Usando Microfluidos e Microscopia de Fluorescência para Estudar a Dinâmica de Montagem de Filamentos e Pacotes de Actin Único

Summary

Apresentamos protocolos para ensaios microfluidos de filamento de actina simples, em combinação com microscopia de fluorescência, que permitem monitorar com precisão filamentos de actina individuais em tempo real, expondo-os sequencialmente a diferentes soluções proteicas.

Abstract

A fim de decifrar os complexos mecanismos moleculares que regulam a montagem e desmontagem de filamentos actin, é um grande trunfo monitorar reações individuais que vivem em condições bem controladas. Para isso, experimentos de filamento único ao vivo surgiram nos últimos 20 anos, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF) e forneceram uma série de resultados-chave. Em 2011, a fim de ampliar ainda mais as possibilidades desses experimentos e evitar artefatos problemáticos recorrentes, introduzimos microfluidos simples nesses ensaios. Este estudo detalha nosso protocolo básico, onde filamentos de actina individuais são ancorados por uma extremidade à superfície passivated de deslizamento de cobertura, alinhados com o fluxo, e podem ser sucessivamente expostos a diferentes soluções proteicas. Também apresentamos os protocolos para aplicações específicas e explicamos como forças mecânicas controladas podem ser aplicadas, graças ao arrasto viscoso da solução de fluxo. Destacamos as ressalvas técnicas desses experimentos e apresentamos brevemente possíveis desenvolvimentos com base nessa técnica. Esses protocolos e explicações, juntamente com a disponibilidade atual de equipamentos de microfluidos fáceis de usar, devem permitir que não especialistas implementem este ensaio em seus laboratórios.

Introduction

A montagem e desmontagem de filamentos de actin e redes de filamentos de actin são controladas por diversas reações bioquímicas e dependem do contexto mecânico. Para obter uma visão desses mecanismos complexos, é inestimável ser capaz de observar reações individuais em filamentos individuais (em números suficientemente grandes). Ao longo das últimas décadas, a observação de filamentos dinâmicos de actina em tempo real, principalmente usando microscopia total de fluorescência interna (TIRF), emergiu como uma técnica-chave e forneceu uma lista impressionante de resultados que não poderiam ter sido obtidos com ensaios bioquímicos de solução em massa¹

Protocol

1. Preparação da câmara microfluídica

1. Selecione um molde mestre SU-8 com vários padrões de câmara. As câmaras típicas são em forma de cruz com três entradas e uma tomada, 20 μm de altura e 800 μm de largura (Figura 1). Tais moldes mestres podem ser adquiridos de empresas externas ou feitos em laboratórios acadêmicos (por exemplo, Gicquel, Y. et ^al.5).
2. Coloque fita adesiva ao redor da borda do molde.
   1. Coloque ~50 cm de comprimento, 19 mm de largura, fita de escritório transparente padrão (ver Tabela de Materiais) em um banco, lado pegajoso para cima. Coloq....

Results

Para todos os experimentos descritos acima, filamentos de actina fluorescentemente rotulados devem ser claramente visíveis, com bom contraste, indicativo de baixa fluorescência de fundo da superfície (Figura 4, ver Arquivo Suplementar 1 para solução de problemas comuns). Os filamentos actinados também não devem ficar na superfície: quando a taxa de fluxo dominante é baixa, as flutuações laterais dos filamentos actina devem ser perceptíveis ao observá-las ao vivo e permitir q.......

Discussion

Comparado aos métodos padrão de filamento único, onde filamentos de actina são ancorados na superfície por vários pontos ao longo de seu comprimento ou mantidos perto dele por um agente de aglomeração como metilcelulose, os microfluidos oferecem uma série de vantagens. Como as interações com a superfície são mínimas, as pausas artificiais que essas interações podem induzir durante o alongamento e a despomerização são evitadas. Os filamentos são alinhados pelo fluxo, paralelos uns aos outros, facilitando seu monitoramento.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Caseína	Merck	C6905	Usado a 8 mg/mL
Punção de biópsia (com êmbolo)	Ted Pella	15115-2	ID 0,75 mm, OD 1,07 mm
Biotina-BSA	Merck	A8549	Usado a 1 mg/mL
BSA	Merck	A8022	Usado a 50 mg/mL
Coverslip Mini-Rack Suporte de teflon	Invitrogen	C14784	para 8 lamínulas
Lamínulas 22x40mm Espessura #1.5	Menzel Glä ser	631-1370
DABCO	Merck	D27802	componente em f-buffer
DTT	Euromedex	EU0006-D	componente em f-buffer
Éster NHS Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000	Fluoróforo para marcação de actina em Lys328.
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotina	Thermo Scientific	21338	Para biotinilato de actina em Lys328
Hellmanex III	Hellma	9-307-011-4-507	Detergente para limpeza de vidros
ImageJ	NIH	N / A	software de código aberto
Laboport	KNF	811kn.18	bomba de vácuo (vácuo final: 240 mbar)
Fita mágica invisível	Scotch	7100024666	fita de escritório transparente padrão
Micrewtube	Simport	T341-6T	2 mL tubos de reservatório microfluídico
Dispositivo microfluídico Parte 1: Unidade de fluxo S	Fluigente FLUIGENT	FLU-S-D-PCKB	Medidor de vazão
Dispositivo microfluídico Parte 2: Fluiwell-4C-2 mL	Fluigent	14002001PCK	Suporte de reservatório
Dispositivo microfluídico Parte 3: MFCS-EZ	Fluigent	EZ-11000001 EZ-00345001 Controlador de	pressão
modelo 42 - UVO-Cleaner	Jelight Inc.	42-220	Limpador ultravioleta
N6-(6-Aminohexil)-ATP-ATTO-488	Jena Bioscience	NU-805-488	ATP-ATTO usado para rotular a actina
neutravidina	Thermo Scientific	31000
PLL-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)	Use a 1 mg/mL em PBS.
Polidimetilsiloxano (PDMS) Sylgard 184 Elastômero de Silício	Dow Corning	1673921	Contém base PDMS e agente de cura
Tubulação de polieteretercetona (PEEK)	Merck	Z226661	" Azul" : I.D. = 0,25 mm
Pistola de sopro de segurança	Coilhose Pneumatics	700-S	ar filtrado
Tubo de silício	VWR	228-0701P	conecta PEEK ao acoplador
Acoplador de cateter em aço inoxidável	Prime Bioscience	SC22/15	Inserido nas entradas e saídas do PDMS para conectar ao tubo PEEK
Filme termoplástico	Sigma Aldrich	PM996	"parafilme" padrão
Etanol ultrapuro	VWR	64-17-5
Banho de limpeza ultrassónico	VWR	USC200TH	Para acomodar copos de 1 L
Exsicador a vácuo	SP Bel-Art	F42022-0000	para desgaseificar o PDMS ou soluções