Técnicas moleculares e imunológicas em um modelo de rato geneticamente modificado de tumor estrommal gastrointestinal

Summary

O objetivo deste manuscrito é descrever o modelo de mouse Kit^V558Δ/+ e técnicas para dissecção e processamento bem-sucedidos de amostras de camundongos.

Abstract

O tumor estromal gastrointestinal (GIST) é o sarcoma humano mais comum e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no receptor KIT. Entre os tipos de tumores, inúmeros modelos de camundongos foram desenvolvidos para investigar a próxima geração de terapias contra o câncer. No entanto, no GIST, a maioria dos estudos in vivo usa modelos de mouse xenoenxerto que têm limitações inerentes. Aqui, descrevemos um modelo de camundongos imunocompetente, geneticamente modificado, de tumor estromal gastrointestinal que abriga uma mutação Kit^V558Δ/+ Neste modelo, o KIT mutante, o oncogene responsável pela maioria dos GISTs, é impulsionado por seu promotor endógeno que leva a um GIST que imita a aparência histológica e o infiltrado imunológico visto em GISTs humanos. Além disso, este modelo tem sido usado com sucesso para investigar terapias moleculares e imunológicas direcionadas. Aqui, descrevemos a criação e manutenção de uma colônia de ratos Kit^V558Δ/+ Além disso, este artigo detalha o tratamento e a aquisição de GIST, drenando linfonodos mesentéricos e ceco adjacente em camundongos Kit^V558Δ/+ , bem como preparação de amostras para análises moleculares e imunológicas.

Introduction

GIST é o sarcoma mais comum em humanos com uma incidência de cerca de 6.000 casos nos Estados Unidos da América¹. GIST parece se originar das células pacemaker gastrointestinal chamadas células intersticiais de Cajal, e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no KIT de quinase tyrosina ou PDGFRA². A cirurgia é o pilar do tratamento para GIST e pode ser curativa, mas pacientes com doença avançada podem ser tratados com o inibidor de tyrosina quinase (TKI), imatinib. Desde sua introdução, há mais de 20 anos, o imatinib transformou o paradigma do tratamento em GIST, melhorando a sobrevida em d....

Protocol

Todos os camundongos foram alojados em condições livres de patógenos na Universidade da Pensilvânia de acordo com as diretrizes do NIH e com a aprovação da IACUC da Universidade da Pensilvânia. A eutanásia foi realizada após os procedimentos operacionais padrão do Laboratório de Recursos Animais da Universidade da Pensilvânia.

1. Kit^V558Δ/+ reprodução de camundongos

1. Backcross do Kit^V558Δ/+ ratos mais de 10 vezes em um fundo C57BL/6J usando ratos C57BL/6J. Para isso, crie o kit^{macho V558Δ/+} com camundongos C57BL/6J fêmeas a uma....

Results

O modelo de mouse Kit^V558Δ/+ permite a investigação de terapêutica em um modelo de camundongo imunocompetente. Os camundongos Kit^V558Δ/+ têm uma vida útil média de 8 meses devido à obstrução intestinal progressiva (Figura 4). Tumores do Kit^V558Δ/+ camundongos expressam marcadores canônicos de GIST incluindo o KIT de quinase tyrosina e o canal transmembrano DOG1 (

Discussion

O modelo de mouse Kit^V558Δ/+ é uma poderosa ferramenta de pesquisa na análise molecular e imunológica do GIST. Embora a estratégia de reprodução exija uma única cruz, o uso de coortes de camundongos Kit^V558Δ/+ em experimentos que analisam a resposta ao tumor requer uma reprodução extensiva. Os camundongos devem ter idade e sexo compatível para garantir pesos tumorais semelhantes, e 10% dos camundongos morrem antes das 8 semanas de idade quando os tumores são estabelecidos. Estratég.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro de 100 mícrons	EMSCO	1194-2360
1x tampão de lise RBC	Life Technologies	00-4333-57
Seringa de 3mL	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4– 15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados, 10 poços, 30 µ l	Bio-Rad	4561083
solução de paraformaldeído a 4%	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
filtro de 40 mícrons	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
filtro de 70 mícrons	EMSCO	1194-2350
AKT anticorpo (C67E7)	Sinalização celular	4691
Camundongos C57BL / 6J	O Laboratório
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Inibidor de protease livre de mini edta completo	Thomas Scientific	C852A34
Condessa II Contador de Células Automatizado	Thermo Fisher Scientific
Bisturis Descartáveis	Thermo Fisher Scientific / Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 anticorpo	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK anticorpo (p44 / 42)	Sinalização celular	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Homogeneizador Fisherbrand 850	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	Centro de Células
Mesilato de Imatinibe	Selleck Chemicals	S1026
KIT anticorpo (D13A2)	Sinalização Celular	3074
KitV558Δ/+ Genotipagem	Transnetyx
Tubos de microcentrífuga (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Kit de Imunodetecção de Mouse em Mouse,	Basic Vector Laboratories	BMK-2202
Membrana de Nitrocelulose, Pré-cortada, 0.45 µ m	Rio-Rad	1620145
Leite em pó desnatado	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substituto	Sigma Aldrich	74385
anticorpo p-AKT (S473)	Sinalização celular	4060
anticorpo p-ERK (p44/42)	Sinalização celular	9101
anticorpo p-KIT (Y719)	Sinalização celular	3391
Inibidor de Protease PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Tubos de Teste de Poliestireno de Fundo Redondo (FACS)	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	Centro de Células
Fluoreto de sódio (NaF)	Sigma Aldrich
Ortovanadato de sódio (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Substrato de Duração Estendida	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	Placa de cultura de tecidos do Centro
(100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
plataforma vivaCT 80	Scanco medical