Aqui apresentamos um protocolo para medir o número absoluto de cópias mitocondriais (mt)DNA e os níveis de heteroplasmia de deleção do mtDNA em células únicas.
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Artigo de método
Medindo o Número de Cópias de DNA Mitocondrial de Célula Única e a Heteroplasmia Usando a Reação em Cadeia da Polimerase de Gotículas Digitais
Neste artigo
Resumo
Resumo
O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é uma molécula de DNA intramitocondrial pequena, circular, de fita dupla, que codifica 13 subunidades da cadeia de transporte de elétrons. Ao contrário do genoma nuclear diploide, a maioria das células contém muito mais cópias de mtDNA, variando de menos de 100 a mais de 200.000 cópias, dependendo do tipo de célula. O número de cópias do mtDNA é cada vez mais usado como um biomarcador para uma série de condições degenerativas e doenças relacionadas à idade e, portanto, a medição precisa do número de cópias do mtDNA está se tornando uma ferramenta fundamental em ambientes de pesquisa e diagnóstico. Mutações no mtDNA, muitas vezes ocorrendo como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou deleções, podem existir em todas as cópias do mtDNA dentro da célula (denominada homoplasmia) ou como uma mistura de cópias de mtDNA mutadas e WT (denominadas heteroplasmia). As mutações heteroplasmáticas do mtDNA são uma das principais causas de patologia mitocondrial clínica, seja em doenças raras ou em um número crescente de doenças comuns de início tardio, como a doença de Parkinson. Determinar o nível de heteroplasmia presente nas células é um passo crítico no diagnóstico de doenças mitocondriais raras e em pesquisas destinadas a entender distúrbios comuns de início tardio em que as mitocôndrias podem desempenhar um papel. O número de cópias de mtDNA e a heteroplasmia têm sido tradicionalmente medidos por ensaios quantitativos baseados em (q)PCR ou sequenciamento profundo. No entanto, a recente introdução da tecnologia ddPCR forneceu um método alternativo para medir ambos os parâmetros. Ele oferece várias vantagens em relação aos métodos existentes, incluindo a capacidade de medir o número absoluto de cópias de mtDNA e sensibilidade suficiente para fazer medições precisas de células individuais, mesmo com números de cópia baixos. Apresentamos aqui um protocolo detalhado que descreve a medição do número de cópias de mtDNA em células individuais usando ddPCR, referido como PCR de geração de gotículas doravante, com a opção de medição simultânea de heteroplasmia em células com deleções de mtDNA. A possibilidade de expandir este método para medir a heteroplasmia em células com SNPs de mtDNA também é discutida.
Introdução
O DNA mitocondrial (mt) de mamíferos é um genoma de DNA circular pequeno (aprox. 16,5 Kb) que reside na matriz mitocondrial que codifica 37 genes, compreendendo dois rRNAs, 22 tRNAs e 13 genes codificadores de proteínas1. Ao contrário do genoma nuclear, que contém uma (haploide) ou duas cópias (diploide) de cada gene por célula, o mtDNA está presente em múltiplas cópias nas mitocôndrias de cada célula, variando de dezenas de cópias (por exemplo, espermatócitos maduros) a centenas de milhares de cópias (por exemplo, ovócitos)2,3. Uma consequência dessa natureza multi-cópia é que mutações....
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Protocolo
Todos os experimentos seguiram as diretrizes do ARRIVE e foram aprovados pelo Corpo de Revisão Ética do Bem-Estar Animal da Universidade de Cambridge (AWERB).
NOTA: Todas as etapas de preparação da amostra antes da geração de gotículas devem ser realizadas em uma área de trabalho pré-PCR limpa, idealmente em um gabinete esterilizado por UV, sempre que possível. O protocolo descrito aqui usa equipamentos específicos de PCR de geração de gotículas (consulte Tabela de Materiais) e, embora o método geral deva ser aplicável a outros sistemas, recomenda-se consultar as diretrizes do fabricante sobre as concentrações de primer/son....
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Resultados
Após a geração de gotículas, uma camada clara de gotículas opacas é visível flutuando sobre a fase de óleo em cada poço (Figura 1B). A formação de gotículas pode ser afetada negativamente pela presença de detergentes no lisado de entrada ao realizar experimentos em células individuais. Utilizando o protocolo de lise descrito em 2.1.2., rendimentos de gotículas acima do nível recomendado de 10.000 são rotineiramente alcançados, apesar da presença de uma pequena quantidade residual de TWEEN-20.......
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Discussão
O protocolo descrito aqui é aplicável em uma ampla gama de tipos de células e espécies, além dos discutidos acima, embora a otimização cuidadosa de novos projetos de ensaio seja fundamental para garantir que a precisão e a repetibilidade do método sejam mantidas ao se afastar das combinações de primer/sonda previamente validadas. Ao trabalhar com células individuais, é vital garantir que a coleta de amostras seja realizada com a maior precisão possível (por exemplo, usando parâmetros rigorosos de célula única ao classifi.......
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Divulgações
Sem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Obrigado ao Dr. L Bozhilova por conselhos sobre a análise estatística de dados de PCR de geração de gotículas. Obrigado ao Dr. H Zhang por fornecer os ovócitos usados para gerar dados na Figura 3C e na Figura 4B. Este trabalho foi realizado pela SPB na Unidade de Biologia Mitocondrial do Conselho de Pesquisa Médica (MC_UU_00015/9), Universidade de Cambridge, e financiado por uma bolsa de pesquisa principal da Wellcome Trust realizada pela PFC (212219/Z/18/Z).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução Tween-20 de 50% | Novex | 3005 | |
| Óleo gerador automatizado de gotículas | Bio Rad | 1864110 | Formulação de óleo comercial usada para gerar a emulsão de óleo/gotícula (usada na Etapa 4.1 do Protocolo) |
| Máquina de PCR C1000 com bloco de poço profundo | Bio Rad | 1851197 | equipado com um bloco de aquecimento de poço profundo, usado para lise celular (Etapa 2.1.2 do Protocolo) e ciclagem de PCR (Etapa 5 do Protocolo) |
| Bloco de resfriamento da placa de coleta | Bio Rad | 12002819 | Bloco de resfriamento que mantém as amostras resfriadas durante a geração de gotículas (usado na etapa 4.3 do protocolo) |
| placas ddPCR de 96 poços | Bio Rad | 12001925 | pontas de pipeta de placas de 96 poços projetadas para uso no gerador de gotículas QX200 AutoDG, usadas para preparação de amostras (etapa do protocolo 3.4) e coleta de gotículas (etapa do protocolo 4.3) |
| óleo do leitor de gotículas ddPCR | Bio Rad | 1863004 | Formulação de óleo comercial usada pelo leitor de gotículas (usada na etapa 6.1 do protocolo) |
| Supermix ddPCR para Sondas (sem dUTP) | Supermix comercial Bio Rad | 1863023 | para uso em experimentos de ddPCR utilizando sondas (usado na Etapa 3.3 do Protocolo) |
| Cartuchos geradores de gotículas automatizados DG32 | Bio Rad | 1864108 | Cartuchos microfluídicos usados no gerador de gotículas QX200 AutoDG para gerar a emulsão de óleo/gotículas (usado na Etapa 4.3 do Protocolo) |
| Soro fetal bovino | Gibco | 10270-106 | Soro fetal bovino qualificado |
| Tampas de placa de folha | Bio Rad | 1814040 | Tampas de placa de folha usadas para selar placas de coleta de gotículas após a geração de gotículas (usadas na etapa 4.6 do protocolo) |
| Células HEK 293T | Takara | 632180 | Subclone comercial da linha celular renal embrionária humana transformada, HEK 293, expressando as células HeLa do antígeno SV40 Large-T |
| ECACC | 93021013 | Células de carcinoma epitelóide do colo do útero humano | |
| Glicose alta DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, com L-glutamina e piruvato de sódio |
| Cíbridos humanos | Universidade de Miami | ||
| Fibroblastos embrionários de camundongos | Universidade de Newcastle | Imortalizado a partir de camundongos C57Bl/6 | |
| Compartimento de coleta descartável usado para coletar pontas descartadas no gerador de gotículas QX200 AutoDG (usado na etapa 4.3 do protocolo) | |||
| Pontas de pipeta para sistema AutoDG | Bio Rad | 1864120 | Pontas de pipeta filtradas projetadas para uso no gerador de gotículas QX200 AutoDG (usado na etapa 4.3 do protocolo) |
| Células primárias de fibroblastos dérmicos humanos | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Sondas | IDT | N/A | As sequências exatas de primer/sonda dependerão do ensaio. Os primers e sondas usados neste estudo são fornecidos na Tabela 1 |
| Solução de proteinase K 20 mg/mL | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR selador de placas | Rad | 1814000 | Aplica selos de folha a placas de amostra ddPCR após a geração de gotículas (usado na Etapa 4.6 do Protocolo) |
| Software QX Manager | Bio Rad | 12012172 | Software de configuração e análise do leitor de gotículas (usado nas Etapas 6 e 7 do Protocolo) |
| Gerador de gotículas QX200 AutoDG | Bio Rad | 1864101 | Gerador de gotículas microfluídico automatizado (usado na Etapa 4 do Protocolo) |
| Leitor de gotículas QX200 | Bio Rad | 1864003 | Leitor de gotículas (usado na Etapa 6 do Protocolo) |
| Cristais pré-definidos Trizma pH 8,3 | Sigma | T8943-100G |
Referências
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.
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Reimpressões e permissões
