Indução de resgate de pólipos em colônias de corais para obtenção de micropropagates individualizados para uso experimental em laboratório

A micropropagação de corais ainda está em sua infância. A otimização de protocolos para resgate de pólipos é fundamental para preencher essa lacuna, permitindo que os cientistas usem pólipos como modelos para estudar corais em ambientes de laboratório. O resgate de pólipos torna possível criar múltiplas propagações a partir de pequenos fragmentos de coral.

Pólipos podem ser usados em diferentes experimentos facilitando a observação de processos microscópicos em corais, por exemplo. Recifes de coral estão ameaçados. Nosso objetivo é usar esse modelo replicável para desenvolver estratégias para proteger os corais do branqueamento e outras ameaças ambientais de forma eficiente e não invasiva.

Esse método poderia auxiliar na investigação da fisiologia coral, interações de microbioma hospedeiro e os mecanismos envolvidos no branqueamento. Tais achados podem contribuir para a otimização de probióticos de corais, por exemplo. Usar água do mar com uma salinidade adequada é fundamental.

A salinidade deve começar no nível do ambiente natural do coral e aumentar lentamente para que o estresse não seja excessivamente prejudicial. Coletar pólipos no momento correto e escolher aqueles que estão mais intactos é crucial para sua sobrevivência. Uma demonstração visual pode ser vital para entender essas pistas.

Primeiro, use alicates de corte diagonal para cortar pequenos fragmentos de uma colônia de corais, em seguida, colocá-los em pequenas placas de Petri cheias de 12 mililitros de água do mar aos quais a colônia de corais foi aclimatada. Deixe a placa aberta por cerca de 24 horas à temperatura ambiente para que a água evapore e sua salinidade aumente gradualmente. Quando a digestão tecidual for observável entre os pólipos, use uma pipeta de transferência de 1 mililitro para criar um fluxo suave perto do tecido coral.

O fluxo ajudará lentamente a completar o descolamento de pólipos que já digeriram o tecido ao seu redor a partir do esqueleto, em seguida, com a pipeta, lentamente trocar a água na placa de Petri com água isomótica. Para preparar água do mar de alta salinidade, pegue a água do mar normal e adicione cloreto de sódio à água do mar para preparar três litros de água do mar de alta salinidade até que a salinidade aumente em 85% Depois de cortar pequenos fragmentos de coral como demonstrado anteriormente, coloque-os em um recipiente de 10 litros com três litros de água do mar isosmótica conectado a uma bomba peristáltica. Encha este recipiente com três litros de água do mar previamente preparada por 24 horas a uma taxa de 126 mililitros por hora para aumentar a salinidade em cerca de 40% Usando uma pipeta, crie um fluxo suave de água para liberar os pólipos do esqueleto.

Troque lentamente a água no recipiente com água do mar isosmótica. Adicione 26,29 gramas de cloreto de sódio, 0,872 gramas de cloreto de potássio, 2,16 gramas de sulfato de magnésio, 11,94 gramas de cloreto de magnésio, 3,42 gramas de sulfato de sódio e 0,26 gramas de bicarbonato de sódio a um litro de água do mar desionizada para preparar água do mar sem cálcio, em seguida, encher as placas de Petri com esta água do mar livre de cálcio. Depois de cortar pequenos fragmentos de coral, submerse-os em água do mar sem cálcio nas placas de Petri.

Coloque os pratos em uma incubadora orbital por três horas a uma velocidade de rotação de 80 rpm, depois transfira os fragmentos para placas de Petri preenchidos com 20% DMEM preparados com água do mar artificial de 40 unidades práticas de salinidade e contendo 100 miligramas por litro de ampicilina. Incubar os fragmentos a 26 graus Celsius e 80 rpm. Troque a mídia todos os dias até que a digestão do tecido seja observável entre pólipos e pólipos individuais começam a se separar do esqueleto, depois transferem os pólipos para água do mar esterilizada e incubam por uma hora.

Uma vez que os pólipos são devolvidos à água do mar filtrada com salinidade não estressante, selecione os pólipos viáveis observando a integridade e o movimento do tecido causados pelo fluxo ciliar sob um microscópio estéreo. Coloque os pólipos selecionados em uma placa de Petri e cubra a placa de Petri com uma rede de plâncton de tamanho de malha de 200 micrômetros para que os pólipos não flutuem para longe do prato. Coloque a placa de Petri dentro de um aquário com condições adequadas para as espécies de corais utilizadas.

Para evitar o crescimento excessivo das algas, abra a placa de Petri pelo menos uma vez por semana para renovar a água e limpar a placa. Depois de selecionar os pólipos como mostrado anteriormente, usando uma pipeta de transferência, coloque-os em um frasco de célula superficial de 75 centímetros cheio com 50 mililitros de água do mar isomótica, em seguida, feche o frasco e coloque-os em uma incubadora definida em ciclos de luz de 12 horas, 26 graus Celsius e 40 rpm. Se o frasco estiver cheio de algas ou biofilmes, transfira o conteúdo para um frasco limpo.

Neste estudo, o resgate de pólipos foi induzido por três métodos diferentes. O método de evaporação da água resultou em um resgate completo dentro de 24 horas após a incubação, e a salinidade aumentou de 40 para 59 unidades práticas de salinidade após 24 horas. O método de abastecimento de água salgada também resultou em resgate de pólipos após 24 horas de incubação.

Aqui, a salinidade aumentou de 40 para 52 unidades práticas de salinidade após 12 horas de incubação e, em seguida, para 59 unidades práticas de salinidade após 24 horas. A indução de resgate por meio da incubação em água do mar livre de cálcio foi completa após três horas de incubação de pólipos nele, seguida por 20 horas de incubação nos 20% de mídia DMEM, Em todos os três métodos, pólipos de coral individualizados poderiam ser gerados. Pólipos de coral gerados pelo método de evaporação poderiam sobreviver por seis semanas, enquanto aqueles produzidos pelo método de abastecimento de água do mar de alta salinidade poderiam sobreviver por oito semanas em pratos de Petri dentro de aquários.

Pólipos obtidos do método de evaporação da água do mar mantidos em frascos de cultura celular dentro de incubadoras sobreviveram por até três semanas sem a dissociação completa de seus tecidos. Ao separar pólipos do esqueleto, é importante ser gentil. Se eles não forem completamente separados, forçar o desprendimento por água fortemente cansando causará danos e menores taxas de sobrevivência.

Usando esses métodos, a liquidação de pólipos pode ser induzida. O assentamento de pólipos pode responder a perguntas sobre seus processos de calcificação e crescimento. Após o desenvolvimento da indução de resgate de pólipos, os pesquisadores puderam estudar a formação inicial do esqueleto de coral e visualizar diretamente o branqueamento de corais na escala de pólipos.