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Artigo de método

Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente na aorta torácica de camundongos utilizando a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume

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DOI:

10.3791/63918

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12 de agosto de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Graduate Studies, Midwestern University, 2Department of Child Health, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona, Phoenix

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve os conceitos e a aplicação técnica da técnica do miógrafo tensométrico utilizando um sistema de miógrafo multicâmara na avaliação experimental ex vivo da função endotelial da aorta em camundongos.

Resumo

A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume é uma técnica comumente utilizada para avaliar a contratilidade vascular de vasos sanguíneos pequenos e grandes em animais de laboratório e pequenas artérias isoladas do tecido humano. A técnica permite que os pesquisadores mantenham vasos sanguíneos isolados em um ambiente rigidamente controlado e padronizado (quase fisiológico), com a opção de se ajustar a vários fatores ambientais, enquanto desafiam os vasos isolados com diferentes agentes farmacológicos que podem induzir vasoconstrição ou vasodilatação. A câmara miográfica também fornece uma plataforma para medir a reatividade vascular em resposta a vários hormônios, inibidores e agonistas que podem afetar a função do músculo liso e das camadas endoteliais separadamente ou simultaneamente. A parede dos vasos sanguíneos é uma estrutura complexa que consiste em três camadas diferentes: a íntima (camada endotelial), a média (músculo liso e fibras de elastina) e a adventícia (colágeno e outros tecidos conjuntivos). Para obter uma compreensão clara das propriedades funcionais de cada camada, é fundamental ter acesso a uma plataforma e sistema experimental que permita uma abordagem combinatória para estudar todas as três camadas simultaneamente. Tal abordagem exige acesso a uma condição semifisiológica que imitaria o ambiente in vivo em um ambiente ex vivo. A miografia tensométrica de câmara de pequeno volume forneceu um ambiente ideal para avaliar o impacto de pistas ambientais, variáveis experimentais ou agonistas farmacológicos e antagonistas nas propriedades vasculares. Por muitos anos, os cientistas usaram a técnica do miógrafo tensométrico para medir a função endotelial e a contratilidade do músculo liso em resposta a diferentes agentes. Neste relato, um sistema de miógrafo tensométrico de câmara de pequeno volume é usado para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos. Este relatório se concentra em como a miografia tensométrica de câmara de pequeno volume pode ser usada para avaliar a integridade funcional do endotélio em pequenos segmentos de uma grande artéria, como a aorta torácica.

Introdução

Nas últimas décadas, o sistema de miografia de câmara pequena tem sido usado para medir a reatividade de diferentes camadas de paredes dos vasos sanguíneos em resposta a vários agentes farmacológicos e neurotransmissores em um ambiente ex vivo e em tempo real. A reatividade vascular é um componente importante de um vaso sanguíneo funcional saudável e é fundamental para a regulação do fluxo sanguíneo e da perfusão na vasculatura periférica e cerebral1. Dentro da parede dos vasos sanguíneos, a interação entre as camadas endotelial e muscular lisa é um dos principais determinantes do tônus vascular, que também é constantemente impactado por mudanças estruturais na camada de tecido conjuntivo ao redor da parede dos vasos sanguíneos (adventícia).

A camada endotelial controla o vasomovimento liberando alguns fatores vasodilatadores, incluindo óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGI2) e fator hiperpolarizador derivado do endotélio (EDHF), ou produzindo agentes vasoconstritores como endotelina-1 (ET-1) e tromboxano (TXA2)2,3,4. Dentre esses fatores, o NO tem sido extensivamente estudado, e seus importantes papéis regulatórios em outras funções celulares críticas, como inflamação, migração, sobrevivência e proliferação, têm sido altamente citados na literatura científica 2,5.

No campo da biologia vascular, a miografia de câmara forneceu aos fisiologistas vasculares e farmacologistas uma ferramenta valiosa e confiável para medir a função endotelial em um sistema semifisiológico rigidamente controlado1. Atualmente, existem dois sistemas de miógrafos diferentes disponíveis para os cientistas: miografia tensométrica (isométrica) de fio (ou pino) e miografia de pressão. Em um sistema de miografia de fio, o vaso sanguíneo é esticado entre dois fios ou pinos, permitindo a medição isométrica do desenvolvimento de força ou tensão na parede do vaso sanguíneo, enquanto a miografia por pressão é uma plataforma preferível para medições de reatividade vascular em artérias de pequena resistência, onde as alterações na pressão arterial são consideradas o principal estímulo para mudanças no tônus vascular e vasomoção. Há um consenso geral de que, para pequenas artérias de resistência, como artérias mesentéricas e cerebrais, a miografia por pressão cria uma condição mais próxima das condições fisiológicas do corpo humano. O miógrafo de câmara pequena pode ser utilizado para vasos com diâmetros muito pequenos (200-500 μm) a vasos muito maiores, como a aorta.

Enquanto o miógrafo de fio é um poderoso sistema para registrar a tensão dos vasos sanguíneos sob condições isométricas, o miógrafo de pressão é um sistema mais apropriado para medir mudanças no diâmetro do vaso em resposta a mudanças nas condições isobáricas. As mudanças de diâmetro no vaso em resposta a mudanças na pressão ou fluxo são muito maiores em uma pequena artéria muscular (arteríola) em comparação com grandes artérias elásticas, como a aorta. Por esses motivos, o miógrafo de pressão é considerado uma ferramenta melhor para pequenos vasos sanguíneos com vasorreatividade substancial1. Um dos outros pontos fortes práticos da miografia tensométrica de câmara de pequeno volume multicâmara é que se pode discernir a contribuição de diferentes mecanismos para a reatividade vascular estudando múltiplos (até quatro) segmentos da mesma artéria e do mesmo animal para reduzir a variabilidade e produzir dados robustos e conclusivos. Também é relativamente fácil de configurar e manter tecnicamente. Vasos de quase qualquer tamanho podem ser estudados com um miógrafo de fio. É uma solução mais econômica para avaliar a função vascular e é uma boa alternativa à miografia por pressão em experimentos em que o comprimento do vaso dissecado é muito curto para o protocolo de miógrafo de pressão.

Este relato fornece um protocolo detalhado para a avaliação da função endotelial no anel aórtico torácico isolado de camundongos utilizando pinos de montagem na técnica de miografia tensométrica de câmara de pequeno volume utilizando o sistema de miógrafo multicâmara DMT-620 (DMT-USA). Este protocolo utiliza um rato C57BL6 macho de 6 meses de idade com um peso médio entre 25-35 g. Felizmente, este protocolo pode ser aplicado a vários tipos e pesos de animais, considerando a ampla gama de tipos de vasos e diâmetros para os quais este protocolo pode ser usado.

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Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos e cuidados com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use and Care Committee (IACUC) da Midwestern University (IACUC# AZ-3006, AZ-2936).

1. Preparação do tampão

NOTA: Embora o tampão de solução salina fisiológica HEPES (HEPES-PSS) seja estável a 4 °C por 7 dias, recomenda-se que todos os tampões sejam feitos na hora no dia de cada experimento. Todos os outros reagentes e agonistas devem ser preparados na hora para cada experiência. O tampão HEPES-PSS utilizado neste protocolo é um tampão bem estabelecido para estudos vasculares ex vivo que tem se mostrado citoprotetor por mais de 12 h, preservando as respostas vasodilatadoras do vaso - o foco principal deste protocolo experimental 6,7.

  1. Preparar a solução de HEPES-PSS (pH 7,4) da seguinte forma: Misture 10 mmol/L de HEPES, 6 mmol/L de glicose, 1,5 mmol/L de CaCl 2, 130 mmol/L de NaCl, 4 mmol/L de KCl, 4 mmol/L de NaHCO3, 1,2 mmol/L de MgSO 4, 1,2 mmol/L KH2 PO4 e 0,03 mmol/L EDTA.
  2. Prepare o buffer HEPES-PSS high K+. Isto é idêntico à solução HEPES-PSS, exceto que contém 5 mmol / L HEPES, 65 mmol / L NaCl, 10 mmol / L de glicose, 1 mmol / L MgCl2, 80 mmol / L KCl e não contém MgSO4 e EDTA.

2. Preparação da unidade miográfica

  1. Ligue e ajuste o banho-maria para 37 °C. Garantir um nível de água adequado.
  2. Coloque dois copos rotulados adequadamente no banho-maria, um com 600 mL de solução de HEPES-PSS e outro com 150 mL de solução de K+ alto.
  3. Arejar um copo de 300 ml de solução de HEPES-PSS com gás carbógeno (5% de CO 2 e 95% de O2) por pelo menos 10 min.
  4. Adicione 30 mL da solução de HEPES-PSS aerada a um tubo de centrífuga de 50 mL, rotule adequadamente (gaiola torácica, número de identificação do rato) e coloque-a no gelo. Manter a solução de HEPES-PSS aerada restante no gelo para ser utilizada durante o processo de dissecção da aorta.
  5. Ligue a unidade miográfica de quatro câmaras; adicionar 6 ml de solução de HEPES-PSS a cada câmara miográfica e ajustar o calor para 37 °C. Deixar que a solução em cada câmara seja aerada (com mistura de carbogénio) durante 30 minutos e verificar se as câmaras atingiram os 37 °C desejados (utilize este período de espera para dissecar a aorta do rato).
  6. Ligue o hardware e o computador de aquisição de dados do miógrafo.

3. Isolamento da aorta do rato

  1. Anestesiar o rato experimental com inalação de isoflurano a 5% e eutanasiar por luxação cervical (um rato C57BL/6J macho de 6 meses de idade é utilizado para esta demonstração).
  2. Coloque o rato numa tábua cirúrgica na posição supina e prenda os apêndices à placa utilizando fita cirúrgica.
  3. Pulverize a região abdominal com álcool a 70% para que o pelo fique completamente molhado e os pelos soltos/secos não entrem na incisão. Limpe suavemente o excesso de solução.
  4. Use fórceps para localizar e isolar a pele abdominal logo inferior ao processo xifoide do esterno.
  5. Crie tensão levantando a pele para cima. Faça um corte contundente usando uma tesoura e remova a pele superficial, expondo a cavidade torácica.
  6. Levante o processo xifoide e faça incisões laterais ligeiramente inferiores ao processo ao longo das margens subcostais.
  7. Estenda as incisões laterais cranialmente para remover a porção anterior da caixa torácica.
  8. Remova a gaiola torácica fazendo um corte contundente através da coluna vertebral, abaixo do diafragma e no pescoço.
    NOTA: Os pesquisadores também podem remover a aorta diretamente do animal, mas deve-se tomar cuidado para proteger o vaso e liberar o sangue coagulado da aorta. Este protocolo usa o exemplo da remoção da gaiola torácica e limpeza e dissecação cuidadosa da aorta. Com a prática, esse método pode ser realizado de forma rápida e eficiente e é benéfico para a preservação do tecido extra para outros estudos, como imuno-histoquímica, histologia e western blotting.
  9. Transfira a gaiola torácica para uma placa de Petri revestida de elastômero de silicone transparente cheia de tampão HEPES-PSS aerado gelado e fixe-a em ambos os lados.
    NOTA: Use um kit de elastômero de silicone (Tabela de Materiais). Misture a base e o agente de cura (10:1 em peso), em seguida, despeje em uma placa de Petri de vidro e deixe curar por 24 h a 25 °C.
  10. Coloque a placa de Petri sob um microscópio de zoom estéreo, corte e remova suavemente o coração e a aorta anexada da caixa torácica e transfira para um prato limpo e transparente revestido de elastômero de silicone (Figura 1).
  11. Em seguida, remova suavemente a gordura e o tecido conjuntivo e qualquer sangue coagulado da aorta. Usando uma tesoura pequena e afiada, disseque e isole toda a aorta a partir da área do arco até a parte inferior da aorta descendente. Lembre-se de que o arco aórtico não é adequado para experimentos de miografia, mas pode ser usado para estudos histológicos.
  12. Use a solução de HEPES-PSS aerada a frio durante toda a dissecção. Mude a solução a cada 10 minutos ou quando a visibilidade for comprometida, o que vier primeiro. Recomenda-se que cada anel aórtico seja montado na câmara do miógrafo dentro de 20 min após a dissecção (max 60 min).

4. Montagem dos segmentos aórticos nas câmaras do miógrafo

  1. Corte a aorta dissecada em quatro segmentos de 2 mm cada usando uma pequena tesoura cirúrgica afiada. Use a mini-régua dentro do prato como referência.
  2. Coloque a câmara do miógrafo sob o microscópio de zoom estéreo para visualizar facilmente os pinos e ajuste os micrômetros de modo que os pinos estejam quase se tocando (Figura 2).
  3. Certifique-se de que ambos os pinos de retenção de tecido estejam devidamente alinhados.
  4. Preste atenção e evite beliscar a aorta enquanto monta os segmentos para evitar danos ao endotélio.
  5. Em câmaras que já contenham 5 mL de tampão HEPES-PSS aquecido e aerado, deslize cuidadosamente cada um dos segmentos aórticos de 2 mm sobre os dois pinos de montagem usando pinça. Seja muito gentil ao deslizar os segmentos da aorta sobre os pinos. A camada endotelial é muito frágil e sai muito facilmente do lado luminal.
  6. Afaste lentamente os pinos girando o micrômetro no sentido anti-horário para que o segmento aórtico não deslize para fora dos pinos ao colocar a câmara de volta na unidade do miógrafo (Figura 3).
  7. Use a gratícula ocular previamente calibrada do microscópio de dissecação para medir o comprimento verdadeiro e preciso do anel aórtico montado, posicionando o início da régua em uma extremidade do segmento (marcada como extremidade do tecido α1) e anotando a medida na outra extremidade do segmento aórtico em divisões oculares (marcadas como extremidade do tecido α2)8. Esses valores serão usados durante as etapas de normalização na seção 5.
  8. Devolver cada câmara miográfica à unidade e começar a arejar as câmaras a 37 °C durante 30 minutos.
    NOTA: Os quatro segmentos da aorta podem ser usados como replicantes para o mesmo tratamento, ou cada segmento da aorta pode ser usado simultaneamente para diferentes experimentos.

5. Normalização

NOTA: Um procedimento de normalização é necessário para garantir que as condições experimentais sejam adequadamente padronizadas e que os dados coletados sejam confiáveis e reprodutíveis. O "IC1/IC100", ou "Fator de Normalização", é definido como a razão da circunferência interna da artéria na qual é possível registrar a resposta máxima a um vasoconstritor (por exemplo, 60 mM KCl) dividida pela circunferência interna na qual uma pressão de parede transmural de 100 mm Hg (ou seja, IC100) é registrada. Portanto, multiplicando a CI100 por essa razão, podemos determinar a circunferência interna da artéria na qual uma resposta ótima (ou seja, CI1) pode ser estabelecida.

  1. Ajuste o micrômetro de tal forma que os pinos estejam quase se tocando.
  2. Defina as forças como zero para todas as câmaras do miógrafo e deixe-o se equilibrar por mais 1-2 min.
  3. Anote a primeira leitura do diâmetro do micrômetro. Esta é a posição em que o intervalo entre dois pinos é considerado zero (necessário para a etapa 5.7.).
  4. Abra as Configurações de normalização do software de aquisição de dados no menu suspenso DMT ; uma nova tela será aberta com as seguintes configurações e valores padrão:
    Calibração da ocular (mm/div): 0.36
    Pressão alvo (kPa): 13,3
    IC1/IC100: 0,9
    Tempo médio (s) on-line: 2
    Tempo(s) de atraso(s): 60
    Reproduzir som ao atrasar a conclusão (caixa de seleção)
    Sons (com menu de seleção suspenso ou função Procurar)
  5. Dependendo do número de segmentos, escolha o número correto de canais disponíveis na tela e inicie a gravação do gráfico.
  6. Use o menu suspenso para selecionar o canal de interesse; a tela de normalização será exibida.
  7. Introduza os valores constantes nas janelas da seguinte forma: Pontos finais do tecido α1; Pontos finais do tecido α2; Diâmetro do pino: 40 μm; Valor de leitura do micrômetro da escala micrômetro analógica.
  8. Para registrar o primeiro ponto (o valor inicial de X ou X0), clique no botão Adicionar Ponto . Após um atraso de 60 s, os valores para a força e a pressão efetiva (ERTP) correspondentes a este micrômetro serão exibidos, e a caixa para a leitura do micrômetro se tornará ativa e disponível.
  9. Comece a esticar o vaso girando o micrômetro no sentido anti-horário. Use a caixa de leitura do micrômetro para inserir o valor e clique no botão Adicionar ponto (haverá um tempo de atraso de 60 s novamente).
  10. Continue esticando o vaso e continue a adicionar valores de micrômetro até que o valor do micrômetro X1 seja visto, que é a configuração de micrômetro calculada usada para esticar o vaso até seu IC1.
  11. Defina o micrômetro para o valor X1.
    NOTA: A tensão normalizada (ótima) para um rato C57BL6 de 6 meses de idade é de 6 mN.
  12. Após a normalização, deixe o tecido descansar e equilibrar por 30 min. Não há necessidade de alterar a solução HEPES-PSS nas câmaras neste momento.
    NOTA: Cada câmara é capaz de armazenar 8 mL de solução. Este protocolo é escrito com o uso de 5 mL, o que permite a submersão total do vaso e pinos de montagem.
  13. Use o tempo de descanso e equilíbrio para preparar o seguinte.
    1. Preparar o estoque de trabalho de diluições seriadas de acetilcolina em água destilada (água RO) das concentrações mais baixas às mais altas da seguinte forma: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM e 1 mM. Mantenha todos os tubos no gelo durante a duração do experimento.
    2. Preparar uma solução de trabalho de 100 mM de éster metílico N-nitro-L-arginina (L-NAME) em água duplamente destilada e manter a solução sobre gelo durante a duração da experiência.
    3. Preparar a dose submáxima de fenilefrina (10 μM) determinada num conjunto separado de experiências.
      NOTA: O período de equilíbrio é necessário para que o segmento dos vasos sanguíneos se ajuste ao novo ambiente na câmara do miógrafo, redefina os gradientes iônicos e atinja um nível estável de tensão passiva antes de ser submetido a diferentes desafios farmacológicos e mecânicos.

6. Medida do vasorelaxamento endotélio-dependente em anéis aórticos

  1. No final do período de equilíbrio de 30 minutos, drene as câmaras e adicione 5 mL de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara. Escorra uma câmara de cada vez para minimizar a exposição do tecido ao ar. A drenagem das câmaras é realizada usando uma bomba de vácuo ajustada para 60 cmHg e as válvulas do miógrafo ajustadas para um atraso de 6 s para garantir a remoção dos 5 mL de solução.
  2. Se necessário, reajuste as medições de força para ler a tensão ideal de 6 mN. É muito crítico reajustar a força à tensão ideal durante cada período de incubação, bem como antes de cada novo conjunto de experimentos. Descanse o tecido por mais 15-20 min.
  3. Abra o software de aquisição de dados, altere os números de rastreamento de 50:1 para 500:1 e pressione Iniciar. Nesta fase, a força registrada para cada câmara pode ser vista no software.
  4. Imediatamente antes do início de um novo experimento, certifique-se de adicionar o rótulo apropriado no software de aquisição de dados.
  5. Escorra as câmaras mais uma vez antes de adicionar 5 mL de solução de K+ alta a cada câmara. Isso é adequado para testar a viabilidade do tecido aórtico e a integridade da resposta contrátil do músculo liso à despolarização da membrana antes de usar o tecido para qualquer outro protocolo experimental. Isso ajuda a determinar se o segmento dos vasos sanguíneos é utilizável para experimentação adicional.
  6. Drene as câmaras novamente assim que a resposta contrátil à solução de K+ alta atingir um platô para geração de força (Figura 4).
    NOTA: Não deixe a solução de K+ alta nas câmaras por mais de 3 minutos, pois danificaria o tecido.
  7. Lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x. Adicionar 5 ml de solução de K+ elevada a cada câmara. Drene as câmaras assim que a resposta contrátil à solução de K+ alta atingir um platô para geração de força e lave o tecido 3x com HEPES-PSS antes de permitir que o tecido descanse por mais 15 minutos.
    NOTA: Em alguns laboratórios, os segmentos sanguíneos são submetidos a uma solução alta de K+ três vezes consecutivas para garantir a variabilidade do vaso sanguíneo antes de iniciar os experimentos do miógrafo. Neste protocolo, os segmentos aórticos recém-isolados são submetidos a uma solução alta de K+ duas vezes antes de usar o tecido para experimentos adicionais. É importante manter isso consistente em todos os experimentos.
  8. Utilizar a média dos dois picos registrados de desenvolvimento de força (força de contração) em resposta a uma solução de K+ alta para normalizar os valores registrados em resposta a outros agentes vasoconstritores e vasodilatadores utilizados no experimento.
  9. Descanse o tecido por 15-20 min.
  10. Pré-contraia os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor fenilefrina (EP) em uma dose submáxima já estabelecida (concentração final de 10 μM na câmara).
    NOTA: A dose submáxima de fenilefrina (10 μM) foi determinada em um conjunto separado de experimentos, onde os segmentos aórticos foram submetidos a concentrações crescentes de solução de fenilefrina nas concentrações finais de 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM e 50 μM. Como resultado, determinou-se que uma concentração final de 10 μM de fenilefrina poderia gerar a força de contração submáxima (90% da força máxima) em segmentos aórticos de 2 mm, que é logo antes da força de contração atingir um platô. A razão para o uso da concentração sub-máxima de fenilefrina é evitar problemas relacionados à saturação do tecido aórtico ou dessensibilização ao agonista vasoconstritor.
  11. Permitir que a curva de contração induzida por PE atinja um platô para o desenvolvimento de tensão (força) (Figura 5).
  12. Em um platô de desenvolvimento de tensão para fenilefrina, execute a curva dose-resposta de acetilcolina adicionando 5 μL de doses crescentes de soluções de estoque de trabalho de acetilcolina em intervalos de 3 minutos, a fim de estabelecer as concentrações finais de acetilcolina na câmara do miógrafo da seguinte forma: 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM e 1 μM (Figura 6).
    NOTA: Depois de adicionar cada dose de acetilcolina, aguarde pelo menos 3 minutos (para que a tensão atinja um platô) antes de adicionar a próxima dose.
  13. Em cada passo, pipetar a solução de reserva de acetilcolina para a câmara muito lentamente e longe dos anéis aórticos para evitar qualquer perturbação tecidual.
  14. Após a conclusão do experimento dose-resposta, drene as câmaras e lave os segmentos aórticos com solução HEPES-PSS 3x quente e aerada para remover qualquer resíduo remanescente da droga.
  15. Descanse o tecido por 30 minutos antes de iniciar as próximas etapas do experimento. A viabilidade da aorta é verificada antes de cada etapa experimental utilizando a solução HEPES-PSS high K+. Se todas as etapas de preparação e experimentais forem seguidas corretamente, a viabilidade do tecido aórtico permanecerá a mesma durante todo o experimento (4-6 h).

7. Efeitos dos inibidores gerais da produção de NO no vasorelaxamento mediado pelo endotélio

  1. Use o mesmo tecido aórtico para esta parte do experimento depois de lavar cuidadosamente e descansar os segmentos por pelo menos 30 min.
    NOTA: Use o tempo de repouso de 30 minutos para preparar uma solução de trabalho de 100 mM de éster metílico N-nitro-L-arginina (L-NAME) em água destilada dupla e mantenha a solução no gelo durante a duração do experimento.
  2. Depois de descansar os segmentos aórticos por 30 min, escorra as câmaras e adicione a cada câmara uma solução fresca e quente de K+ (60 mM KCl).
    NOTA: É importante que, para cada parte do experimento, o tecido aórtico seja desafiado com uma solução alta de K+ pelo menos uma vez. O pico de contração registrado será utilizado para normalizar os dados coletados durante essa parte do experimento.
  3. Escorra as câmaras novamente assim que a resposta de contração à solução de K+ elevada atingir um platô e lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x.
  4. A fim de avaliar a contribuição da produção de NO para o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina observado (ver secção 6.), nesta fase, pré-incubar os segmentos aórticos com um inibidor geral da produção de NO (L-NAME) adicionando 10 μL da solução-mãe de trabalho preparada de 100 mM de L-NAME a cada câmara miográfica (contendo 5ml de solução tampão) para atingir uma concentração final de 200 μM em cada câmara miográfica.
    NOTA: L-NAME é um inibidor não seletivo e potente de todas as isoformas de NOS (enzima responsável pela produção de NO) e, portanto, é considerado uma ferramenta eficaz para bloquear a produção de NO na parede dos vasos sanguíneos9.
  5. Deixe os segmentos aórticos descansarem durante o tempo de pré-incubação com L-NAME (30 min).
  6. Não lave neste momento.
  7. Sem remover o L-NAME, adicione a dose submáxima de fenilefrina (concentração final de 10 μM) à câmara para induzir a contração aórtica.
    NOTA: Devido à ação inibitória do L-NAME na produção endógena de NO, o pico recém-registrado para a contração aórtica induzida pela fenilefrina será muito maior do que o pico inicial que foi registrado antes da incubação do tecido com L-NAME. Isso é esperado devido ao efeito do L-NAME na produção basal de NO na parede aórtica, o que leva a uma maior geração de força (devido à maior geração de força contrátil pelo músculo liso).
  8. Espere até que a curva de contração induzida pela fenilefrina atinja um platô para o desenvolvimento de tensão (força contrátil).
  9. Neste ponto, adicione acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nM (esta é a concentração sub-máxima de acetilcolina que foi estabelecida durante os experimentos descritos na seção 5. do protocolo).
  10. Aguarde alguns minutos para registrar possíveis alterações no desenvolvimento da força até que o platô formado esteja estável (Figura 7).
    NOTA: Devido à ação inibitória do L-NAME na capacidade da camada endotelial de produzir NO em resposta à acetilcolina, não se espera que haja alterações na geração de força registrada em resposta à fenilefrina, pois o NOS endotelial aórtico (eNOS) não é capaz de gerar NO em resposta à aplicação de acetilcolina.
  11. Escorra as câmaras e lave o tecido com uma solução HEPES-PSS quente e aerada 3x.

8. Contribuição da camada endotelial para o vasorelaxamento da aorta

  1. A fim de ressaltar o papel da camada endotelial no vasorelaxamento aórtico, teste o vasorelaxamento induzido pela acetilcolina em segmentos aórticos desnudados do endotélio, nos quais as camadas endoteliais são removidas.
  2. Posicione a câmara do miógrafo sob o microscópio e passe suavemente um pequeno fio (o mesmo fio que é usado para a miografia do fio pode ser usado aqui) através do lúmen da aorta. Mova suavemente o fio através do lúmen (movimento circular suave) por um curto período de tempo. Isso é suficiente para remover o endotélio ou a íntima.
  3. Corte a aorta em anéis aórticos de 2 mm e monte esses anéis na câmara do miógrafo, conforme descrito anteriormente.
  4. Ajuste a tensão ideal em 6 mN e deixe o tecido descansar por 30 minutos em tampão HEPES-PSS quente e arejado.
  5. No final do período de equilíbrio de 30 minutos, drene as câmaras e adicione 5 mL de solução HEPES-PSS fresca, quente e aerada a cada câmara.
  6. Zerar a força para todas as câmaras do miógrafo girando o micrômetro no sentido anti-horário.
  7. Gire lentamente o micrômetro no sentido anti-horário para aumentar a distância entre os pinos até que a força registrada atinja a tensão ideal desejada para a aorta do camundongo (6 mN para a aorta do camundongo C57BL/6J). Descanse o tecido por mais 15-20 minutos na tensão ideal (6 mN).
  8. Escorra as câmaras 1x mais antes de adicionar 5 mL de solução de K+ alta a cada câmara.
  9. Escorra as câmaras novamente assim que a resposta de contração à solução de K+ elevada atingir um platô e lave o tecido com a solução HEPES-PSS 3x. Descanse o tecido por 15-20 min
  10. Pré-contrair os segmentos aórticos com o agente vasoconstritor fenilefrina (concentração final de 10 μM na câmara).
    NOTA: Devido à remoção do endotélio, a produção basal de NO na parede aórtica é significativamente diminuída; portanto, espera-se que o pico de contração induzida pela fenilefrina (o pico de geração de força) seja maior no tecido aórtico sem a camada endotelial.
  11. Quando a força induzida pela fenilefrina atingir um platô, adicione a concentração submáxima de acetilcolina à câmara do miógrafo para atingir uma concentração final de 500 nM.
    NOTA: Se a remoção da camada endotelial for feita corretamente, não haverá alterações na força induzida pela fenilefrina registrada, pois a produção de NO induzida pela acetilcolina pelo endotélio terá sido diminuída devido à remoção da camada endotelial. O traço registrado será muito semelhante ao observado na presença de L-NAME (seção 7.).
  12. Aguarde 3 min para garantir que o platô registrado para o desenvolvimento da força induzida pela fenilefrina não esteja mudando antes de encerrar o experimento (Figura 8).
    NOTA: Se a aplicação de acetilcolina causar qualquer queda na contração induzida pela fenilefrina enquanto estiver no platô, isso é uma indicação de que a camada endotelial não foi completamente removida.

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Resultados

O protocolo tensométrico de miografia de câmara pequena explicado aqui é o método padrão para medir a reatividade vascular em artérias pequenas e grandes e permite medições simultâneas da reatividade vascular em até quatro segmentos de vasos sanguíneos do mesmo pequeno animal de laboratório experimental. Neste relato, utilizamos especificamente o sistema para medir a função endotelial na aorta isolada de camundongos (Figura 1). Neste protocolo, segmentos aórticos isolados são montados em uma...

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Discussão

O campo da biologia vascular depende fortemente de ferramentas que ajudam os pesquisadores a avaliar a integridade funcional e estrutural da parede dos vasos sanguíneos. Também requer atenção especial sobre as interações diretas e indiretas entre as três camadas de vasos sanguíneos: a íntima, a mídia e a adventícia. Dentre essas três camadas, a íntima é formada por uma monocamada de células endoteliais e tem uma função muito importante na regulação da saúde vascular e hemostasia.

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (R15HL145646) e da Faculdade de Pós-Graduação da Midwestern University.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetilcolinaSigmaAldrichA6625-100G
CaCl2SigmaAldrichC4901-1KG
Gás CarbogenH103847
Tesoura de dissecaçãoFST91460-11
DMT 620 Sistema de miógrafo multicâmaraDMT DMT620Sistema
Fórceps de DumontFST91150-20
EDTASigmaAldrichE5134-10G
glicoseSigmaAldrichG8270-1KG
HEPESSigmaAldrichH7006-1KG
KClSigmaAldrichP9541-1KG
KH2PO4SigmaAldrichP5655-1KG
InstrumentosLabChart ADISoftware de aquisição de dados
Fonte de luzVolpi14363
L-NameFischer Scientific50-200-7725
MgSO4SigmaAldrichM2643-500G
MicroscópioLeicaS6Dmicroscópio estéreo
Zoom NaClSigmaAldrichS5886-5KG
NaHCO3SigmaAldrichS5761-500G
Sistema de banho de órgãoDMT720MO
FenilepfrinaSigmaAldrichP6126-10G
BombaWelch2546B-01
SoftwareInstrumentos ADILabChart 8.1.20
Tesoura de molaFST15003-08
Sylgard 184 KitServiços de Microscopia Eletrônica24236-10kit de elastômero de silicone
Regulador de tanqueFischer Scientific10575147
Sistema de banho-mariaFischer Scientific15-462-10
de miógrafo multicâmara

Referências

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