Triagem Genética para Identificação de Supressores Multicópia em Schizosaccharomyces pombe

Resumo

Este trabalho descreve um protocolo para uma triagem genética supressora de múltiplas cópias em Schizosaccharomyces pombe. Esta tela usa uma biblioteca de plasmídeos em todo o genoma para identificar clones supressores de um fenótipo de perda de função associado a uma cepa mutante de consulta. Novos supressores genéticos do mutante nulo ell1 foram identificados usando esta tela.

Resumo

A identificação de interações genéticas é uma ferramenta poderosa para decifrar as funções do(s) gene(s), fornecendo insights sobre suas relações funcionais com outros genes e organização em vias e processos biológicos. Embora a maioria das telas genéticas tenha sido inicialmente desenvolvida em Saccharomyces cerevisiae, uma plataforma complementar para a realização dessas telas genéticas foi fornecida pela Schizosaccharomyces pombe. Uma das abordagens comuns usadas para identificar interações genéticas é a superexpressão de clones de uma biblioteca de plasmídeos de alto número de cópias em todo o genoma em um mutante de perda de função, seguida pela seleção de clones que suprimem o fenótipo mutante.

Este artigo descreve um protocolo para a realização desta triagem genética baseada em "supressão multicópia" em S. pombe. Esta triagem ajudou a identificar o(s) supressor(es) de múltiplas cópias do fenótipo genotóxico sensível ao estresse associado à ausência do fator de alongamento de transcrição Ell1 em S. pombe. A triagem foi iniciada pela transformação da cepa mutante nula ell1 com uma biblioteca plasmídica de cDNA de alto número de cópias e seleção dos supressores em placas EMM2 contendo 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), um composto genotóxico indutor de estresse. Posteriormente, o plasmídeo foi isolado de duas colônias supressoras pré-selecionadas e digerido por enzimas de restrição para liberar o DNA inserido. Os plasmídeos que liberam um fragmento de DNA de inserção foram retransformados na cepa de deleção ell1 para confirmar a capacidade desses clones plasmídeos supressores de restaurar o crescimento do mutante de deleção ell1 na presença de 4-NQO e outros compostos genotóxicos. Os plasmídeos que apresentaram resgate do fenótipo de deleção foram sequenciados para identificar o(s) gene(s) responsável(is) pela supressão do fenótipo sensível ao estresse genotóxico associado à deleção ell1.

Introdução

Redes de interações genéticas fornecem informações funcionais sobre genes e delineiam caminhos e processos biológicos em que esses genes podem estar envolvidos in vivo. Além disso, eles também podem fornecer insights sobre como diferentes genes interagem uns com os outros, resultando em um fenótipo específico ^1,2,3. Ao longo dos anos, uma variedade de telas genéticas foram projetadas por pesquisadores para responder a questões biológicas fundamentais e estudar doenças humanas. Telas para a identificação de interações genéticas podem ser realizadas de várias maneiras.....

Protocolo

1. Transformação da biblioteca cDNA na cepa mutante de consulta S. pombe para triagem de supressores de multicópia

NOTA: O método padrão de acetato de lítio²⁷ foi seguido para transformar a biblioteca de cDNA de S. pombe na cepa de consulta S. pombe ell1Δ com algumas modificações:

1. Cultivar a cepa de S. pombe ell1Δ a 32 °C em uma placa de meio YE (Tabela 1) suplementada com 225 μg/mL de adenina, leucina e uracilo cada. Inocular uma alça cheia de inóculo da cepa ell1Δ da placa acima em 15-20 mL de meio YE suplementado com 225 μg/m....

Resultados

Triagem para sugador(es) de múltiplas cópias de sensibilidade ao estresse genotóxico associado à deleção ell1 em S. pombe
Realizamos a triagem genética utilizando o protocolo descrito acima para identificar supressores multicópia do fenótipo de perda de função da cepa mutante de deleção de consulta ell1. A sensibilidade relacionada ao crescimento da cepa de deleção ell1 observada na presença do agente genotóxico 4-.......

Discussão

As leveduras têm sido amplamente utilizadas para investigar os processos biológicos básicos e as vias que são conservadas evolutivamente em organismos eucarióticos. A disponibilidade de ferramentas genéticas e genômicas, juntamente com sua amenidade a vários procedimentos bioquímicos, genéticos e moleculares, tornam as leveduras um excelente organismo modelo para a pesquisa genética^34,35,36. Ao longo dos anos, várias telas genét.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4-NQO	Sigma	N8141
Ácido acético, glacial	Sigma	1371301000
Sulfato de Adenina	Himedia	GRM033
Ágar	Himedia	GRM026
Agarose	Lonza	50004L
Cloreto de Amônio	Himedia	MB054
BamHI	Fermentas	ER0051
Biotina	Himedia	RM095
Ácido Bórico	Himedia	MB007
Cloreto de Cálcio	Sigma	C4901
Clorofórmio: Álcool isoamílico 24: 1	Sigma	C0549
Ácido cítrico	Himedia	RM1023
Hidrogênio fosfato dissódico anidro	Himedia	GRM3960
DNA de fita simples de testículos de salmão	Sigma	D7656
EDTA dissódico	Sigma	324503
Cloreto férrico hexahidratado	Himedia	RM6353
Glicose	Amresco	188
Ionositol	Himedia	GRM102
Isopropanol	Qualigen	Q26897
Leucina	Himedia	GRM054
Acetae de lítio	Sigma	517992
Cloreto de magnésio Hexahidratado	Himedia	MB040
Ácido Molibdico	Himedia	RM690
Ácido Nicotínico	Himedia	CMS177
PEG, MW 4000	Sigma	81240
Ácido Pentocínico	Himedia	TC159
Fenol	Himedia	MB082
Kit de extração de plasmídeo	Qiagen	27104
Cloreto de potássio	Sigma	P9541
Potássio hidrogênio Pthallate	Merc	DDD7D670815
Iodeto de potássio	Himedia	RM1086
RNAse	Fermentas	EN0531
SDS	Himedia	GRM205
Hidróxido de sódio	Himedia	GRM1183
Sulfato de sódio	Himedia	RM1037
Base livre de	Tris Himedia	MB209
Uracil	Himedia	GRM264
Extrato de levedura em pó	Himedia	RM668
Sulfato de zinco Heptahidratado	Merc	DJ9D692580