Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Resumo

A resistência à insulina é um efeito reduzido da insulina sobre suas células-alvo, geralmente derivado da diminuição da sinalização dos receptores de insulina. A resistência à insulina contribui para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças derivadas da obesidade de alta prevalência em todo o mundo. Portanto, a compreensão dos mecanismos subjacentes à resistência à insulina é de grande relevância. Vários modelos têm sido utilizados para estudar a resistência à insulina tanto in vivo quanto in vitro; Os adipócitos primários representam uma opção atraente para estudar os mecanismos de resistência à insulina e identificar moléculas que neutralizam essa condição e os alvos moleculares de drogas sensibilizadoras de insulina. Neste trabalho, estabelecemos um modelo de resistência insulínica utilizando adipócitos primários em cultura tratada com fator de necrose tumoral α (TNF-α).

As células precursoras de adipócitos (APCs), isoladas do tecido adiposo subcutâneo de camundongos digerido pela colagenase por tecnologia de separação magnética celular, são diferenciadas em adipócitos primários. A resistência à insulina é então induzida pelo tratamento com TNF-α, uma citocina pró-inflamatória que reduz a fosforilação/ativação da tirosina dos membros da cascata de sinalização da insulina. A diminuição da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato do receptor de insulina (IRS-1) e proteína quinase B (AKT) são quantificados por western blot. Este método fornece uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo.

Introdução

A insulina é um hormônio anabólico produzido pelas células β das ilhotas pancreáticas e o principal regulador do metabolismo da glicose e dos lipídios. Dentre suas diversas funções, a insulina regula a captação de glicose, a síntese de glicogênio, a gliconeogênese, a síntese proteica, a lipogênese e a lipólise¹. O sinal molecular inicial após a interação da insulina com seu receptor (IR) é a ativação da atividade intrínseca da tirosina proteína quinase do IR², resultando em sua autofosforilação³ e na subsequente ativação de uma família de proteínas conhecidas como substratos do receptor de insulin....

Protocolo

Todos os experimentos com roedores foram aprovados pelo Comitê de Bioética do Instituto de Neurobiologia da UNAM, protocolo número 075.

1. Isolamento de células precursoras de adipócitos de camundongos

1. Eutanásia de camundongos C57BL/6 machos de 8-10 semanas de idade (por exemplo, por inalação de CO₂ e subsequente deslocamento cervical) (quatro animais por isolamento). Desinfetar os camundongos esfregando com etanol 70% e obter o tecido adiposo imediatamente após o sacrifício.
   NOTA: Após a eutanásia dos roedores, isolar o tecido adiposo imediatamente e realizar todas as etapas dentro de uma capela de ....

Resultados

Nos últimos anos, o aumento da prevalência de obesidade e DM2 tem motivado uma intensa busca pelos mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo. Com o protocolo aqui descrito, as VPAs podem ser diferenciadas em adipócitos maduros para avaliar a resistência e a sensibilidade à insulina. Uma vez que as VPAs atingem a confluência, são necessários 10 dias para completar sua diferenciação em adipócitos maduros e sua indução de resistência à insulina mediada pelo TNF-α (Figura 1

Discussão

Este trabalho fornece um método para estudar a resistência à insulina que utiliza adipócitos primários em cultura tratada com TNF-α. Esse modelo tem a vantagem de que adipócitos primários podem ser cultivados em condições definidas por longos períodos de tempo com um controle rigoroso dos fatores ambientais celulares²⁶. A duração do ensaio é de 15-20 dias, embora variações na porcentagem de adipócitos diferenciados possam ocorrer entre os experimentos. Os adipócitos primários apresentam vantagens .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1. Isolamento de células precursoras de adipócitos de camundongo
ACK lysing tampon	Microesferas	10-548E
	Miltenyi	130-090-485
Anti-CD31	eBioscience	13-0311-85
AutoMACS Pro Separador	Miltenyi
Matriz de membrana do porão (matrigel)	Corning	354234
bFGF	Sigma	F0291	Fator de crescimento
BSA	Equitech-Bio, Inc.	BAC63-1000
CD45 Anticorpo Monoclonal (30-F11) - Biotina	eBioscience	13-0451-85
Colagenase, Tipo 1	Worthington Biochem	LS004197
Dexametasona	Sigma	D1756
DMEM	GIBCO	12800017
DMEM baixa glicose	GIBCO	31600-034
EGF	Peprotech	315-09	Fator de crescimento
FBS	GIBCO	26140-079
ITS mix	Sigma	I3146
Ácido L-ascórbico 2-fosfato	Sigma	A8960
LIF	Millipore	ESG1107	Fator de crescimento
Ácido linoleico-albumina	Sigma	L9530
MCDB 201 meio	Sigma	M6770
Normocin	InvivoGen	ant-nr-2
PDGF-BB	Peprotech	315-18 Fator de	crescimento
Penicilina-Estreptomicina	BioWest	L0022-100
(70 µ m)	Miltenyi	130-095-823
Rato Purificado Anti-Rato CD16 / CD32	BD Pharmingen	553142
Tripsina-EDTA	GIBCO	25300062
2. Diferenciação de adipócitos e indução de resistência à insulina
3-Isobutil-1-metilxantina [IBMX]	Sigma	I5879	Coquetel de diferenciação
BMP4	R& D Systems	5020-BP-010	Coquetel de diferenciação
Dexametasona	Sigma	D1756	Coquetel de diferenciação
Insulina	Sigma	I9278
Rosiglitazona	Cayman	71742	Coquetel de diferenciação
TNFα	R& D Systems	210-TA-005
3. Avaliação da via de sinalização da insulina por western blot
Anticorpo anti-tubulina beta	Abcam	ab6046
Azul de bromofenol	BioRad	161-0404	Tampão Laemmli
EDTA	Sigma	E5134	Tampão RIPA
EGTA	Sigma	E4378	Tampão RIPA
Sistema	FluorChem EProteinSimple
Glycerol	Sigma	G6279	Laemmli buffer
Glycine	Sigma	G7126	Buffer de corrida e transferência
Igepal	Sigma	I3021	RIPA buffer
2- mercaptoetanol	Sigma	M3148	Laemmli buffer
Metanol	JT Baker	907007	Buffer
de transferênciaNaCl	JT Baker	3624-05	TBS-T
NaF	Sigma	77F-0379	RIPA buffer
NaOH	JT Baker	3722-19
Na4P2O7	Sigma	114F-0762	RIPA buffer
Na3VO4	Sigma	S6508	RIPA buffer
Membrana de nitrocelulose	BioRad	1620112
Leite em pó desnatado	BioRad	Solução de bloqueio	de 1706404
Proteína padrão prestada		Coquetel de
	Sigma	P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-035-132
Receptor de Fosfo-Insulina β	Anticorpo de sinalização celular	3024
Phospho-Akt (Ser473) Anticorpo	sinalização celular	9271
Phospho-IRS1 (Tyr608)	Millipore	9432
Sacarose	JT Baker	407205	tampão RIPA
SDS	BioRad	1610302	Buffer de corrida e laemmli
SuperSignal West Pico PLUS Substrato quimioluminescente	Thermo Scientific	34577
Tris-base	Promega	H5135	Buffer, execução, transferência e laemmli
Tris-HCl	JT Baker	4103-02	Tampão RIPA - TBS
Tween 20	Sigma	P1379	TBS-T

Anti-Biotina LONZA Filtro de Pré-Separação inibidores de protease 1610395 BioRad de