Microfresagem de Controle Numérico Computacional de um Dispositivo Acrílico Microfluídico com uma Restrição Escalonada para Imunoensaios Magnéticos Baseados em Nanoppartículas

Summary

A microfluídica é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de testes de diagnóstico. No entanto, equipamentos e materiais caros, bem como técnicas de fabricação e manuseio trabalhosas, são frequentemente necessários. Aqui, detalhamos o protocolo de fabricação de um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios magnéticos baseados em micro e nanopartículas em um ambiente de baixo custo e simples de usar.

Abstract

Os sistemas microfluídicos melhoraram muito as técnicas de imunoensaio. No entanto, muitas técnicas de microfabricação exigem equipamentos especializados, caros ou complicados, tornando a fabricação cara e incompatível com a produção em massa, que é uma das pré-condições mais importantes para que os testes no local de atendimento (POCT) sejam adotados em ambientes com poucos recursos. Este trabalho descreve o processo de fabricação de um dispositivo acrílico (polimetilmetacrilato, PMMA) para teste de imunoensaio enzimático conjugado com nanopartículas utilizando a técnica de microfresagem de controle numérico computadorizado (CNC). O funcionamento do dispositivo microfluídico é demonstrado pela realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo integra uma restrição física escalonada de apenas 5 μm de altura, usada para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética colocando um ímã externo. Desta forma, a força magnética sobre o imunosuporte de nanopartículas conjugadas é suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto de fluxo. Este dispositivo microfluídico é particularmente adequado para produção em massa de baixo custo sem a perda de precisão para o desempenho do imunoensaio.

Introduction

Nos últimos anos, a microfluídica tem desempenhado um papel importante nas técnicas de imunoensaio¹. A tecnologia de miniaturização tem muitas vantagens notáveis em comparação com os imunoensaios tradicionais, como consumo reduzido de amostras e reagentes, tempos de incubação mais curtos, troca eficiente de soluções e maior integração e automação².

Além disso, sistemas microfluídicos em imunoensaios, em associação com nanopartículas magnéticas como imunosuporte, reduzem consideravelmente os tempos de incubação, alcançando alta sensibilidade de detecção devido ao aumento da relação superfície-volume³. O movimento browniano das partículas melhora a cinética de reação durante a formação do complexo antígeno-anticorpo ^4,5. Além disso, as propriedades magnéticas das nanopartículas proporcionam a versatilidade para serem integradas em diferentes configurações de dispositivos microfluídicos, tornando-as um candidato ideal para sinalização e captura de moléculas em sistemas de biossensoriamento miniaturizados on-chip⁵. No entanto, as forças magnéticas são significativamente mais fracas do que as forças de arrasto na escala nanométrica devido à alta relação superfície-volume⁶. Portanto, a captura de nanopartículas para etapas cruciais de imunoensaio, como lavagem e detecção, pode ser um desafio, e um ímã convencional é insuficiente⁴.

Uma maneira eficiente de manipular as nanopartículas é o uso de uma armadilha magnética microfluídica formada por micropartículas de ferro, que são embaladas em uma estrutura microfluídica³. Portanto, quando um ímã externo se aproxima, uma interação complexa é criada dentro do meio poroso magnetizado entre as forças magnéticas e de fluxo. A força magnética que atua sobre as nanopartículas é forte o suficiente para capturá-las e resistir ao arrasto do fluxo ^3,4,7. Essa abordagem requer técnicas de microfabricação que atinjam resoluções da ordem de alguns micrômetros para gerar estruturas micrométricas que retenham as micropartículas.

As técnicas atuais de microfabricação permitem a fabricação de estruturas de alta resolução de alguns mícrons a centenas de nanômetros⁸. No entanto, muitas dessas técnicas exigem equipamentos especializados, caros ou complicados. Uma das principais dificuldades é a exigência de uma sala limpa para fabricação de moldes, que continua dispendiosa e ^{demorada 8,9}. Recentemente, os engenheiros microfluídicos superaram essa desvantagem desenvolvendo uma variedade de métodos alternativos de fabricação, com várias vantagens, como custos reduzidos, tempos de resposta mais rápidos, materiais e ferramentas mais baratos e maior funcionalidade⁸. Desta forma, o desenvolvimento de novas técnicas de microfabricação trouxe métodos de baixo custo, não limpos, que alcançam resoluções tão baixas quanto 10 μm⁸. A padronização pode ser usada diretamente em um substrato sem gerar um padrão de moldagem caro, evitando assim um processo demorado. Os métodos de fabricação direta incluem fresamento CNC, ablação a laser e litografia direta⁸. Todos esses métodos são adequados para a produção de canais de alta relação de aspecto em uma ampla gama de materiais, independentemente de sua dureza⁹, possibilitando novas e vantajosas geometrias, comportamentos físicos e qualidades em dispositivos microfluídicos⁸.

A microfresagem CNC cria estruturas em microescala utilizando ferramentas de corte que removem material a granel de um substrato e é um método de fabricação eficaz para dispositivos microfluídicos^10,11. A técnica de microfresagem pode ser útil em aplicações microfluídicas para criar microcanais e recursos diretamente na superfície de trabalho, oferecendo uma vantagem fundamental: uma peça de trabalho pode ser fabricada em um curto espaço de tempo (menos de 30 min), reduzindo significativamente o tempo de resposta desde o projeto até o protótipo¹². Além disso, a ampla disponibilidade de acessórios de corte de diferentes materiais, tamanhos e formas torna as fresadoras CNC uma ferramenta adequada que permitiu a fabricação de diferentes características em muitos tipos de materiais descartáveis de baixo custo¹³.

Dentre todos os materiais comumente utilizados na micromoagem, os termoplásticos continuam sendo uma escolha líder devido às suas muitas propriedades favoráveis e compatibilidade com aplicações biológicas^10,14. Os termoplásticos são um substrato atraente para sistemas microfluídicos devido às suas vantagens significativas para o desenvolvimento de sistemas analíticos descartáveis de baixo custo⁹. Além disso, esses materiais são altamente passíveis de processos de fabricação de alto volume, tornando-os adequados para comercialização e produção em massa. Por essas razões, termoplásticos como o PMMA têm sido considerados materiais confiáveis e robustos desde os primórdios da microfluídica¹⁰. Diferentes protocolos têm sido descritos para fabricar canais fechados em termoplásticos, como a ligação por solvente¹⁵, a ligação por calor¹⁶ e a ligação ultravioleta (UV)/ozônio para tratamento superficial¹⁷.

Em muitos casos, a resolução de posicionamento alcançada com microfresadoras convencionais não é suficiente para algumas aplicações microfluídicas que exigem estruturas menores que 10 μm. A microfresagem de alta qualidade tem resolução suficiente. Infelizmente, devido aos altos preços, seu uso é limitado a um punhado de usuários¹². Anteriormente, nosso grupo de pesquisa relatou a fabricação e manipulação de uma ferramenta de baixo custo que permite usinagem de estruturas inferiores a 10 μm, superando a resolução de fresadoras convencionais¹². O acessório é uma plataforma fabricada por impressão 3D com eletrônica simples, contendo três atuadores piezoelétricos. A superfície contém juntas em forma de dobradiça que permitem que ela seja levantada quando os elementos piezoelétricos agem simultaneamente. O deslocamento do eixo Z pode ser controlado com uma resolução de 500 nm e uma precisão de ±1,5 μm¹².

Este trabalho apresenta as etapas do processo de fabricação de um dispositivo acrílico (PMMA) através de uma técnica de microfresagem. O projeto do chip consiste em um canal principal de 200 μm de largura e 200 μm de altura e um canal lateral com as mesmas dimensões para purgar o fluxo dos reagentes. Na região central, o canal é interrompido por uma restrição física de apenas 5 μm de altura, fabricada com a plataforma piezoelétrica impressa em 3D feita por esse grupo¹², para capturar micropartículas magnéticas que compõem uma armadilha magnética para nanopartículas através da colocação de um ímã externo. Mostramos o funcionamento do dispositivo microfluídico através da realização de um imunoensaio para detectar um anticorpo comercial usando lisozima como antígeno modelo conjugado a nanopartículas magnéticas de 100 nm. Este dispositivo combina diferentes características que o tornam único⁴: o uso de nanopartículas magnéticas como suporte imunológico reduz o tempo total de teste de horas para minutos; a utilização de uma enzima fluorogénica para detecção permite limites de detecção comparáveis aos dos ensaios imunoenzimáticos padrão (ELISAs); e o uso de um termoplástico como material de fabricação o torna compatível com a produção em massa, o que não foi o caso das armadilhas magnéticas³ das nanopartículas microfluídicas anteriores, e o torna um excelente candidato para o desenvolvimento do POCT.

Protocol

1. Micromoagem

1. Moagem de superfície
   1. Ligue a microfresadora e o controlador piezoelétrico. Inicie seu respectivo software de controle¹².
   2. Selecione os bits finais do moinho necessários (diâmetros de 200 μm e 800 μm). Colocá-los no compartimento apropriado da fresadora (Figura 1).
   3. Corte retângulos de 9 mm x 25 mm de PMMA de 1,3 mm de espessura com o bit final do moinho de 800 μm. Anexe cuidadosamente um desses retângulos com fita adesiva dupla face à plataforma piezoelétrica (Figura 2).
      NOTA: Certifique-se de colocar sempre o retângulo acrílico na mesma posição para que um dos cantos coincida com as coordenadas de origem nos eixos x e y para usinagem.
   4. Conecte e coloque o sensor z na superfície do retângulo PMMA. Selecione o pino de detecção e mova-o sobre a superfície do sensor. Abaixe o pino manualmente sem entrar em contato com o sensor. Ative o modo de detecção Z0 (Figura 3).
   5. Selecione o bit final do moinho de 200 μm e mova-o para a origem x, y. Remova o z-sensor. Abaixe a mordida com cuidado sem entrar em contato com a superfície acrílica.
   6. Gire o bit final do moinho de 200 μm a 14.500 rpm. Abaixe lentamente até a coordenada de origem no eixo z (z = 0). Redefina o eixo z 30 μm abaixo da origem. Defina essa coordenada como a nova origem z.
      Observação : nunca abaixe o bit se ele não estiver girando. Caso contrário, corre o risco de quebrar.
   7. Clique no botão Cortar no software da microfresadora para ativar o painel Cortar . Clique no botão Adicionar e selecione o arquivo de .txt (Arquivo de Codificação Suplementar 1) com um código criado anteriormente para a moagem da superfície acrílica. Clique no botão Saída para iniciar o processo.
   8. Traga o bit final do moinho para a coordenada onde a restrição será usinada. Evite que o bit do moinho final se levante da superfície do solo assim que essa coordenada for alcançada clicando no botão Pausar . Caso contrário, reposicione manualmente o bit do moinho final para essa coordenada (Figura 4A).
2. Moagem da restrição de 5 μm
   1. Defina a velocidade de rotação do bit do moinho final para 11.000 rpm. Elevar a plataforma 6,5 μm com a interface da plataforma piezoelétrica (Figura suplementar S1). Mova o bit do moinho final ao longo do eixo y em 500 μm. Retorne a plataforma piezoelétrica ao seu valor inicial no eixo z com a interface de controle.
3. Fresagem de microcanais
   1. Abra o arquivo de design criado anteriormente no software de design (Arquivo de Design Suplementar 1). Clique no botão Imprimir . Acesse o menu Propriedades e clique na janela de cores correspondente à camada que contém o desenho a ser usinado. Defina os parâmetros de fabricação no painel Ferramenta conforme especificado na Figura suplementar S2.
   2. Desative camadas indesejadas selecionando a opção Nenhuma no menu suspenso Ferramentas .
4. Moagem de furos
   1. Mude para o bit final do moinho de 800 μm. Ative a camada de design dos orifícios de 1,2 mm de diâmetro clicando na janela de cores correspondente.
   2. Repita a etapa 1.3.2., mas, neste caso, defina os parâmetros de fabricação correspondentes, conforme descrito na Figura Suplementar S3A para os furos.
      NOTA: A profundidade dos orifícios usinados é metade da espessura acrílica.
   3. Máquina dois orifícios adicionais em cantos contralaterais do retângulo para o alinhamento do acrílico de forma invertida em uma nova plataforma (Figura 4B). Retire o retângulo acrílico da plataforma piezoelétrica. Vire o acrílico e cole-o com fita adesiva de dupla face sobre o adaptador com os pilares usinados (Figura 4C,D).
   4. Abra o arquivo com o design dos orifícios para a face oposta do software de design (Arquivo de Design Suplementar 2). Defina os parâmetros de fabricação correspondentes, conforme descrito na Figura Suplementar S3B. Moer a metade restante dos orifícios de entrada e saída do reagente com um diâmetro de 1,5 mm e uma profundidade de 0,7 mm (Figura suplementar S3C).

Figura 1: Colocação do bit final do fresamento. (A) Os bits do fresamento final de 200 μm e 800 μm são colocados e fixados através de um parafuso ao suporte de aço. (B) Cada bit de fresagem final é colocado no compartimento específico da microfresadora para seleção automática. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Plataforma piezoelétrica. A plataforma é fabricada por impressão 3D e consiste em duas bases hexagonais unidas por dobradiças que permitem um deslocamento fino no eixo z controlado por três atuadores piezoelétricos. Um adaptador acrílico também é observado, no qual o retângulo PMMA é anexado e que permite a configuração do canto de alinhamento das coordenadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Calibração do eixo Z. As etapas da calibração do eixo z são detalhadas. (A) O sensor z inclui um cabo que se conecta à microfresadora. (B) O sensor é colocado diretamente na superfície a ser usinada. (C) O pino de detecção consiste em uma barra de metal colocada em um compartimento especial ao lado de bits de fresagem finais. (D) Quando ambos os acessórios entram em contato, a microfresadora calcula automaticamente a coordenada de origem no eixo z. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Superfície acrílica retificada . (A) A broca final do moinho de 200 μm de diâmetro varre toda a superfície do retângulo acrílico, removendo uma camada de aproximadamente 30 μm de altura. (B) A imagem mostra as diferentes estruturas fresadas na face do acrílico previamente retificado. Canais e orifícios para entrada e saída de reagentes são observados. A restrição de 5 μm não pode ser vista a olho nu. (C) Superfície microfresada com orifícios de alinhamento e adaptador com pilares de alinhamento em cantos opostos. (D) O acrílico é alinhado de cabeça para baixo no adaptador com pilares, nos quais os orifícios de alinhamento se encaixam. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Vedação do canal

1. Limpeza acrílica
   1. Remova o retângulo acrílico da plataforma do adaptador pilar. Pegue outro retângulo acrílico não usinado. Lave ambas as folhas de acrílico com álcool isopropílico (IPA) e enxágue com água destilada. Use luvas e evite o contato com IPA.
   2. Mergulhe o acrílico em um banho ultra-sônico por 10 min (Figura 5A,B).
2. Exposição gasosa ao clorofórmio
   1. Seque ambas as folhas de acrílico perfeitamente. Cole-os no interior de uma tampa de placa de Petri de vidro com fita adesiva de dupla face. Certifique-se de colocar o lado do canal usinado exposto (Figura 5C). Use luvas e evite tocar diretamente na superfície acrílica.
   2. Coloque a base da placa de Petri de vidro dentro de uma placa de Petri de vidro maior (Figura 5D). Despeje 1 mL de clorofórmio na base da placa de Petri. Coloque rapidamente a tampa com as folhas de acrílico presas ao lado interno.
   3. Adicione imediatamente água destilada à base da placa de Petri maior até o nível da tampa da placa de Petri. Permitir a exposição do acrílico ao gás clorofórmio por 1 min (Figura 5E).
      NOTA: Considere que um tempo de exposição mais longo ao clorofórmio atacará a superfície acrílica, e a restrição de 5 μm derreterá, modificando sua altura ou desaparecendo completamente.
   4. Incline a placa de Petri para quebrar o selo de água criado. Remova imediatamente o acrílico do clorofórmio, descobrindo a placa de Petri. Tenha cuidado para não derramar a água.
      CUIDADO: Faça este processo no exaustor e use luvas, pois o clorofórmio é altamente tóxico.
3. Colagem por prensagem e aquecimento
   1. Descasque ambas as placas de acrílico da fita dupla face.
   2. Alinhe ambos os acrílicos com os lados que foram expostos ao clorofórmio gasoso face a face, formando um sanduíche. Colocar os acrílicos na prensa a 18 kgf/cm² e a uma temperatura de 90 °C (Figura 5F,G).
      NOTA: Recomenda-se colocar o acrílico alinhado longitudinalmente e alterar seu alinhamento após 2 min para uma melhor vedação. Se, após esse tempo, o selo for insuficiente, coloque-o de volta na prensa por intervalos não superiores a 1 min. Usando o estereoscópio, verifique o status dos canais e a restrição. Considere que, em caso de exceder o tempo de preparo, existe o risco de eliminar a restrição.
4. Acessório de mangueira
   1. Corte 2-3 cm de comprimento de mangueira. Faça um corte completamente reto. Fixar cada mangueira aos orifícios do dispositivo com adesivo líquido de secagem instantânea (Figura 6A). Evite que o adesivo entre no chip.

Figura 5: Processo de selagem do dispositivo. (A) Cada uma das folhas de acrílico é colocada em um saco re-selável com água destilada e imersa no banho ultra-sônico. (B) A imagem à esquerda mostra os canais logo após a fabricação, e a imagem à direita mostra o mesmo dispositivo após a lavagem com IPA e o banho ultra-sônico, que remove todas as impurezas e resíduos acrílicos do microcanal. As bordas da restrição que interrompe o canal central de 200 μm são observadas, o que confirma o processo de fresagem bem-sucedido. Barras de escala = 500 μm. (C) Ambos os acrílicos são secos e aderidos à plataforma de vidro na tampa. (D) A base da placa de Petri é colocada dentro de outro prato de maior diâmetro. (E) Ao fechar a placa de Petri, o selo de água impede que o clorofórmio gasoso escape. (F) Descrição dos elementos da alavanca com um peso de 5 kg. (G) Imagem da alavanca aberta, mostrando em vermelho a área onde o acrílico é colocado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação do dispositivo

1. Encha os canais com água destilada usando uma seringa. Certifique-se de que não há vazamentos ou resistência ao fluxo. Mergulhe o dispositivo em um banho ultra-sônico por 10 minutos para remover qualquer material acrílico, adesivo ou indesejado restante dentro dos canais.
2. Esvazie a água dentro dos canais do dispositivo. Utilizar uma seringa para introduzir uma solução de bloqueio preparada com albumina sérica bovina (BSA) a 5% (p/v) diluída em solução salina tamponada com Tris (TBS) e previamente filtrada através de um filtro de seringa de polietersulfona (PES) de 0,2 μm.
3. Preparar uma suspensão de micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro em BSA a 5%.
   NOTA: As micropartículas são previamente funcionalizadas com uma camada de sílica-polietilenoglicol (PEG) que confere resistência à absorção de proteínas⁴.
4. Incubar o cavaco e a suspensão de micropartículas com a solução de bloqueio durante, pelo menos, 1 h à temperatura ambiente. Se possível, permitir o bloqueio durante a noite a 4 °C.

4. Formação de armadilhas de micropartículas

1. Insira as micropartículas no chip com uma agulha de seringa através da mangueira de saída do canal lateral. Coloque o chip verticalmente e permita que as micropartículas fluam sob o efeito da gravidade através do canal lateral. Gire o chip 180° em duas etapas de 90° e permita que as micropartículas atinjam e compactem na restrição de 5 μm.
2. Remova o excesso de micropartículas por gravidade girando 45° em direção ao canal lateral.
3. Mantenha o dispositivo ereto para evitar desfazer a armadilha de micropartículas. Veja a Figura 6B para um resumo do processo de formação de armadilhas de micropartículas.

5. Imunoensaio

1. Preparação de nanopartículas
   1. Tomar 2 μL da suspensão de nanopartículas de 100 nm previamente conjugadas com lisozima (modelo de antígeno). Adicionar a um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml com 100 μL de solução bloqueadora. Incubar durante a noite a 4 °C.
   2. Adicione 150 μL de tampão de lavagem (1x TBS, 0,05% de interpolação 20).
   3. Coloque o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL em um separador magnético. Manter por 15 min para permitir a separação das nanopartículas (Figura Suplementar S4).
      NOTA: O volume mínimo para o separador magnético é de 200 μL. Evite usar um volume menor.
   4. Remova o líquido do tubo com uma micropipeta. Evite o contato com a parede do tubo onde o pellet de nanopartículas foi formado.
   5. Adicionar 250 μL de tampão de lavagem fresco. Mantenha o tubo sob agitação por 15 min.
   6. Repita as etapas 5.1.3.-5.1.5. 2x mais, agitando apenas por 5 min.
   7. Adicione a concentração desejada do anticorpo anti-lisozima primário (ver Tabela de Materiais). Ajustar para um volume final de 100 μL em diluente de anticorpos (1x TBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20).
   8. Incubar durante 15 min a 37 °C. Continue agitando por mais 15 minutos à temperatura ambiente.
   9. Repita os passos de lavagem 5.1.2.-5.1.6.
   10. Adicionar 100 μL de diluente de anticorpos. Adicionar o anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rábano (HRP-AbII) (ver Tabela de Materiais) a uma diluição de 1:500.
   11. Repita os passos de lavagem 5.1.2.-5.1.6.
   12. Manter as nanopartículas num volume final de 50 μL de diluente de anticorpos.

6. Montagem experimental

1. Encha as duas seringas de vidro de 100 μL com água, ligue uma mangueira de 6,5 cm de comprimento a cada seringa, insira um pino de metal na extremidade da mangueira e coloque ambas as seringas na bomba de seringa controlada por computador.
2. Sele todas as mangueiras do dispositivo acrílico com calor.
3. Corte a mangueira de entrada e mantenha apenas alguns milímetros. Encha a agulha de dosagem com tampão de lavagem e insira-a na mangueira cortada. Deixe a solução pingar antes de conectar a agulha ao dispositivo para impedir o acesso de ar ao dispositivo.
4. Corte a mangueira de saída do canal lateral. Ligue à bomba da seringa. Em seguida, faça o mesmo procedimento para a mangueira de saída do canal principal.
   Observação : é fundamental para executar as etapas 6.3.-6.4. a fim de evitar a desembalagem da armadilha de micropartículas. Se possível, verifique o estado da armadilha durante estas etapas com a ajuda de uma lupa.
5. Coloque uma lâmina de vidro no palco do microscópio. Prenda o ímã à lâmina com fita dupla face e coloque um pequeno pedaço de fita adesiva de cada lado para fixar as bordas do chip ao vidro.
6. Defina uma vazão de 50 μL/h através das guias Vazão e Unidades no controlador da bomba de seringa. Selecione o modo de retirada e clique no botão Iniciar para ativar o fluxo do buffer de lavagem.
7. Cuidadosamente, aproxime o dispositivo em direção ao slide com o ímã de maneira horizontal para que a área do chip que contém a armadilha entre em contato com o ímã.
8. Cole as bordas do dispositivo no vidro com fita adesiva dupla face para evitar o movimento. Evite obstruir o caminho óptico para microscopia (Figura 6C).

Figura 6: Configuração final do dispositivo . (A) Dispositivo acrílico com as mangueiras conectadas às entradas e saídas correspondentes. A escala mostra as dimensões do dispositivo em centímetros. (B) Protocolo para a formação da armadilha de micropartículas. As micropartículas fluem através do canal por gravidade quando o dispositivo é colocado em uma posição vertical. As micropartículas estão concentradas na restrição de 5 μm. O excesso de micropartículas é facilmente removido girando o chip através do canal lateral. O chip é mantido vertical para preservar a armadilha antes do imunoensaio. (C) Dispositivo microfluídico montado em uma lâmina de vidro contendo o ímã, no estágio do microscópio de fluorescência invertida. A agulha de dosagem através da qual os reagentes são adicionados é observada, bem como as mangueiras de saída que se conectam a uma bomba de seringa. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Imunodetecção

1. Mantenha o tampão de lavagem fluindo por 10 minutos a 50 μL/h para remover o excesso de BSA.
2. Remova o tampão de lavagem restante da agulha distribuidora com uma micropipeta. Adicionar 50 μL da suspensão de nanopartículas.
3. Fluir a suspensão de nanopartículas durante 7 min a um caudal de 100 μL/h. Posteriormente, altere a vazão para 50 μL/h e flua por mais 15 min.
4. Troque a agulha de dosagem. Fluidar o tampão de lavagem durante 10 min a 50 μL/h. Prepare o substrato fluorogênico de acordo com as especificações do fabricante durante a etapa de lavagem.
5. Remova o tampão de lavagem restante da agulha distribuidora com uma micropipeta. Adicionar 100 μL do substrato fluorogénico (ver Tabela de Materiais). Fluidifique o substrato fluorogênico por 6 min a 50 μL/h.
6. Defina os parâmetros de medição da vazão (1 μL/h, 3 μL/h, 5 μL/h e 10 μL/h ) e do tempo (6 min) nas guias correspondentes Vazão e Definir temporizador da interface que controlam a bomba de seringa. Certifique-se de selecionar Modo de retirada para cada uma das medições a serem realizadas.
7. Defina uma guia de vazão adicional em 50 μL/h e defina o temporizador em 3 minutos para a etapa de lavagem.
8. Ligue a fluorescência do microscópio 15 s antes de o substrato a 50 μL/h parar. Inicie a captura de imagem com o software da câmera do microscópio 10 s antes que o substrato pare com um tempo de exposição de 1.000 milissegundos. Realize imagens por 6 min a 1 quadro/s (FPS).
9. Clique no botão Iniciar do parâmetro de vazão desejado imediatamente após a vazão de lavagem do substrato em paradas de 50 μL/h. Clique no botão Iniciar do fluxo de lavagem (50 μL/h) imediatamente após a parada do fluxo de medição selecionado.
10. Pare a captura da imagem e desligue a fluorescência do microscópio para evitar o fotobranqueamento do substrato.
11. Repita as etapas 7.8.-7.10. para cada caudal de medição utilizado.

Results

Foi possível estabelecer um protocolo de fabricação altamente reprodutível que melhora a resolução da técnica de micromoagem convencional. Usando este protocolo, a fabricação de um canal tão pequeno quanto 5 μm de altura que opera como uma restrição escalonada em um canal de 200 μm de altura é alcançada. O design simples da restrição escalonada captura micropartículas de ferro de 7,5 μm de diâmetro que, quando compactadas no microcanal, permitem a criação de uma armadilha magnética quando um ímã externo se aproxima do di...

Discussion

Um dispositivo microfluídico acrílico para imunoensaios utilizando nanopartículas como imunosuporte foi fabricado utilizando uma técnica de microfresamento. O método de fabricação direta no substrato tem a vantagem de evitar o uso de um molde mestre e o tempo e os custos que isso implica. No entanto, é limitado à prototipagem rápida e fabricação de dispositivos de alto volume.

Aqui, utilizou-se uma plataforma piezoelétrica acessória previamente relatada para a fresadora¹²

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.008 Fresa de Topo	KYOCERA SGS	2204	2FL 0.008x1/8x0.12x1-1/12
0.032 Fresa	de Topo KYOCERA SGS	2228	2FL 0.032x1/8x0.48x1-1/12
Micropartículas de Carbonil-ferro	Sigma-Aldrich	44890	7 μ m
Clorofórmio	Fermont	6201	Perigo para a saúde: Moderado Inflamabilidade: Nenhum Reatividade: Nenhum Risco de contato: Moderado
Câmera CMOS Moment	Teledyne Photometrics		Sensor Technology: CMOS Eficiência Quântica: 73% Tamanho do Pixel: 4.5 µ m x 4.5 µ m Interfaces Suportadas: USB 3.2 Gen 2
Dr Engrave Software	Roland DGA Corporation		Software de gravação para projetar e criar o caminho de gravação na superfície
Capuz	de extração Desconhecido	Desconhecido
Tubo de plástico flexível	Tygon		AAD04103 ID = 0.020, OD = 0.060
Microsope de fluorescência	ZEISS	Axio Vert.A1
Agulha de Dispensação de Alta Precisão	Loctite	98612
Aplicação de controlador piezoelétrico caseiro	LabView		Consulte a referência 12 para obter mais detalhes.
Adesivo instantâneo Loctite 495	Henkel	49503	Aplique com ponta de micropipeta ou agulha dispensadora
Rack de Separação MagJET	termocientífico		12 x 1.5 mL
Prensa mecânica	Fresadora
	Roland	MDX-50
Plataforma piezoelétrica	em casa		Veja a referência 12
Polimetilmetacrilato - Folha - PMMA, Acrílico	Goodfellow	ME303018/1	Espessura: 1,3 mm, Transparência: PVC claro/transparenteSoftware
de teste	Teledyne Photometrics	Versão 3.10.107	Software de aquisição de imagens
Microscópio estéreo	Nikon	SMZ 7457
SuperMag Carboxyl Beads	Ocean NanoTech	KSC0100	100 nm
Bomba de seringa	kd Scientific	KDS200	Pode conter até duas seringas
Banho Utrasonic	Branson	2800
VPanel	Windows OS	Versão 1.0.3.0	Software para controlar a fresadora microfresadora