Artigo de método

Visualizando as Características Morfológicas da Junção Neuromuscular no Músculo Gastrocnemius De Rato Medial

DOI:

10.3791/63954

⸱

17 de maio de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O protocolo mostra um método para examinar a correlação espacial entre os terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e células schwann peri-sinápticas no músculo gastrocnemius medial de ratos usando imunohistoquímica fluorescente com diferentes biomarcadores, ou seja, neurofilamento 200, transporte de acetilcholina vesicular, alfa-bungarotoxina e S100.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A junção neuromuscular (NMJ) é uma estrutura complexa que serve para a comunicação do sinal do neurônio motor ao músculo esquelético e consiste em três componentes histológicos essenciais: os terminais de axônio motor pré-sináptico, receptores de acetrico nicotípico pós-sináptico (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs). Para demonstrar as características morfológicas do NMJ, o músculo gastrocnemius medial de ratos foi selecionado como o tecido-alvo e examinado pelo uso de múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores, incluindo neurofilamento 200 (NF200) e transporte de acetilcolina vesicular (VAChT) para as fibras nervosas motoras e seus terminais pré-sinápticos, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para os AchRs nicotípicos pós-sinápticos, e S100 para os PSCs. Neste estudo, a coloração foi realizada em dois grupos: no primeiro grupo, as amostras foram manchadas com NF200, VAChT e α-BTX, e no segundo grupo, as amostras foram manchadas com NF200, α-BTX e S100. Foi demonstrado que ambos os protocolos podem demonstrar efetivamente a estrutura detalhada do NMJ. Utilizando o microscópio confocal, características morfológicas dos terminais pré-sinápticos, receptores pós-sinápticos e PSC foram vistos, e suas imagens de pilhas Z foram reconstruídas em um padrão tridimensional para analisar melhor a correlação espacial entre as diferentes rotulagens. Na perspectiva da metodologia, esses protocolos fornecem uma referência valiosa para a investigação das características morfológicas do NMJ em condições fisiológicas, que também podem ser adequadas para avaliar a alteração patológica do NMJ, como lesão nervosa periférica e regeneração.

Introdução

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Como três componentes estruturais essenciais da junção neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, aspectos morfológicos dos terminais de axônio motor pré-sináptico, membrana pós-sináptica contendo receptores de acetilcolina nicotínica (AchRs) e células schwann peri-sinápticas (PSCs) têm sido amplamente investigadas. Seções finas e espécimes de montagem inteira dos músculos esqueléticos foram examinados com diferentes técnicas histológicas, como microscopia eletrônica 5,6, microscopia confocal 7,8 e microscopia de folha de luz 9,10. Embora as características morfológicas do NMJ tenham sido demonstradas por essas técnicas de diferentes aspectos, como comparação, a microscopia confocal ainda é uma escolha ideal para a imagem da morfologia detalhada do NMJ.

Recentemente, muitas novas tecnologias foram desenvolvidas para mostrar os componentes estruturais do NMJ. Por exemplo, camundongos fluorescentes transgênicos thy1-YFP têm sido diretamente usados para observar axônios motores e placas finais motoras in vivo e in vitro 10,11. Além disso, a injeção intravenosa de α-BTX fluorescente foi aplicada para revelar a distribuição espacial de placas finais motoras em músculos esqueléticos de tipo selvagem e fluorescentes transgênicos, utilizando tratamento de limpeza óptica de tecido para exame com microscopia de folha de luz 9,12. No entanto, além dos elementos pré e pós-sinápticos que podem ser vistos por esses métodos avançados, os PSCs não podem ser demonstrados ao mesmo tempo.

O acúmulo de evidências indica que os PSCs, como as células gliais periféricas, estão intimamente associados aos terminais pré-sinápticos que contribuem para o desenvolvimento e estabilidade do NMJ, a modulação da atividade sináptica do NMJ sob a condição fisiológica e a regeneração do NMJ após lesão nervosa 13,14,15 . Considerando a arquitetura celular do NMJ, este protocolo é um candidato adequado para rotular simultaneamente os PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, e é potencialmente usado para avaliar a integridade e plasticidade do NMJ em condições normais e patológicas. Por exemplo, compare a intensidade do NMJ, morfologia e volume de placas finais motoras pós-sinápticas, inervação e denervação do NMJ, e número de PSCs em músculos de estado fisiológico e patológico.

O músculo gastrocnemius é o maior músculo formando a protuberância na panturrilha, que é facilmente dissecada pela remoção da pele e do músculo bíceps femoral do membro. O músculo é frequentemente escolhido para avaliar atrofia muscular, degeneração neuromuscular, desempenho muscular e força da unidade motora ex vivo ou in vivo 16,17,18. No entanto, a técnica também é adequada para revelar as características morfológicas do NMJ de vários músculos esqueléticos. Ao mesmo tempo, as seções musculares grossas podem revelar morfologia mais completa e quantidade de NMJ em comparação com as seções finas 7,8 e as fibras muscularesprovocadas 19.

De acordo com esses estudos, o músculo gastrocnemius medial de rato foi selecionado como o tecido-alvo neste estudo e foi fatiado com uma espessura de 80 μm para múltiplas manchas fluorescentes com vários tipos de biomarcadores de acordo com os componentes estruturais do NMJ. Aqui, neurofilamento 200 (NF200)20,21, transporte de acetilcolina vesicular (VAChT)22, alfa-bungarotoxina (α-BTX)23,24 e S10025,26 foram usados para rotular fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, AchRs pós-sinápticos e PSCs, respectivamente. Além disso, o fundo do tecido muscular e núcleos celulares foram ainda mais neutralizados com fálica e DAPI.

Neste estudo, esperamos desenvolver um protocolo refinado para coloração simultânea da arquitetura celular do NMJ com seus biomarcadores correspondentes em espécimes fixos mais espessos, o que é mais conveniente para uso em microscopia confocal e ajuda a obter muito mais informações sobre a estrutura detalhada dos PSCs, elementos pré e pós-sinápticos, bem como sua correlação espacial entre si. Na perspectiva da metodologia, esse protocolo pode beneficiar-se da avaliação das características morfológicas do NMJ em condições normais e patológicas.

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Protocolo

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, Academia Chinesa de Ciências Médicas (aprovação nº 2021-04-15-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados três ratos machos adultos (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Os ratos foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas com temperatura e umidade controladas e com livre acesso a alimentos e água. Os instrumentos e materiais deste estudo são mostrados na Figura 1.

1. Perfusão

  1. Injete 250 mg/kg de solução de tribromoetanol intraperitoneal para induzir a eutanásia dos ratos.
  2. Uma vez que a respiração pare, abra a cavidade torácica para acessar o coração usando tesouras e fórceps. Insira um cateter intravenoso do ventrículo cardíaco esquerdo em direção à aorta, e depois corte a aurícula direita.
  3. Perfundam os ratos experimentais no capô. Comece perfumando com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9% até que o sangue que sai da aurícula direita esteja claro, depois continue perfumando com 250-300 mL de 4% de paraformaldeído em tampão fosfato de 0,1 M (PB, pH 7,4) por cerca de 10 min até que a cauda seja dura de dobrar.

2. Anatomia regional

  1. Após a perfusão, remova a pele do membro traseiro bilateral usando uma lâmina cirúrgica (Figura 2A) e exponha o nervo ciático bilateral e o músculo gastrocnemius medial (Figura 2B).
  2. Disseque o músculo gastrocnemius medial bilateral cuidadosamente do membro traseiro usando uma lâmina (Figura 2C) e pós-fixar todo o músculo em 10 mL de 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB por 2 h.
  3. Retire o músculo da solução e crioproteta o músculo em 10 mL de 25% de sacarose em 0,1 M PB por 1 dia a 4 °C até que o músculo esteja completamente imerso na solução.

3. Criosectioning do músculo

  1. Uma vez que o tecido muscular esteja imerso na solução, fixe-o em um estágio de congelamento de um sistema de microtome deslizante usando meio de seção congelada. Corte o músculo horizontalmente ao longo do longo eixo do músculo na espessura de 80 μm.
  2. Coloque sete crio-seções por poço de forma ordenada em uma placa de cultura de seis poços com 10 mL de 0,1 M PB (pH 7.4) usando um pincel.
    NOTA: As seções são colocadas em ordem para que as seções em diferentes poços sejam adjacentes, o que torna as seções usadas para diferentes manchas mais consistentes.

4. Coloração fluorescente múltipla com NF200, VAChT, α-BTX e Pha

NOTA: Foram aplicadas múltiplas manchas fluorescentes com NF200, VAChT, α-BTX e Pha para revelar as fibras nervosas, terminais pré-sinápticos, receptores de acetilcolina nicotípica pós-sináptica e fibras musculares, respectivamente.

  1. Incubar quatro seções por poço com 1,5 mL de 0,1 M PB contendo 75 μL de 10% Triton X-100 (0,5%) e 45 μL de soro normal de burro (3%) em um agitador orbital a 20 rpm por 30 min.
  2. Transfira as seções para 1,5 mL de solução mista de anticorpos primários contendo coelhinho anti-NF200 (1:1.000), anti-VAChT de cabra (1.500) em 0,1 M PB (pH 7.4) com soro de burro 1% normal, e 0,5% Triton X-100, e incubar durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, lave as seções 3x por 5 min cada em 0,1 M PB (pH 7.4) em um agitador orbital a 20 rpm.
  3. Incubar as seções em 1,5 mL de solução mista de anticorpos secundários contendo anti-coelho burro AF488 (1:500) e anti-cabra de burro AF546 (1:500), bem como os biomarcadores de α-BTX, AF647 (1:500) e faloidein 350 (1:500) em 0,1 M PB (pH 7.4) contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 para 1h em temperatura ambiente. Proteja-se contra a luz.
  4. Depois de lavar 3x por 5 min cada em 0,1 M PB (pH 7.4), monte as seções em slides de microscópio. Aplique vidro de cobertura nas seções usando 50% de glicerina em água destilada para observação.

5. Coloração fluorescente múltipla com NF200, S100, α-BTX e DAPI

NOTA: Os procedimentos são semelhantes aos da etapa 4; a principal diferença é entre os anticorpos primários e seus anticorpos secundários correspondentes.

  1. Use os seguintes anticorpos primários: frango anti-NF200 (1:6.000), coelhinho anti-S100 (1:2.500) na etapa 4.2 e seus anticorpos secundários correspondentes: anti-frango burro AF488 (1:2.500) na etapa 4.2 e seus anticorpos secundários correspondentes: anti-frango burro AF488 (1:1:2500) e anti-coelho burro AF546 (1:500), bem como os biomarcadores de α-BTX AF647 (1:500) e DAPI (1:50000) na etapa 4.3.

6. Observação e análises

  1. Observe a amostra e tire imagens utilizando um sistema de imagem confocal equipado com as seguintes lentes objetivas: lente 20x com na de lente de 0,75 e 40x com NA de 0,95.
  2. Use comprimentos de onda de excitação e emissão de 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT e S100), 647 nm (α-BTX) ou DAPI correspondente à coloração fluorescente múltipla. Defina a resolução da captura de imagem para 640 x 640 pixels.
    NOTA: A resolução de 640 x 640 pixels é escolhida porque as imagens foram capturadas em pilhas Z. Uma resolução de 1024 x 1024 pixels resulta em imagens lentas e fotobleaching em pilhas Z.
  3. Defina o plano focal de partida e o plano focal final. Defina o tamanho do passo para 1 μm ou 2 μm. Escolha padrão de profundidade, captura de imagem e série Z.
  4. Para as imagens de ampliação inferior tiradas em 20x, capture 40 imagens (Z-stacks) em tamanho de passo de 2 μm de cada seção de 80 μm de espessura usando um pinhole de 105 μm. Escolha o modo de projeção/topografia e a projeção de intensidade sobre o eixo Z para integrar todas as imagens em um único foco.
  5. Para as imagens de ampliação mais altas tiradas em 40x, capture 80 imagens (Z-stacks) em tamanho de passo de 1 μm de cada seção de 80 μm de espessura com zoom definido para 2 e um pinhole de 105 μm. Integre todas as imagens em um único foco.
  6. Reconstrua as imagens no padrão tridimensional com o sistema de processamento de imagens como descrito anteriormente em27.

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Resultados

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Após múltiplas manchas fluorescentes, a rotulagem correspondente foi demonstrada ordenadamente nas seções de 80 μm de espessura do músculo gastrocnemius medial do rato com fibras nervosas NF200-positivas, Terminais pré-sinápticos positivos do VAChT, α-BTX-positivos AchRs pós-sinápticos, PSCs S100 positivos, fibras musculares phalloidina-positivas e núcleos celulares rotulados por DAPI (Figura 3 e Figura 4).

Mostrou-se que as fibras ne...

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Discussão

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Descrevemos os detalhes técnicos necessários para a realização de uma coloração múltipla bem sucedida de fatias musculares e o uso de imunohistoquímica fluorescente para revelar as características morfológicas do NMJ nas seções grossas do músculo gastrocnemius medial de ratos. Usando esta abordagem, os detalhes finos e correlação espacial dos PSCs e elementos pré e pós-sinápticos podem ser analisados e apreciados sob microscopia confocal, e reconstruídos em um padrão tridimensional. Aqui, vários tipos de biomarcadores fo...

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Divulgações

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este estudo foi financiado pelo CacmS Innovation Fund (Nº. CI2021A03407), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82004299) e fundos fundamentais de pesquisa para os Institutos Centrais de Pesquisa em Bem-Estar Público (Nº. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4',6-diamidino-2-fenilindol dicloridratoThermoFisherD3571
Microscópio confocal de varredura a laserOlympusFV1200
Burro anti-frango AF488Jackson149973 (703-545-155)
Burro anti-cabra AF546ThermoFisherA11056
Burro anti-coelho AF488ThermoFisherA21206
Burro anti-coelho AF546ThermoFisherA10040
Seção Congelada MédioThermoFisherNeg-50
Vidro de cobertura de microscópioCitotest10212450C
MicrótomoYamatoREM-710
Neurofilamento 200Sigma-AldrichN4142Coelho
Neurofilamento 200Abcamab4680Frango
Soro de burro normalJackson ImmunoResearch Laboratories017-000-1210 ml
Soro fisiológicoShandong Hualu Pharmaceutical Co.LtdH37022750250 ml
ParaformaldeídoMacklinP804536500g
Faloidina AF350ThermoFisherA22281
Bomba peristáltica de precisãoLongerBT100-2J
S100-βAbcamab52642
Coelho Fosfato de sódio dbasic dodecahidratadoMacklinS818118500g
Fosfato de sódio monobásico di-hidratadoMacklinS817463500g
SacaroseMacklinS818046500g
Superfrost mais lâminas de microscópioThermoFisher4951PLUS-001E
Triton X-100Solarbio Life Sciences9002-93-1100 ml
Transportador Vesicular de AcetilcolinaMiliporeANB100
Conjugado de cabra&alfa-bungarotoxina AF647 ThermoFisherB35450
incolor

Referências

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