Reprodutibilidade e precisão aprimoradas da quantificação de alto rendimento de dados de crescimento bacteriano usando um leitor de microplacas

Summary

Aqui, um protocolo de alto rendimento é apresentado para medir dados de crescimento, incluindo curvas de crescimento, taxa de crescimento e taxa máxima de crescimento. O protocolo foi verificado e validado usando duas bactérias produtoras de biofilme. Os resultados e a abordagem aplicados neste estudo podem ser expandidos para outros protocolos de alto rendimento usando leitores de microplacas.

Abstract

Este estudo teve como objetivo desenvolver um protocolo repetível, confiável e de alto rendimento para monitorar o crescimento bacteriano em placas de 96 poços e analisar a taxa máxima de crescimento. As curvas de crescimento e as taxas máximas de crescimento de duas espécies bacterianas foram determinadas. Questões incluindo (i) condensação da tampa, (ii) correção do comprimento do caminho, (iii) tamanho da inoculação, (iv) intervalo de tempo de amostragem e (v) viés espacial foram investigados. A repetibilidade do protocolo foi avaliada com três repetições técnicas independentes, com desvio padrão de 0,03 entre as execuções. As taxas máximas de crescimento de Bacillus mycoides e Paenibacillus tundrae foram determinadas em (média ± DP) 0,99 h⁻¹ ± 0,03 h⁻¹ e 0,85 h⁻¹ ± 0,025 h⁻¹, respectivamente. Essas bactérias são mais difíceis de monitorar opticamente devido à sua afinidade para se aglomerar. Este estudo demonstra a importância crítica do tamanho da inoculação, correção do comprimento do caminho, aquecimento da tampa, intervalos de tempo de amostragem e viés espacial da placa do poço para obter dados confiáveis, precisos e reprodutíveis em leitores de microplacas. O protocolo desenvolvido e suas etapas de verificação podem ser expandidos para outros métodos usando leitores de microplacas e protocolos de alto rendimento, reduzindo os erros inatos e os custos de material dos pesquisadores.

Introduction

O desenvolvimento do interesse na manipulação multiômica, incluindo estudos de mecanismos e metabólicos de bactérias, enfatiza a importância de métodos automatizados e de alto rendimento, como o registro de dados de crescimento ^1,2. Os dados de crescimento que compreendem parâmetros cinéticos, como taxas máximas de crescimento, podem ajudar a caracterizar as respostas bacterianas a diferentes condições físicas, químicas e antibacterianas. Os dados da taxa de crescimento são uma variável de resposta padrão utilizada para descobrir possíveis ligações genóti....

Protocol

NOTA: Todas as etapas deste protocolo devem ser seguidas em condições estéreis (ou seja, entre duas chamas ou um gabinete de biossegurança). Todos os materiais e ferramentas são autoclavados por 20 min. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, equipamentos e software usados neste protocolo. As mãos enluvadas são desinfetadas, mantidas molhadas com desinfetante para as mãos ou solução de álcool a 70% por pelo menos 1 minuto e não removidas do gabinete de segurança posteriormente. Caso contrário, o procedimento de desinfecção deve ser repetido antes de colocar as mãos de volta no armário de segurança. CUIDADO: Certifi....

Results

Validação de leitura OD e fator de correção de comprimento de caminho
Amostras divididas de cultura de B. mycoides foram coletadas em diferentes momentos e medidas usando o leitor de microplacas e o espectrofotômetro (Figura 1A). Esta etapa foi realizada para validar os resultados em diferentes dispositivos. Os dados do OD₆₀₀ se correlacionaram, mas não corresponderam (Figura 1B). A correlação foi linear com uma inclinação.......

Discussion

Os leitores de microplacas permitem obter taxas de crescimento consistentes e repetíveis. Essa tecnologia minimiza o erro humano e permite amostragem de alto rendimento. A pequena quantidade de cultura necessária por amostra torna essa abordagem uma alternativa atraente e de baixo custo para contagens de células usando frascos ou tubos de ensaio. Os leitores de microplacas permitem um grande tamanho de amostra, aumentando o poder estatístico e, posteriormente, facilitando cálculos confiá.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrífuga	Eppendorf	5810 R
Tubos de centrífuga - 15 mL	ThermoFisher- Científico	339650	Tubos Centriguge Estéreis
- 50 mL	ThermoFisher- Científico	339652
Alça de inoculação descartável estéril, 10 µ L	Cole-Parmer	UZ-06231-08	Frascos Erlenmeyer estéreis
- 250 mL	Cole-Parmer	UZ-34502-59	Vidro
Isopropanol	ThermoFisher- Científico	396982500	≥ Tampão de fosfato 99.0
Salino	Pontas de Pipett Sigma-Aldrich	P4417
1.000 µ L	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-76
Ponteiras de Pipett 10 mL	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-83
Ponteiras Pipett 200 µ L	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-85
Ponteiras de Pipett 5 mL	ThermoFisher- Científico	UZ-25001-80
Pipetador 1.000 µ L	Cole-Parmer	UZ-07909-11
Pipetador 10 mL	Cole-Parmer	UZ-07909-15
Pipetador 200 µ L	Cole-Parmer	UZ-07909-09
Pipetador 5 mL	Cole-Parmer	UZ-07859-30
Caldo de Soja Tríptico	Millipore	22091	Adequado para microbiologia