Indução de resgate de pólipos em colônias de corais para obtenção de micropropagates individualizados para uso experimental em laboratório

Corais escleractinianos ou de construção de recifes são cnidários capazes de formar esqueletos de carbonato, criar recifes e ecossistemas estruturalmente complexos que podem ser encontrados de ambientes de águas profundas a rasas¹. Os recifes de corais tropicais abrigam alta biodiversidade e fornecem serviços ecossistêmicos essenciais, como proteção costeira e manutenção da pesca². A maioria dos corais de construção de recifes em águas rasas depende de uma relação mutualista com algas da família Symbiodiniaceae, que fornecem a energia que os corais precisam para construir seus esqueletos. A simbiose entre o coral e as algas pode ser quebrada pelo estresse ambiental, causando branqueamento de corais 3,4,5,6. Anomalias recentes de temperatura causaram grandes eventos de branqueamento de corais em todo o mundo, levando à mortalidade de corais em massa e à degradação permanente dos recifes 7,8,9,10,11. Como esse fenômeno se baseia na expulsão de symbionts por mecanismos celulares associados ao estresse térmico, como apoptose, autofagia e exocitose, o branqueamento de corais pode ser descrito como um processo celular que tem consequências em escala ecossistêmica ^5,6,12, o que significa que ter culturas in vitro de células de coral ou tecidos seria aplicável para estudar esse fenômeno de perto.

Devido à importância dos recifes de corais e às principais ameaças que vêm enfrentando, particularmente nas últimas duas décadas^, os corais tornaram-se o foco da pesquisa para fins de proteção e restauração em todo o mundo¹³. No entanto, o desenvolvimento de abordagens e sistemas experimentais confiáveis, reprodutíveis e que ofereçam impacto ambiental mínimo para estudar corais é uma grande luta nesse campo.

A micropropagação é definida como a proliferação in vitro do genótipo de um organismo, culminando seu material biológico em vasos controlados^14,15. A cultura de células, tecidos e órgãos tem sido crucial para a biologia vegetal e animal nas últimas décadas. Permite a reprodução em massa de organismos em laboratórios, a rápida avaliação de diferentes tratamentos (como medicamentos e fármacos) e o estudo direto da função celular 14,15,16,17. Em geral, modelos in vitro têm sido úteis para complementar e aprofundar os estudos de diferentes organismos em condições físicas e químicas mais bem controladas. Devido às vantagens das técnicas de cultivo in vitro, diferentes tecnologias de cultura de células animais e tecidos foram desenvolvidas, otimizadas e utilizadas como ferramentas importantes em diversos campos de pesquisa, onde múltiplas linhas celulares foram estudadas e comercializadas para inúmeras aplicações 16,17,18.

Muitos avanços no conhecimento da cultura celular e tecidual têm sido feitos desde a primeira cultura do tecido animal em^{1882 17}, como o uso de mídias naturais e sintéticas, a invenção de linhas celulares estabelecidas e o desenvolvimento de mídias 3D para cultivar uma infinidade de tipos celulares de uma forma melhor^{16,17, 18,19}. No entanto, o campo da biologia celular tem se concentrado principalmente em um grupo seleto de organismos modelo, enquanto muitos ainda não têm culturas in vitro bem estabelecidas de células, tecidos ou órgãos²⁰. Por exemplo, na pesquisa de corais, nenhuma linha celular imortalizada tem sido amplamente usada para pesquisas, restringindo a pesquisa de células de coral ao uso de culturas celulares primárias. Essas culturas têm viabilidade limitada a algumas semanas²¹, sem estudos registrando a sobrevivência de células individuais de todos os tecidos de coral por mais de 13 dias até o início de 2021²². O primeiro relatório de linhas celulares de corais sustentáveis a serem publicadas foi com células acropora tenuis que viveram até 6 meses, e a utilidade dessas células para futuras pesquisas continua a ser explorada²³.

Para superar as limitações na cultura das células de corais e manter uma cultura laboratorial que preserve a organização geral dos corais, o uso de pólipos isolados foi recentemente proposto como modelo de pesquisa de biologia coral^24,25. Pólipos são as unidades anatômicas de corais, e cada um deles tem uma boca localizada no centro de seu disco oral e está conectada a outros pólipos pela coenosác em sua região aboral²⁶. A separação dos pólipos vivos ocorre naturalmente pelo processo de resgate de pólipos, no qual o estresse agudo causa a digestão do coenosarco entre os pólipos, que pode então se desprender do esqueleto da colônia 25,27,28. Esse fenômeno tem sido relatado para ocorrer em uma variedade de taxas, incluindo octocorals 29,30,31, corais negros ³², e corais escleractinianos 25,27,28,32,33, e tem sido ligado a múltiplos estressores ambientais, como a falta de cálcio na água ^24,34, aumento da ácido³⁵, condições hiperosmóticas 25,27,32,36, altas temperaturas ^36,37, fome 33, exposição ao ar^25,30 e contaminação por inseticidas^28,38. O resgate de pólipos tem sido, por exemplo, relatado nos corais pociloporídeos¹⁹, que são amplamente distribuídos em todo o mundo e são comumente usados como modelos em pesquisas de corais. Espécies pertencentes a esse grupo, como Pocillopora damicornis e Styllophora pistillata, geraram aproximadamente 30-40 micropropagates de um fragmento de 5 mm²⁵. Esse número enfatiza a vantagem do uso do resgate de pólipos como método de micropropagação de corais, pois cria a possibilidade de gerar muitos indivíduos geneticamente idênticos a partir de um pequeno pedaço de coral. O uso de pólipos isolados para pesquisa também tem as mesmas vantagens que as culturas celulares em relação à possibilidade de serem cultivadas em ambientes de laboratório controlados, como frascos e placas de Petri. Além disso, plataformas microfluidas para manter pólipos vivos demonstraram que esses micropropagates podem ser mantidos em ambientes relativamente baratos e fáceis de reproduzir, com fluxo de água controlado, superfície e temperatura^24,25. Essas plataformas de microfluidos também podem ser usadas para visualizar estruturas de corais vivos sob um microscópio diretamente ^24,25.

No presente artigo, resumimos e demonstramos as técnicas desenvolvidas para isolar os pólipos individuais de corais de suas colônias, mostrando como mantê-los em condições laboratoriais para a cultura de longo prazo. Os métodos discutidos incluem resgate de pólipos através de condições hiperosmóticas por evaporação e bombeamento de água do mar de alta salinidade e incubação em água do mar livre de cálcio.

Para o presente estudo, foi coletada uma colônia pertencente às espécies de corais Pocillopora verrucosa do recife de Al Fahal (22,305118 N; 38,964568 E) por mergulho usando martelo e cinzel. O gênero da colônia foi identificado morfologicamente, e sua espécie foi classificada como P. verrucosa com base em trabalhos publicados anteriormente, incluindo Pocillopora do Mar Vermelho, indicando que, do ponto de vista genético, a espécie presente nesta área é P. verrucosa^39,40. O recife de Al Fahal não faz parte de uma área ambiental protegida, e não foram necessárias licenças especiais para coleta de corais. A colônia foi mantida em um aquário de 300 L por um mês antes de ser fragmentada e ter seus pólipos "resgatados". O aquário foi mantido a 26 °C com dois aquecedores de aquário, três bombas e duas fontes de luz (ver Tabela de Materiais), mantendo um ciclo de luz de 12h. A temperatura do aquário foi mantida conectando cada um dos dois aquecedores a um controlador de temperatura. A emissão de luz foi programada para começar às 6:00 e terminar às 18:00, produzindo uma curva de irradiação que atingiu o pico às 12:00 com 230 fótons μmol m⁻²s⁻¹.

1. Resgate de pólipo por alta salinidade após evaporação da água

NOTA: Este método foi adaptado de Shapiro et ^al.25. Se usar espécies diferentes da Pocillopora verrucosa, o tamanho dos pólipos deve ser levado em conta antes de determinar o tamanho do fragmento a ser cortado.

1. Corte pequenos fragmentos (menos de 1 cm de comprimento) de uma colônia de corais usando alicates de corte diagonal (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Adapte as ferramentas de corte de acordo com as espécies de corais que estão sendo utilizadas. Alicates diagonais são úteis para cortar corais com galhos finos. No presente estudo, um fragmento foi cortado para cada tratamento, mas o número e o tamanho dos fragmentos podem variar dependendo do número de pólipos desejados. O tamanho dos fragmentos de corte não deve exceder a profundidade da água após a evaporação, de modo que os corais permanecem completamente dentro da água após o processo ser feito.
2. Coloque os fragmentos de corte em pequenas placas de Petri cheias de 12 mL de água do mar para as quais a colônia de corais foi aclimatada. Esta pode ser água do mar artificial (ver Tabela de Materiais) ou água do mar filtrada na mesma salinidade que a colônia de corais foi inserida antes da fragmentação.
   NOTA: É importante cobrir o fragmento completamente com água. Se 12 mL em uma placa de Petri não for suficiente para cobrir o fragmento de corte, otimize o recipiente e o volume em conformidade. No presente estudo, a água utilizada foi coletada do Mar Vermelho, e sua salinidade foi de 40 PSU, medida por um medidor de multiparmetro (ver Tabela de Materiais).
3. Deixe a placa aberta por ~24 h à temperatura ambiente para que a água possa evaporar e sua salinidade possa aumentar gradualmente. Quando a digestão tecidual for observável entre os pólipos, prossiga para o Passo 1.4.
   NOTA: Após o tempo de incubação ter passado, a salinidade da água deve ser aproximadamente 40% maior do que no início, e os pólipos precisam estar prontos para serem separados do esqueleto.
4. Usando uma pipeta de transferência de 1 mL, crie um fluxo suave perto do tecido coral. O fluxo ajudará lentamente o descolamento completo dos pólipos que já digeriram o tecido ao seu redor do esqueleto.
   NOTA: Quando o fluxo de água é criado com a pipeta, pólipos separados ou grupos de pólipos devem sair do esqueleto como flocos. Se uma substância turva sair em vez disso, indica morte ou desintegração tecidual, o que significa que os corais foram incubados por muito tempo ou em uma condição muito estressante (neste caso, alta salinidade). É muito importante fazer um fluxo suave de água para desprender os pólipos, pois um fluxo mais forte pode causar danos físicos a eles.
5. Troque lentamente a água na placa de Petri com água isomótica (use a mesma água que na Etapa 1.2.) usando uma pipeta. Uma troca de água de 50% ao longo de 10 minutos é suficiente para aclimatar os pólipos de volta a uma condição de salinidade não estressante.
   NOTA: Como foram utilizados as colônias de corais da espécie pocilloporida Pocillopora verrucosa do Mar Vermelho, foram realizados testes para determinar sob quais condições específicas os corais deste ambiente único seriam resgatados. É importante destacar a alta salinidade do Mar Vermelho quando comparado com a maioria dos outros ambientes de recifes.

2. Resgate de pólipo por alto fornecimento de água do mar de alta salinidade

NOTA: Este método foi adaptado de Chuang et ^al.27.

1. Prepare 3 L de água do mar de alta salinidade adicionando NaCl à água do mar até que a salinidade aumente em 85%, medida por uma sonda de salinidade.
   NOTA: No presente estudo, uma água do mar de alta salinidade de 74 PSU foi preparada a partir de 40 PSU água do mar do Mar Vermelho.
2. Corte pequenos fragmentos de coral como descrito no Passo 1.1.
3. Coloque os fragmentos de corte em um recipiente de 10 L cheio de 3 L de água do mar isosmótica (neste caso, água do mar com salinidade não estressante para os corais, o mesmo usado na Etapa 1.2) conectada a uma bomba peristótica (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Para uma melhor manutenção da saúde dos corais, controladores de temperatura, bombas de ar e luzes podem ser adicionados para simular as mesmas condições de aquário a que a colônia foi anteriormente exposta. Durante a incubação no presente trabalho, os fragmentos de coral foram mantidos em recipientes a 26 °C, sob um ciclo de luz diário de 12h. O movimento da água e a homogeneização da temperatura foram mantidos pelas bombas de ar.
4. Encha o recipiente contendo fragmentos de coral com a água do mar de alta salinidade preparada na Etapa 2.1 usando a bomba peristáltica por 24 h a uma taxa de 126 mL/h. Adicione um total de 3 L de água a uma salinidade crescente de aproximadamente 40%.
   NOTA: A água de alta salinidade pode ser produzida simplesmente adicionando NaCl à água do mar até atingir a salinidade pretendida.
5. Crie um fluxo de água suave com uma pipeta para liberar os pólipos do esqueleto (Passo 1.4.).
6. Troque lentamente a água em que os pólipos estão contidos por água isomótica (Passo 1.5.). Em seguida, vá para o passo 4 ou passo 5.

3. Resgate de pólipo por incubação de água do mar sem cálcio

NOTA: Este método foi adaptado de Pang et ^al.24.

1. Prepare a solução de água do mar artificial sem cálcio (CaFSW) adicionando 26,29 g de NaCl, 0,872 g de KCl, 2,16 g de MgSO₄, 11,94 g de MgCl₂, 3,42 g de Na₂SO₄ e 0,286 g de NaHCO₃ (ver Tabela de Materiais) a 1 L de água desionizada.
   NOTA: Esta solução foi ajustada a partir de protocolos anteriores para ser mais adequada para corais adaptados a uma salinidade de 40 PSU. Para corais adaptados a outras condições de salinidade, utilize a mesma proporção de sais, mas ajuste a massa total de solutos para obter a salinidade mais adequada aos corais em uso.
2. Corte pequenos fragmentos de corais como descrito no Passo 1.1.
3. Submergir os fragmentos de coral em placas de Petri preenchidos com o CaFSW preparado anteriormente (Passo 3.1.) e incuba-los em incubadoras orbitais a uma velocidade de rotação de 80 rpm por 3 h.
   NOTA: Mais uma vez, é importante cobrir o fragmento completamente com água. Se uma placa de Petri não for suficiente para cobrir o fragmento, otimize o recipiente e o volume de acordo com a necessidade experimental.
4. Transfira os fragmentos para placas de Petri ou placas de 6 poços preenchidas com 20% de DMEM (Modified Eagle Media) e 100 mg/mL de solução de ampicilina (ver Tabela de Materiais) preparadas com 40 PSU de água do mar artificial. Incubar os fragmentos a 26 °C e 80 rpm, trocando a mídia todos os dias até que a digestão do tecido seja observável entre os pólipos e pólipos individuais começarem a se desprender do esqueleto.
   NOTA: Na maioria dos casos, a digestão tecidual é completa dentro de 20 h de incubação neste meio de comunicação, e não são necessárias trocas.
5. Transfira os pólipos para água do mar esterilizada para recuperação inicial usando uma pipeta. Após 1h de incubação, proceda ao Passo 4 ou Passo 5.

4. Manutenção de pólipos em placas de Petri

1. Uma vez que os pólipos são devolvidos à água do mar filtrada com salinidade não estressante, selecione pólipos viáveis observando a integridade e o movimento do tecido causados pelo fluxo ciliar sob um estereoscópio.
2. Coloque os pólipos selecionados em uma placa de vidro ou plástico petri e cubra a placa de Petri com uma rede de plâncton (tamanho de malha de 200 μm, ver Tabela de Materiais) para que os pólipos não flutuem para longe do prato.
   NOTA: O tamanho da rede de malha pode variar de acordo com o tamanho dos pólipos. É importante notar que as redes devem ter poros menores que os pólipos e permitir a troca de água e penetração de luz.
3. Coloque a placa de Petri dentro de um aquário com as condições adequadas para as espécies de corais utilizadas.
   NOTA: No presente estudo, as condições foram de 40 PSU filtrada de água do mar a 26 °C e um ciclo de luz de 12 h.
4. Abra as placas de Petri pelo menos uma vez por semana para renovar a água e limpar os pratos. Este passo é importante para eliminar o crescimento excessivo de algas que podem competir ou danificar os pólipos de coral liberando localmente compostos tóxicos.

5. Manutenção de pólipos em incubadoras

1. Selecione pólipos viáveis como descrito na Etapa 4.1.
2. Coloque os pólipos em frascos de células superficiais de 75 cm² preenchidos com 50 mL de água do mar isosmótica usando pipetas de transferência.
   NOTA: No trabalho atual, a água do mar filtrada coletada do Mar Vermelho foi utilizada para manutenção de pólipos. Pode-se utilizar água com as mesmas características da utilizada na Etapa 1.2.
3. Feche os frascos e mova-os para incubadoras. Coloque as incubadoras em ciclos de luz de 12h a 26 °C e 40 rpm. Troque 50% do volume de água a cada 4 dias e transfira o conteúdo para limpar frascos quando/se estiverem cheios de algas ou biofilme nas paredes.
   NOTA: As imagens foram capturadas com um sistema de zoom totalmente apoquiromático equipado com uma câmera HD (ver Tabela de Materiais) para os resultados representativos.

O resgate de pólipos foi induzido em fragmentos de coral pertencentes a uma única colônia da espécie P. verrucosa seguindo três métodos diferentes (Figura 1). O resgate induzido pela alta salinidade após a evaporação da água foi concluído após 24 h de incubação de fragmentos de coral em placas de Petri a temperatura ambiente cheia de água inicialmente a 40 PSU, que então atingiu uma salinidade final de 59 PSU uma vez que o processo acabou (Figura 2A-C,I). O resgate por fornecimento de água salgada também foi atingido após 24 horas de incubação na água inicialmente a 40 PSU que atingiu uma salinidade de 52 PSU após 12 h e 59 PSU no final do processo, após 24 h (Figura 2D-F,I). Em ambos os experimentos, o aumento da salinidade foi responsável pela indução da digestão tecidual pelos pólipos. Após 12h, a condição de alta salinidade causou a contração dos pólipos em conjunto com o afinamento gradual do coenosarc, causando o descolamento final dos pólipos após 24 h. A indução de resgate por meio da incubação em água do mar livre de cálcio foi completa após uma incubação de 3h no CaFSW seguida de uma incubação de 20h na mídia DMEM de 20% (Figura 2G-H). O tecido foi retirado do esqueleto nos três métodos depois de afastá-lo com uma pipeta até que pólipos de coral individualizados (Figura 3A-C) e "bolas de tecido" fossem gerados.

Após o desprendimento, os pólipos dos três métodos foram coletados e autorizados a se recuperar em água do mar antes de serem alocados em placas de Petri cobertas com redes ou frascos celulares. Os pólipos obtidos a partir da evaporação e dos métodos de abastecimento de água foram mantidos em placas de Petri dentro de aquários e sobreviveram por 6 semanas e 8 semanas, respectivamente (Figura 3D e Figura 3F). Estes micropropostas mantiveram a anatomia usual de pólipos, apresentando tentáculos, discos basais e bocas1. Os pólipos obtidos através da incubação em água do mar livre de cálcio tiveram uma vida útil curta, sobrevivendo até 1 dia, após o qual seu tecido se dissociou. Pólipos obtidos do método de evaporação da água do mar mantidos em frascos de cultura celular dentro de incubadoras sobreviveram por até 3 semanas sem dissociação de tecidos (Figura 3F). Em todos os casos, embora os pólipos não pudessem se prender ao substrato, eles eram visualmente saudáveis e mantinham sua cor, com as células zooxanthellae ainda sendo visíveis dentro de seus tecidos1.

Figura 1: Representação esquemática das três diferentes metodologias testadas para indução de resgate de pólipos (esquerda) seguida da ilustração de dois métodos para manter os pólipos adquiridos em condições de laboratório (direita). (A) Representação da metodologia de resgate de pólipos por evaporação da água. (B) Representação da metodologia de resgate de pólipos pelo alto fornecimento de água do mar de salinidade. (C) Representação da metodologia de resgate de pólipos por incubação de água do mar sem cálcio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens do processo de resgate do pólipo induzida por três metodologias diferentes utilizando fragmentos da espécie de coral P. verrucosa. (A-C) Um fragmento de coral a 0h, 12 h e 24 h após a incubação, respectivamente, em uma placa de Petri usando o método de evaporação da água. (D-F) Um fragmento de coral a 0h, 12 h e 24 h após a incubação, respectivamente, utilizando o método de abastecimento de água do mar de alta salinidade. (G,H) Fragmentos de coral expostos ao método de incubação da água do mar sem cálcio antes e depois, respectivamente. As incubações em água do mar artificial sem cálcio foram para 3 h e em 20% DMEM por 21 h. (I) Representação gráfica dos valores de salinidade na UPA da água do mar ao longo do tempo durante os métodos de evaporação da água do mar e alta salinidade do fornecimento de água do mar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens de pólipos de P. verrucosa obtidos dos três procedimentos de indução de resgate. (A-C) As imagens dos pólipos obtidos a partir da evaporação, do abastecimento de água salgada e dos métodos de água do mar livres de cálcio, respectivamente, foram capturadas imediatamente após serem retiradas do esqueleto. (D) A imagem de um pólipo coral obtido do método de evaporação após sobreviver 6 semanas em uma placa de Petri. (E) A imagem de um pólipo coral obtido do método de abastecimento de água salgada após sobreviver 8 semanas em uma placa de Petri. (F) A imagem de um pólipo coral obtido do método de evaporação após sobreviver 3 semanas em um frasco de cultura celular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.