alojados a uma temperatura sub-termoneutral de 21-23 °C foram usados para colheitas de embriões. Um fluxo de trabalho esquemático do protocolo está representado na Figura 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos, softwares, reagentes e animais utilizados neste protocol....
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Resultados
Ao tentar caracterizar a fosforilação de proteínas isoladas dos processos faciais do camundongo e/ou células de mesenquima palatal cultivadas, os resultados representativos revelarão idealmente uma faixa distinta e reprodutível após a mancha ocidental com um anticorpo antifosfoproteína que corre na altura ou perto da altura da faixa de proteína total correspondente (Figura 3 ). No entanto, se ocorrer uma fosforilação extensiva da proteína, pode haver uma ligeira mudança ascendente da banda d.......
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Discussão
O protocolo descrito aqui permite que os pesquisadores testem eventos críticos de sinalização dependentes de fosforilação durante o desenvolvimento craniofacial de forma robusta e reprodutível. Existem várias etapas críticas neste protocolo que garantem a coleta adequada de dados e análise dos resultados. Seja isolando fosfoproteínas de processos faciais de camundongos e/ou células de mesenquime palatal cultivadas, é imperativo mover-se de forma rápida e eficiente, mantendo todos os reagentes e materiais no gelo quando i.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os ratos 129S4 foram um presente do Dr. Philippe Soriano, da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai. Este trabalho foi apoiado com recursos dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH)/Instituto Nacional de Pesquisa Odontológica e Craniofacial (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 para K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 para B.J.C.D.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| imagem ChemiDoc XRS+ com software Image Lab | Gerador de imagens de quimioluminescência | Bio-Rad | 1708265 |
| incubadora de CO2, camisa de ar | VWR | 10810-902 | |
| placa, 11 x 13 pol. | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Célula de eletroforese, 4 gels, para mini géis pré-moldados com módulo mini trans-blot | Bio-Rad | 1658030 | |
| Microcentrífuga UVP95003001 Fisher Scientific 5415 D com rotor F45-24-11 (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| International Corp | 400780 | ||
| Agitador orbital | VWR | 89032-092 | |
| Medidor de pH | VWR | 89231-662 | |
| Fonte de alimentação para SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Panela de gelo retangular, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stemi 508 microscópio estéreo com suporte K Lab, anel de luz LED | Zeiss | microscópio | de dissecação |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Revólver de tubo | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Misturador de vórtice | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Banho-maria | VWR | 89501-472 | |
| Caixa de mata-borrão ocidental | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| MateriaisPlacas de | |||
| células, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Placas de cultura de células, 12 poços | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Elevadores de células | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Tubos cônicos, polipropileno, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 pinça fina | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Colher de embriões | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Tubos de microcentrífuga, 0,5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Tubos de microcentrífuga, 1,5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pipeta de Pasteur, 5,75" | Fisher Pipeta Pasteur Scientific | 13-678-6A | |
| , 9" | VWR | 14672-380 | |
| Placas de Petri, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Placas de Petri, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Bolsas, transparente, forro de polietileno | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| Membrana PVDF | Fisher Pinça Científica | IPVH00010 | |
| Semken | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Pequena lâmpada de látex, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Tesoura cirúrgica | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Filtro de seringa, 25 mm, 0.2 μ m tamanho do poro | Fisher Scientific | 09-740-108 | |
| Seringa com ponta luer, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Pipeta de transferência | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Alavanca de abertura de Western blot | Bio-Rad | 4560000 | |
| Papel de cromatografia Whatmann 3MM chr | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagentes | |||
| 4-15% Géis de proteína pré-moldados, 10 poços, 30 µ L | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glicerofosfato sal dissódico hidrato | Sigma Aldrich | G5422-25G | concentração de estoque 1 M |
| β-mercaptoetanol | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Albumina de soro bovino, fração V, testada contra choque térmico Fisher | Scientific | BP1600-100 | |
| Azul de bromofenol | Fisher Scientific | ||
| Coquetel completo de inibidor de mini protease | Sigma Aldrich | 11836153001 | concentração estoque 25x |
| kit de ensaio de proteína DC II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, alta glicose | Gibco | 11965092 | |
| E7, anticorpo primário monoclonal de beta tubulina de camundongo, concentrado 0,1 mL | Estudos de desenvolvimento Hybridoma Bank | E7 | 1:1.000 |
| Substrato de western blotting ECL | Fisher Scientific | PI32106 | baixa faixa de picograma |
| Substrato de western blotting ECL | Genesee Scientific | 20-302B | baixa faixa de femtograma |
| Tampão de eletroforese, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | concentração de estoque 10x |
| Etanol, 200 provas, 1 galão | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Ácido etilenodiaminotetracético, Di Na sal di-hidratado. (powd. cristalino/eletrophor.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Soro fetal bovino, caracterizado, origem americana, 500 mL | HyClone | SH30071.03 | |
| Glicerol (certificado ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Anticorpo secundário conjugado com HRP, cabra anti-camundongo IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20.000 |
| Anticorpo secundário conjugado com HRP, cabra anti-coelho IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20.000 |
| Solução de ácido clorídrico, 6N (certificado) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 detergente não iônico | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanol (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutamina | Gibco | 25030081 | concentração de estoque 200 mM |
| Metanol | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primário | Tecnologia de Sinalização Celular | 9102S | 1:1.000; anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB ligante recombinante, rato | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| Receptor PDGF β anticorpo primário | Tecnologia de Sinalização Celular | 3169S | 1:1.000 |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | concentração estoque 100 U/mL, 100 µ g/mL |
| de fluoreto de fenilmetanossulfonil, 99% | Fisher Scientific | AC215740100 | PMSF; concentração de estoque 100 |
| mM Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primário | Tecnologia de Sinalização Celular | 9101S | 1:1.000, anti-fosfo-Erk1/2 |
| Receptor de Fosfo-PDGF &alfa; /Receptor de PDGF β anticorpo primário | Tecnologia de Sinalização Celular | 3170S | 1:1.000 |
| Cloreto de potássio (cristais brancos) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Fosfato de potássio monobásico (cristais brancos) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS solução, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Cloreto de sódio (cristalino/biológico, certificado) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Fluoreto de sódio (pó/ACS certificado) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; alíquota para uso único; concentração de estoque 1 M |
| Ortovanadato de sódio, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; concentração de estoque 100 mM |
| Fosfato de sódio dibásico anidro (granular ou em pó/ACS certificado) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Cultura de tecidos PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Tampão de transferência, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | concentração de estoque 10x |
| base Tris (cristais brancos ou pó cristalino/biologia molecular) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tripsina | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Western blot marcador de peso molecular | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animais | |||
| Fêmeas camundongos | 129S4 | presente do Dr. Philippe Soriano, Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai |
Referências
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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Reimpressões e permissões
