O objetivo deste manuscrito é descrever o modelo de mouse KitV558Δ/+ e técnicas para dissecção e processamento bem-sucedidos de amostras de camundongos.
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Artigo de método
Técnicas moleculares e imunológicas em um modelo de rato geneticamente modificado de tumor estrommal gastrointestinal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tumor estromal gastrointestinal (GIST) é o sarcoma humano mais comum e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no receptor KIT. Entre os tipos de tumores, inúmeros modelos de camundongos foram desenvolvidos para investigar a próxima geração de terapias contra o câncer. No entanto, no GIST, a maioria dos estudos in vivo usa modelos de mouse xenoenxerto que têm limitações inerentes. Aqui, descrevemos um modelo de camundongos imunocompetente, geneticamente modificado, de tumor estromal gastrointestinal que abriga uma mutação KitV558Δ/+ Neste modelo, o KIT mutante, o oncogene responsável pela maioria dos GISTs, é impulsionado por seu promotor endógeno que leva a um GIST que imita a aparência histológica e o infiltrado imunológico visto em GISTs humanos. Além disso, este modelo tem sido usado com sucesso para investigar terapias moleculares e imunológicas direcionadas. Aqui, descrevemos a criação e manutenção de uma colônia de ratos KitV558Δ/+ Além disso, este artigo detalha o tratamento e a aquisição de GIST, drenando linfonodos mesentéricos e ceco adjacente em camundongos KitV558Δ/+ , bem como preparação de amostras para análises moleculares e imunológicas.
Introdução
GIST é o sarcoma mais comum em humanos com uma incidência de cerca de 6.000 casos nos Estados Unidos da América1. GIST parece se originar das células pacemaker gastrointestinal chamadas células intersticiais de Cajal, e é tipicamente impulsionado por uma única mutação no KIT de quinase tyrosina ou PDGFRA2. A cirurgia é o pilar do tratamento para GIST e pode ser curativa, mas pacientes com doença avançada podem ser tratados com o inibidor de tyrosina quinase (TKI), imatinib. Desde sua introdução, há mais de 20 anos, o imatinib transformou o paradigma do tratamento em GIST, melhorando a sobrevida em doenças avançadas de 1 para mais de 5 anos 3,4,5. Infelizmente, o imatinib raramente é curativo devido às mutações adquiridas do KIT, por isso novos tratamentos são necessários para este tumor.
Os modelos de camundongos são uma importante ferramenta de pesquisa na investigação de novas terapias em câncer. Múltiplos modelos de xenoenxerto subcutâneo e xenoenxerto derivados do paciente foram desenvolvidos e investigados em GIST 6,7. No entanto, camundongos imunodeficientes não representam totalmente o GIST humano, uma vez que os GISTs abrigam perfis imunológicos diferenciais dependendo de sua mutação oncogênica, e alterar o microambiente tumoral gastrointestinal melhora os efeitos da terapia TKI 8,9. O mouse KitV558Δ/+ tem uma exclusão germinal heterozigous em Kit exon 11, que codifica o domínio justxtamembrano, o local mais comumente mutado no GIST10 humano. Os camundongos KitV558Δ/+ desenvolvem um único cecal GIST com 100% de penetração, e os tumores têm histologia semelhante, sinalização molecular, infiltração imunológica e resposta à terapia como GIST 8,11,12,13. Aqui, descrevemos a reprodução, o tratamento e o isolamento e processamento de espécimes em camundongos KitV558Δ/+ para uso em pesquisas moleculares e imunológicas em GIST.
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Protocolo
Todos os camundongos foram alojados em condições livres de patógenos na Universidade da Pensilvânia de acordo com as diretrizes do NIH e com a aprovação da IACUC da Universidade da Pensilvânia. A eutanásia foi realizada após os procedimentos operacionais padrão do Laboratório de Recursos Animais da Universidade da Pensilvânia.
1. KitV558Δ/+ reprodução de camundongos
- Backcross do KitV558Δ/+ ratos mais de 10 vezes em um fundo C57BL/6J usando ratos C57BL/6J. Para isso, crie o kitmacho V558Δ/+ com camundongos C57BL/6J fêmeas a uma proporção de 1:2.
NOTA: O genótipo homozigoso kitV558Δ/V558Δ é letal no útero. É possível criar camundongos kitV558Δ/+ fêmeas com camundongos C57BL/6J machos, mas o tamanho da ninhada é cerca de metade do visto de camundongos fêmeas selvagens C57BL/6J. Além disso, camundongos kitV558Δ/+ fêmeas produzem ninhadas limitadas após 4 meses de idade. - Genótipo os filhotes aos 7-14 dias de idade por recorte do dedo do pé para confirmar a presença do genótipo kitV558Δ/+ Use o primer para a frente: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; repórter 1: CCTCGACAACCTTCCA; primer reverso: TTGCGTCGGGTCTATATTAAACAT; e repórter 2: TCTCCTCGACCTTCCA para genotipagem.
2. KitV558Δ/+ tratamento do mouse
- Idade e sexo combinam com o KitV558Δ/+camundongos antes do tratamento. Use os camundongos com idade e sexo em coortes, pois os tumores de camundongos kitV558Δ/+ femininos são maiores do que os de camundongos machos. Trate os camundongos com 8-12 semanas de idade, momento em que os tumores são estabelecidos (Figura 1).
- Dar inibidores de tyrosina quinase oralmente ou por injeção intraperitoneal (i.p.); Os tumores kit V558Δ/+ são sensíveis aos inibidores da quinase de tirasina. Forneça imatinibe em uma dose de 600 mg/L em água potável ou injeções i.p. de 45 mg/kg duas vezes por dia. Meça a redução do peso tumoral utilizando escamas digitais após a dissecção do tumor, como mostrado na etapa 3, que é de aproximadamente 50% em 1 semana e 80% em 4 semanas após o tratamento com imatinibe (Figura 2).
3. KitV558Δ/+ colheita de órgãos do rato
- Eutanize camundongos por narcose CO2 a uma taxa de fluxo de 60% de volume de câmara por minuto. Deixe os ratos na câmara por pelo menos 2 minutos após a respiração ter cessado, em seguida, realizar luxação cervical para confirmar a morte.
- Esterilize todos os instrumentos, use luvas durante todo o procedimento e mantenha um campo estéril. Prepare a pele com 70% de etanol. Faça uma incisão vertical de 2 cm usando uma tesoura e entre na cavidade abdominal. Lise severamente qualquer aderência intra-abdominal.
- Para remover o linfonodo mesentérico drenante, siga os passos descritos abaixo.
- Identifique o ceco e levante sua mesenteria superiormente. Aproximadamente no meio do caminho até a base da mesenteria colonia, identifique o linfonodo mesentérico e dissefique-o bruscamente. O linfonodo é off-white e cerca de 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho.
- Divida o tecido linfático em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão de células únicas, conforme necessário. Para suspensões de células únicas, coloque tecido linfático em 20 mL de mídia livre de soro (RPMI) e mantenha no gelo.
- Para o isolamento do GIST e do ceco, siga os passos descritos abaixo.
- O ceco em camundongos KitV558Δ/+ é substituído principalmente por um GIST. Divida cuidadosamente a junção ileocólica da base do tumor. Para coletar o ceco, divida o cólon novamente, 2 cm proximal à base do tumor.
- Em 50%-60% dos camundongos KitV558Δ/+ , a cabeça do tumor contém uma tampa de tecido cecal, que normalmente contém fluido sêmérico, mas raramente pode conter pus (Figura 3). Disseca o tecido da tampa para longe do tecido tumoral.
- Divida o tecido tumoral e/ou ceco em terços para isolamento de proteínas, histologia e suspensão de células únicas, conforme necessário. Para suspensões unicelulares, coloque tecido tumoral ou ceco no HBSS com 2% de FCS, o suficiente para cobrir a amostra e manter no gelo.
4. Análise de manchas ocidentais do tecido GIST
- Prepare o tampão de lise tecidual contendo 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, detergente 1% não dedesaturado, 2 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF e 20 μl/ml mistura inibidora de proteínaase.
- Prepare uma solução salina tamponada 1x Tris com 1% de Tween 20 (TBST) combinando 1800 mL de água deionizada, 2 mL de Tween 20 e 200 mL de soro fisiológico 10x Tris-tamponado (TBS).
- Resuspend tecido a partir do passo 3.4.3 em um tubo FACS em 5mL/g de tampão de lise tecidual e homogeneizar duas vezes com um homogeneizador mecânico a 15.000 rpm para 15 s no gelo. Incubar lysate por 30 minutos no gelo.
- Transfira para um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL. Centrifugar em velocidade máxima por 20 min a 4 °C. Transfira supernante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Execute lysates em um gel de 4% a 15% de gradiente, depois transfira para uma membrana de nitrocelulose, como descrito em14.
- Lave a membrana uma vez em 1x TBS por 5 min e depois bloqueie a membrana em 5% de leite por 1h. Novamente, lave a membrana uma vez em 1x TBS por 10 minutos.
- Incubar membrana em anticorpo primário diluído 1:1000 em 5% BSA a 4 °C durante a noite. Lave a membrana 3x em 1x TBST por 10 min cada. Incubar a mancha com anticorpo secundário diluído 1:2500 em 2,5% de leite por 1h à temperatura ambiente.
- Lave a membrana uma vez em 1x TBS por 5 min. Adicione substrato HRP suficiente para cobrir a membrana, tipicamente 200-500 μL, e use um imager digital para detectar e quantificar a quemiluminescência.
5. Imunohistoquímica do tecido GIST
- Fixar tecido a partir da etapa 3.3.2 ou 3,4,3 em 4% de paraformaldeído a 4 °C durante a noite. Armazene tecido em 70% EtOH até estar pronto para processamento. Blocos de incorporação e seção com 5 μm de espessura em lâminas de vidro, como descrito15,16.
- Detecção imunohistoquímica completa usando um kit básico de imunodetecção, como descrito anteriormente17.
6. Suspensão celular única do linfonodo mesenérico
- Despeje a mídia RPMI com a amostra do linfonodo da etapa 3.3.2 sobre um filtro de 100 μm. Mova o filtro para o novo linfonodo cônico de 50 mL e mash com a extremidade macia de uma seringa de plástico de 3 mL. Lave o filtro com 20 mL de mídia RPMI.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g a 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante.
- Resuspend pelotas em 20 mL de 1% FBS em PBS (tampão de contas) e despeje sobre um filtro de 40 μm. Pegue o filtrado da célula. Conte células usando um hemócito.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g a 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 107 células/mL para citometria de fluxo.
7. Suspensão de célula única do GIST
- Prepare o tampão de colagenase adicionando 250 mg de colagenase IV, um comprimido de inibidor de protease sem EDTA e 100 μL de DNase I a 50 mL de HBSS. Gire por 10 minutos à temperatura ambiente até dissolver.
- Coloque GIST em um prato estéril e adicione 2,5 mL de tampão de colagenase. Tumor mince usando um bisturi estéril e uma tesoura até que o tumor esteja em fragmentos finos. Use uma pipeta grande para aspirar o tumor e colagenase em um tubo de 50 mL.
- Incubar em uma incubadora a tremer a 100 rpm a 37 °C por 30 min. Sacie a reação com 2 mL de FBS.
- Despeje colagenase com espécime GIST sobre um filtro de 100 μm e tumor de purê com a extremidade macia de uma seringa plástica de 3 mL e colete em um tubo de 50 mL. Lave o filtro com 20 mL de HBSS. Centrifugar o filtrado a 450 x g, 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante.
- Resuspenda a pelota em 20 mL de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 μm. Colete o filtrado e conte células usando um hemócito. Centrifugar o filtrado a 450 x g, 4 °C por 5 min. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 107 células/mL para citometria de fluxo.
8. Suspensão de célula única do ceco
- Prepare o tampão de colagenase como na etapa 7.1. Usando uma tesoura, divida o ceco longitudinalmente para expor a mucosa interna. Corte em seções de 0,5 cm e coloque em um tubo de 50 mL com 5 mL de HBSS com 2% de FBS. Agite vigorosamente por 30 s, centrífuga a 450 x g por 20 s, depois aspire o supernatante.
- Adicione 5 mL de HBSS com 2 mM EDTA. Incubar em uma incubadora de agitação a 37 °C a 100 rpm por 15 min. Centrifugar a 450 x g para 20 s. Aspire o supernatante.
- Adicione 5 mL de HBSS. Agite vigorosamente por 30 s, centrífuga a 450 x g por 20 s, depois aspire o supernatante. Repita mais uma vez.
- Adicione 5 mL de tampão de colagenase. Incubar em uma incubadora a 37 °C por 30 min a 100 rpm. Agite vigorosamente a cada 10 minutos. Sacie a reação com 2 mL de FBS.
- Despeje colagenase com espécime de ceco sobre um filtro de 100 μm e amasse com a extremidade macia de uma seringa plástica de 3 mL. Lave o filtro com 20 mL de HBSS. Coletar filtrado.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernatante. Resuspend pelotas em 20 mL de tampão de contas e despeje sobre um filtro de 40 μm. Coletar células filtras e contar usando um hemótmetro.
- Centrifugar o filtrado a 450 x g por 5 min a 4 °C. Aspire o supernatante. Resuspend em tampão de contas a 6 x 107 células/mL para citometria de fluxo.
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Resultados
O modelo de mouse KitV558Δ/+ permite a investigação de terapêutica em um modelo de camundongo imunocompetente. Os camundongos KitV558Δ/+ têm uma vida útil média de 8 meses devido à obstrução intestinal progressiva (Figura 4). Tumores do KitV558Δ/+ camundongos expressam marcadores canônicos de GIST incluindo o KIT de quinase tyrosina e o canal transmembrano DOG1 (
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Discussão
O modelo de mouse KitV558Δ/+ é uma poderosa ferramenta de pesquisa na análise molecular e imunológica do GIST. Embora a estratégia de reprodução exija uma única cruz, o uso de coortes de camundongos KitV558Δ/+ em experimentos que analisam a resposta ao tumor requer uma reprodução extensiva. Os camundongos devem ter idade e sexo compatível para garantir pesos tumorais semelhantes, e 10% dos camundongos morrem antes das 8 semanas de idade quando os tumores são estabelecidos. Estratég...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
Os camundongos KitV558Δ/+ foram geneticamente modificados e compartilhados pelo Dr. Peter Besmer10. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R01 CA102613 e T32 CA251063.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro de 100 mícrons | EMSCO | 1194-2360 | |
| 1x tampão de lise RBC | Life Technologies | 00-4333-57 | |
| Seringa de 3mL | Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences | 14823435 | |
| 4– 15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados, 10 poços, 30 µ l | Bio-Rad | 4561083 | |
| solução de paraformaldeído a 4% | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| filtro de 40 mícrons | EMSCO | 1194-2340 | |
| 5M NaCl | Sigma Aldrich | S6546 | |
| filtro de 70 mícrons | EMSCO | 1194-2350 | |
| AKT anticorpo (C67E7) | Sinalização celular | 4691 | |
| Camundongos C57BL / 6J | O Laboratório | ||
| Collagenase IV | Sigma Aldrich | C5138 | |
| Inibidor de protease livre de mini edta completo | Thomas Scientific | C852A34 | |
| Condessa II Contador de Células Automatizado | Thermo Fisher Scientific | ||
| Bisturis Descartáveis | Thermo Fisher Scientific / Exel International | 14-840-00 | |
| Dnase I | Thomas Scientific | C756V81 | |
| Dog1 anticorpo | abcam | ab64085 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884 | |
| ERK anticorpo (p44 / 42) | Sinalização celular | 9102 | |
| FBS | Thomas Scientific | C788U23 | |
| FIJI software | FIJI | https://imagej.net/software/fiji | |
| Homogeneizador Fisherbrand 850 | Thermo Fisher Scientific | 15-340-169 | |
| HBSS | Centro de Células | ||
| Mesilato de Imatinibe | Selleck Chemicals | S1026 | |
| KIT anticorpo (D13A2) | Sinalização Celular | 3074 | |
| KitV558Δ/+ Genotipagem | Transnetyx | ||
| Tubos de microcentrífuga (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Kit de Imunodetecção de Mouse em Mouse, | Basic Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Membrana de Nitrocelulose, Pré-cortada, 0.45 µ m | Rio-Rad | 1620145 | |
| Leite em pó desnatado | Thermo Fisher Scientific | NC9121673 | |
| Nonidet P 40 Substituto | Sigma Aldrich | 74385 | |
| anticorpo p-AKT (S473) | Sinalização celular | 4060 | |
| anticorpo p-ERK (p44/42) | Sinalização celular | 9101 | |
| anticorpo p-KIT (Y719) | Sinalização celular | 3391 | |
| Inibidor de Protease PMSF | Thermo Fisher Scientific | 36978 | |
| Proeinase K | Thermo Fisher Scientific | BP170050 | |
| Tubos de Teste de Poliestireno de Fundo Redondo (FACS) | Falcon/Thermo Fisher Scientific | 14-959-2A | |
| RPMI | Centro de Células | ||
| Fluoreto de sódio (NaF) | Sigma Aldrich | ||
| Ortovanadato de sódio (Na3VO4) | Sigma Aldrich | S6508 | |
| SuperSignal West Dura Substrato de Duração Estendida | Thermo Fisher Scientific | 34076 | |
| TBS buffer (10x) | Placa de cultura de tecidos do Centro | ||
| (100mm2) | Thermo Fisher Scientific/Falcon | 08-772E | |
| TrisHCL | Thermo Fisher Scientific | BP1757500 | |
| Tween 20 | Rio-Rad | 1706531 | |
| plataforma vivaCT 80 | Scanco medical |
Referências
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Reimpressões e permissões
