Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

Brieuc Chauvin; Koyomi Nakazawa; Alexandre Beber; Aurélie Di Cicco; Bassam Hajj; François Iv; Manos Mavrakis; Gijsje H. Koenderink; João T. Cabral; Michaël Trichet; Stéphanie Mangenot; Aurélie Bertin

doi:10.3791/63889

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Artigo de método

Métodos in vitro de baixo para cima para avaliar a organização ultraestrutural, remodelação da membrana e comportamento de sensibilidade da curvatura dos septinos

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DOI:

10.3791/63889

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17 de agosto de 2022

Brieuc Chauvin^*¹ , Koyomi Nakazawa^*¹ , Alexandre Beber¹^,⁷ , Aurélie Di Cicco¹ , Bassam Hajj¹ , François Iv² , Manos Mavrakis² , Gijsje H. Koenderink³ , João T. Cabral⁴ , Michaël Trichet⁵ , Stéphanie Mangenot^*⁶ , Aurélie Bertin^*¹

¹Laboratoire Physico Chimie Curie, Institut Curie, PSL Research University, Sorbonne Université, ²Institut Fresnel, CNRS UMR7249, Aix Marseille Univ, Centrale Marseille, ³Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience Delft, Delft University of Technology, ⁴Department of Chemical Engineering, Imperial College London, ⁵Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de microscopie électronique (IBPS-SME), ⁶Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), Université Paris Cité, ⁷Institute of Biotechnology, Czech Academy of Sciences, BIOCEV

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Septinas são proteínas citoesqueléticos. Eles interagem com membranas lipídicas e podem sentir, mas também gerar curvatura de membrana na escala de míces. Descrevemos neste protocolo metodologias in vitro para analisar deformações de membrana, ligação de septina sensível à curvatura e ultraestrutura de filamento de septina.

Resumo

A remodelagem da membrana ocorre constantemente na membrana plasmática e dentro de organelas celulares. Para dissecar totalmente o papel do ambiente (condições iônicas, composições proteicas e lipídicas, curvatura de membrana) e os diferentes parceiros associados a processos específicos de remodelação de membrana, realizamos abordagens in vitro de baixo para cima. Nos últimos anos, tem havido grande interesse em revelar o papel das proteínas septinas associadas às principais doenças. As septinas são proteínas citoesqueléticas essenciais e onipresentes que interagem com a membrana plasmática. Eles estão implicados na divisão celular, motilidade celular, neurofogênese e espermaogênese, entre outras funções. É, portanto, importante entender como os septins interagem e se organizam nas membranas para induzir posteriormente deformações de membranas e como elas podem ser sensíveis a curvaturas de membrana específicas. Este artigo tem como objetivo decifrar a interação entre a ultraestruturagem de septinas a nível molecular e a remodelação da membrana que ocorre em escala de mícticos. Para isso, os complexos de leveduras e septinas de mamíferos foram recombinantemente expressos e purificados. Uma combinação de ensaios in vitro foi então usada para analisar a auto-montagem de septinas na membrana. Bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), vesículas unilamellar gigantes (GUVs), vesículas unilamellar grandes (LUVs) e substratos ondulados foram usados para estudar a interação entre automontagem de septina, remodelação da membrana e curvatura da membrana.

Introdução

As septinas são proteínas citoesqueletal que formam filamentos que interagem com membranas lipídicas. Os septinos são onipresentes em eucariotes e essenciais para inúmeras funções celulares. Eles foram identificados como os principais reguladores da divisão celular em leveduras e mamíferos ^1,2. Eles estão envolvidos em eventos de remodelação de membrana, ciliogênese³ e espermaiogênese⁴. Dentro das células mamíferas, os septinos também podem interagir com actina e microtúbulos ^5,6,7