Os micróbios intestinais podem impactar positiva ou negativamente a saúde de seu hospedeiro por meio de mecanismos específicos ou conservados. Caenorhabditis elegans é uma plataforma conveniente para rastrear esses micróbios. O presente protocolo descreve a triagem de alto rendimento de 48 isolados bacterianos quanto ao impacto na resistência ao estresse dos nematoides, usados como um proxy para a saúde dos vermes.
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Artigo de método
Triagem de alto rendimento de isolados microbianos com impacto na saúde de Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Com seu tamanho pequeno, vida útil curta e genética fácil, Caenorhabditis elegans oferece uma plataforma conveniente para estudar o impacto de isolados microbianos na fisiologia do hospedeiro. Ele também fluoresce em azul ao morrer, fornecendo um meio conveniente de identificar a morte. Essa propriedade tem sido explorada para desenvolver ensaios de sobrevivência de C. elegans sem rótulo de alto rendimento (LFASS). Estes envolvem o registro de fluorescência de lapso de tempo de populações de vermes fixadas em placas de múltiplos poços, das quais o tempo médio de morte da população pode ser derivado. O presente estudo adota a abordagem LFASS para rastrear múltiplos isolados microbianos de uma só vez quanto aos efeitos sobre a suscetibilidade de C. elegans a calor severo e estresses oxidativos. Esse pipeline de triagem microbiana, que pode ser usado notavelmente para pré-rastrear probióticos, usando resistência ao estresse grave como um proxy para a saúde do hospedeiro é relatado aqui. O protocolo descreve como cultivar coleções de isolados de microbiota intestinal de C. elegans e populações de vermes síncronos em matrizes de vários poços antes de combiná-las para os ensaios. O exemplo fornecido abrange o teste de 47 isolados bacterianos e uma cepa de controle em duas cepas de vermes, em dois ensaios de estresse em paralelo. No entanto, o pipeline de abordagem é prontamente escalável e aplicável à triagem de muitas outras modalidades. Assim, ele fornece uma configuração versátil para pesquisar rapidamente uma paisagem multiparamétrica de condições biológicas e bioquímicas que afetam a saúde de C. elegans.
Introdução
O corpo humano abriga cerca de 10-100 trilhões de células microbianas vivas (bactérias, fungos archaea), que são encontradas principalmente nos ambientes intestinais, cutâneos e mucosas1. Em um estado saudável, estes fornecem benefícios ao seu hospedeiro, incluindo a produção de vitaminas, maturação do sistema imunológico, estimulação de respostas imunes inatas e adaptativas a patógenos, regulação do metabolismo da gordura, modulação das respostas ao estresse e muito mais, com impacto no crescimento e desenvolvimento, início da doença e envelhecimento 2,3,4,5
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Protocolo
As duas cepas de C. elegans utilizadas em paralelo para o presente estudo foram Bristol N2 tipo silvestre e HT1890: daf-16(mgDf50), que crescem a taxas semelhantes. No entanto, o protocolo pode ser replicado com qualquer combinação de duas cepas que tenham taxas de crescimento semelhantes. Observe que, ao testar outras cepas em paralelo (por exemplo, mutantes daf-2 do tipo selvagem e de crescimento lento), diferentes taxas de crescimento devem ser consideradas e, consequentemente, o protocolo precisa ser ajustado. As escalas de tempo e quantidades de vermes e bactérias no protocolo a seguir são otimizadas para testes paralelos de 48 isolados....
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Resultados
Os ensaios LFASS fornecem triagem robusta, de alto rendimento e rápida de várias condições de teste de uma só vez, como a triagem de inúmeros parâmetros genéticos e da microbiota que contribuem para a resistência ao estresse e o envelhecimento. Leva apenas 2-3 semanas para o experimento adquirir um extenso conjunto de dados de várias condições de teste. Populações adultas de vermes selvagens L4 + 36 h foram expostas a estresse térmico de 42 °C e estresse oxidativo induzido por t-BHP a 7% após uma cultura de 36 h.......
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Discussão
C. elegans oferece muitas vantagens para a triagem rápida de vários parâmetros experimentais de uma só vez, devido ao seu pequeno tamanho, transparência, rápido desenvolvimento, curta vida útil, baixo custo e facilidade de manuseio. Seu genoma, plano corporal, sistema nervoso, intestino e microbioma consideravelmente mais simples, mas complexo e semelhante o suficiente aos seres humanos, o tornam um poderoso modelo pré-clínico, onde a visão mecanicista pode ser obtida durante o teste de eficácia ou toxicidade bi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos ao CGC Minnesota (Madison, EUA, NIH - P40 OD010440) por fornecer cepas de vermes e OP50 e ao Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, Kiel, Alemanha) por fornecer todos os isolados microbianos ambientais aqui descritos. Este trabalho foi financiado por uma subvenção UKRI-BBSRC à AB (BB/S017127/1). O JM é financiado por uma bolsa de doutoramento FHM da Universidade de Lancaster.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placas de 10 cm de diâmetro (Não ventiladas) | Fisher Scientific | 10720052 | A ventilação não é necessária para culturas |
| bacterianas Placas de 15 cm de diâmetro (Ventiladas) | Fisher Scientific | 168381 | |
| Placas de fundo plano transparentes e pretas de 384 poços | Corning | 3712 ou 3762 | Não é essencial ser estéril para ensaios de tensão rápida |
| Placas de 6 cm de diâmetro (Ventiladas) | Fisher Scientific | 150288 | A ventilação é necessária para culturas de vermes para evitar hipóxia |
| Placas transparentes de 96 poços (Biolite) | Thermo | 130188 | |
| Agar (< 4% cinzas) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Ágar de boa qualidade é importante para a integridade estrutural dos meios de cultura, para evitar a escavação de minhocas |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman relha | ||
| Bleach | Honeywell | 425044 | |
| Cloreto de cálcio | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Centrífuga 5415 R | Eppendorf | ||
| Centrífuga 5810 R | Eppendorf | ||
| Colesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB ágar | Difco | 240110 | |
| LB caldo | Invitrogen | 12795084 | |
| Pontas LoBind | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduz a perda de vermes durante as transferências |
| Tubos LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Sulfato de magnésio | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
| Leitor de placas- infinito M nano+ | Tecan | A configuração do monocromador permite o ajuste de fluorescência, mas configurações adequadas baseadas em filtros podem ser usadas | |
| Leitor de placas- Spark | Tecan | ||
| Fosfato de potássio monobásico | Honeywell | P0662 | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
| Configuração do estereomicroscópio com base de transiluminação | Leica | MZ6 ou M80 | É necessária uma ampliação de 0,6-0,8x até 40-60x, assim como uma base de transiluminação de boa qualidade com um espelho deformável, titulável ou deslizante para ajustar o contraste |
| t-BHP (tert-hidroperóxido de butilo) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Selos adesivos transparentes Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | É importante que seja transparente e que possa tolerar as temperaturas envolvidas nos ensaios. |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
| Fisher Scientific | BP1422 |
Referências
- Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
- Amon, P., Sanderson, I. What is the microbiome.
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Reimpressões e permissões
