Name: Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprenda a isolar e diferenciar adipócitos primários de camundongos para estudar resistência à insulina. Este protocolo demonstra indução de resistência com TNF-alpha e análise de fosforilação por Western blot.

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Agradecemos a Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla e María Antonieta Carbajo pela assistência técnica e Jessica Gonzalez Norris pela edição crítica do manuscrito. Este protocolo foi apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (to Y.M.).

Todos os experimentos com roedores foram aprovados pelo Comitê de Bioética do Instituto de Neurobiologia da UNAM, protocolo número 075.
1. Isolamento de células precursoras de adipócitos de camundongos
<ol><li>Eutanásia de camundongos C57BL/6 machos de 8-10 semanas de idade (por exemplo, por inalação de CO2 e subsequente deslocamento cervical) (quatro animais por isolamento). Desinfetar os camundongos esfregando com etanol 70% e obter o tecido adiposo imediatamente após o sacrifício. NOTA: Após a eutanásia dos roedores, isolar o tecido adiposo imediatamente e realizar todas as etapas dentro de uma capela de fluxo laminar estéril. Os ratos são mantidos sob ciclos claro/escuro de 12 h com livre acesso a comida e água.</li>
	<li>Dissecar o tecido adiposo subcutâneo inguinal de cada camundongo. Retirar apenas o tecido adiposo, evitando a remoção de músculo, pele ou qualquer outro tecido, e coletá-lo em um tubo cônico de 50 mL contendo 15 mL de solução de colagenase tipo 1 (1,5 mg/mL) sobre gelo. Dissolver a colagenase tipo 1 no meio Modified Eagle Medium (DMEM) de alta glicose e albumina de soro bovino (BSA) de Dulbecco e filtrar através de filtros de seringa de 0,2 μm.</li>
	<li>Cortar o tecido adiposo em pequenos pedaços com tesoura cirúrgica estéril e digerir as amostras por incubação com solução de colagenase tipo 1 a 37 °C em agitador orbital (150 rpm) por 30 min (colocar o tubo contendo gordura e colagenase em posição horizontal para uma maior superfície de agitação). Verifique a digestão a cada 10 min para se certificar de que funciona (a degradação do tecido é visível) e para evitar a sobredigestão (ver Figura Suplementar S1).</li>
	<li>Filtrar com uma seringa de tela de 200 μm (previamente autoclavada) para eliminar o tecido não digerido com colagenase. Passe o filtro sobre a borda do tubo para drenar o maior número possível de células para a solução. Adicionar 15 ml de DMEM-1% BSA frio para interromper a digestão e centrifugar a 400 × g durante 10 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar a camada superior contendo adipócitos maduros e a maior parte da camada líquida; Evite tocar ou perturbar o pellet. Adicionar 20 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS)-2% de soro fetal bovino (SFB) e ressuspender o pellet. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire o sobrenadante, aspirando primeiro a camada superior para eliminar os adipócitos e gordura remanescentes. Ressuspender o pellet em 1 mL de tampão lisante cloreto de amônio potássio (ACK) (para lisar hemácias) e incubar em gelo por 5 min. Adicionar 10 mL de PBS-2% FBS, misturar e centrifugar a 400 × g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 μL de solução anti-Fc (purificada de rato anti-camundongo CD16/CD32 diluída em PBS-2% FBS [1:150]) para reduzir a ligação mediada pelo receptor Fc por anticorpos de interesse. Incubar no gelo por 5 min. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 5 mL que se encaixe nos racks pré-resfriados de um separador magnético de células e centrífuga a 400 × g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Elimine o sobrenadante, adicione 200 μL da mistura de CD31(PECAM-1) anticorpo monoclonal (390)-biotina (1:100) e CD45 anticorpo monoclonal (30-F11)-biotina (1:100), misture bem e incube no gelo por 15 min (prepare diluições de anticorpos em solução anti-Fc; ver Tabela 1). Adicionar 400 μL de PBS-2% FBS e centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C. OBS: CD31 e CD45 são marcadores de células endoteliais e hematopoiéticas, respectivamente.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e incubar em 100 μL de microesferas anti-biotina (1:5) durante 15 minutos em gelo (preparar diluições de anticorpos em solução anti-Fc, ver Tabela 1). Adicionar 400 μL de PBS-2% FBS e centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 350 μL de PBS-2% FBS. Remova agregados celulares ou partículas grandes das suspensões unicelulares com um filtro de pré-separação (70 μm). Primeiro, ative o filtro com 100 μL de PBS-2% FBS, passe a suspensão celular através do filtro (colete em um tubo limpo) e, finalmente, lave o filtro com 100 μL de PBS-2% FBS.</li>
	<li>Realizar a separação magnética de células usando a estratégia de separação negativa com um separador magnético de células.<ol><li>Coloque a amostra na posição A do rack de frio (certifique-se de que o rack esteja pré-resfriado) e dois tubos vazios na posição B e C para recuperar as células não marcadas e marcadas, respectivamente.</li>
		<li>Coloque o tampão de lavagem e o tampão de lavagem nos frascos correspondentes antes de ligar o equipamento. Programar o equipamento para realizar a separação magnética das células com o protocolo DEPLETE . NOTA: Este protocolo é para depleção no modo padrão para a remoção de células com expressão normal de antígeno (neste caso, células marcadas com anti-CD31 e anti-CD45), se a recuperação for a prioridade mais alta.</li>
		<li>Na seção de separação , selecione o número de amostras a serem separadas e selecione o protocolo DEPLETE . Pressione Executar e inicie a separação. Ao final do programa, recuperar as células não marcadas e centrifugar a 400 × g por 5 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 500 μL de meio de cultura (Tabela 1).</li>
	<li>Semeando as APCs em um poço de uma placa de 12 poços previamente revestida com 2,5% de matriz de membrana basal (aproximadamente 50.000-75.000 células são obtidas). Adicionar 400 μL de 2,5% de matriz de membrana basal para cobrir toda a superfície de cada poço. Imediatamente após retirar o excesso de solução e deixar apenas uma pequena camada, deixe a placa secar (sem tampa) dentro da capela de fluxo laminar por pelo menos 1 h. Incubar a 37 °C numa atmosfera de 5% de CO2 . Troque o meio a cada 48 h até que as células atinjam 80% de confluência.</li>
	<li>A 80% de confluência, remova completamente o meio e lave com 350 μL de PBS-2% FBS. Colher as células com 350 μL de tripsina-EDTA a 0,05% por 2 min a 37 °C. Adicionar 2 mL de meio de cultura e coletar as células em um novo tubo cônico de 50 mL e, em seguida, centrifugar a 400 × g por 5 min.</li>
	<li>Passagem das APCs para placas de 12 poços (10.000-20.000 células por poço) previamente revestidas com 2,5% de matriz de membrana basal. Incubar a 37 °C com 5% de CO2. Troque o meio a cada 48 h até que as células atinjam 80% de confluência. NOTA: APCs podem ser passados uma vez. Posteriormente, perdem a capacidade de proliferar e se diferenciar. Consulte o fluxo de trabalho para o processo de isolamento de APCs na Figura Suplementar S2.</li>
</ol>2. Diferenciação dos adipócitos e indução da resistência à insulina
NOTA: Manter as células a 37 °C em CO2 a 5% e realizar etapas que envolvem troca de meio e tratamentos com TNF-α e insulina dentro de uma capa estéril.
<ol><li>A 80% de confluência, inicia-se o processo de diferenciação; aspirar qualquer meio de crescimento e substituí-lo por 500 μL de meio de diferenciação (Tabela 1) contendo 3,3 nM de proteína morfogenética óssea (BMP4) em cada poço.</li>
	<li>Após 48 h, substituir o meio pelo meio de diferenciação (500 μL por poço) e pelo coquetel de diferenciação (Tabela 1).</li>
	<li>Retirar o meio 72 h depois e adicionar 100 nM de insulina em 500 μL de meio de diferenciação fresco. NOTA: As células começam a mostrar uma aparência redonda com pequenas gotículas lipídicas dentro.</li>
	<li>Aspirar qualquer meio de diferenciação e substituí-lo por 500 μL de SFB médio simples a 2% (Tabela 1) 48 h mais tarde. Induzir resistência à insulina com 4 ng/mL de TNF-α. Incluir poços de controle sem tratamento com TNF-α.</li>
	<li>Após 24 h de incubação, adicionar 4 ng/mL de TNF-α em SFB simples de 0% (Tabela 1). Manter poços de controle sem tratamento com TNF-α.</li>
	<li>Ativar a via de sinalização da insulina 24 h mais tarde adicionando insulina 100 nM e incubar por 15 min a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 . Retire o meio e lave com 500 μL de PBS. Incluir poços de controle sem tratamento com insulina.</li>
</ol>3. Avaliação da via de sinalização da insulina por western blot
<ol><li>Extração e quantificação de proteínas<ol><li>Lavar cada poço de células com 500 μL de PBS e manter no gelo para lisar as células em 50 μL de tampão RIPA (Tabela 1) contendo 1% de coquetel inibidor de protease adicionado imediatamente antes do isolamento da amostra. Raspar toda a superfície do poço com uma ponta e transferir o lisado para um tubo de microcentrífuga de 0,6 mL (manter no gelo).</li>
		<li>Incubar durante 1 h a 4 °C num agitador rotativo, misturar por vórtice e centrifugar a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C e recuperar o sobrenadante (manter no gelo).</li>
		<li>Determinar a concentração de proteínas utilizando o ensaio de Bradford (não diluir a amostra para quantificar).</li>
		<li>Tomar o volume necessário correspondente a 40-60 μg e desnaturar com tampão Laemmli 6x (Tabela 1) incubando a 97 °C por 15 min enquanto agita a 550 rpm. Congelar até usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS<ol><li>Realizar eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) com gel de poliacrilamida a 7,5% de 1,5 mm de espessura. Inserir o gel no tanque e encher com tampão de corrida (Tabela 1).</li>
		<li>Adicionar 3 μL de proteína padrão pré-configurada ao primeiro poço do gel e carregar cada amostra em poços subsequentes.</li>
		<li>Passe o gel a 80 V por aproximadamente 15 min para garantir que a amostra entre na matriz de gel concentrador de poliacrilamida. Depois disso, aumente a tensão para 90 V por 2,5 h ou até que o marcador de peso molecular de 37 kDa possa ser visto na borda inferior do gel.</li>
		<li>Transferir as proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose em uma câmara semi-seca por 35 min a 25 V. Antes, submergir o gel, a membrana e os filtros em tampão de transferência (Tabela 1) por alguns minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Mancha ocidental<ol><li>Após a transferência, lavar a membrana com solução salina tamponada Tris (TBS) contendo Tween 20 a 0,1% (TBS-T 0,1%) (Tabela 1) por 3 min com agitação a 30 rpm.</li>
		<li>Bloquear a membrana com solução de bloqueio (Tabela 1) a 4 °C durante 1 h em rotação constante.</li>
		<li>Cortar a membrana em três partes de acordo com o marcador de peso molecular para incubar durante a noite com diferentes anticorpos primários (diluídos em solução de bloqueio) a 4 °C em rotação constante: anticorpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda esperada em 180 kDa; Anticorpo do receptor fosfo-insulina β (Tyr1150/1151) (1:1.000), banda esperada em 95 kDa; Anticorpo fosfo-Akt (Ser473) (1:1.000), banda esperada em 60 kDa.</li>
		<li>Lavar as membranas 5x por 5 min cada com TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Incubar as membranas com o anticorpo secundário acoplado à peroxidase correspondente (diluído em solução de bloqueio) durante 2 h à temperatura ambiente em rotação constante: peroxidase affiniPure burro anti-coelho IgG (H+L) (1:5.000).</li>
		<li>Lavar as membranas 5x por 5 min cada com TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Detectar as proteínas usando o sistema de detecção por quimioluminescência. Prepare o substrato de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Coloque a mancha em um saco plástico e adicione 200 μL de substrato quimioluminescente para cobrir completamente a membrana. Escorra o excesso de substrato e remova as bolhas de ar.</li>
		<li>Exponha cada blot por 30-60 s em um sistema de imagem de alto desempenho compatível com quimioluminescência.</li>
		<li>Retirar as membranas (passos 10-13 da seção western blot) para quebrar as interações anticorpo-antígeno e, assim, permitir que as membranas de nitrocelulose sejam re-blotted. Recupere as membranas e lave 3x por 5 min cada com TBS-T 1% a 50 rpm.</li>
		<li>Incubar por 7 min com 10 mL de NaOH 0,2 M a 50 rpm.</li>
		<li>Lave 3x por 5 min cada com água da torneira a 50 rpm.</li>
		<li>Lave por 10 min com TBS-T 1% a 50 rpm.</li>
		<li>Repita os passos 2-9 da seção do western blot para incubar a membrana com tubulina antibeta (55 kDa) como controle de carga usando diluição 1:1.000.</li>
		<li>Realizar análise densitométrica25 para cada proteína utilizando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este trabalho fornece um método para estudar a resistência à insulina que utiliza adipócitos primários em cultura tratada com TNF-α. Esse modelo tem a vantagem de que adipócitos primários podem ser cultivados em condições definidas por longos períodos de tempo com um controle rigoroso dos fatores ambientais celulares26. A duração do ensaio é de 15-20 dias, embora variações na porcentagem de adipócitos diferenciados possam ocorrer entre os experimentos. Os adipócitos primários apresentam vantagens ...

A insulina é um hormônio anabólico produzido pelas células β das ilhotas pancreáticas e o principal regulador do metabolismo da glicose e dos lipídios. Dentre suas diversas funções, a insulina regula a captação de glicose, a síntese de glicogênio, a gliconeogênese, a síntese proteica, a lipogênese e a lipólise1. O sinal molecular inicial após a interação da insulina com seu receptor (IR) é a ativação da atividade intrínseca da tirosina proteína quinase do IR2, resultando em sua autofosforilação3 e na subsequente ativação de uma família de proteínas conhecidas como substratos do receptor de insulina (IRS), que se liga a proteínas adaptadoras levando à ativação de uma cascata de proteínas quinases4 . A insulina ativa duas vias principais de sinalização: fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)-proteína quinase B (AKT) e proteína quinase ativada por mitógeno Ras (MAPK). O primeiro constitui um importante ponto de ramificação ou nó 4,5 para a ativação de numerosos efetores a jusante envolvidos em diversas funções fisiológicas, incluindo a regulação da homeostase do combustível, enquanto o segundo regula o crescimento e diferenciação celular 4,6. As ações da insulina dependem, em última instância, do tipo celular e do contexto fisiológico7.
Um dos principais tecidos metabólicos responsivos à insulina é o tecido adiposo. O tecido adiposo branco é o tipo de gordura mais abundante em humanos e roedores, distribuído na gordura subcutânea (entre a pele e os músculos) e na gordura visceral (ao redor dos órgãos da cavidade abdominal). Dado o seu grande volume, os adipócitos ou células adiposas são o tipo celular mais abundante no tecido adiposo. Essas células adiposas podem ser marrons/beges (termogênicas), róseas (na glândula mamária) ebrancas 8,9. Os adipócitos brancos mantêm as principais reservas energéticas do organismo na forma de triglicerídeos, um processo insulino-dependente. A insulina promove o transporte de glicose e a lipogênese, ao mesmo tempo em que inibe a lipólise ou a degradação lipídica 7,10. Também facilita a diferenciação de pré-adipócitos em adipócitos — as células maduras que armazenam gordura11.
A resistência à insulina ocorre quando um nível normal de insulina produz uma resposta biológica atenuada, resultando em hiperinsulinemia compensatória12. A resistência à insulina é uma condição associada ao sobrepeso e àobesidade5, que quando combinada leva ao diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças metabólicas13. A hiperinsulinemia compensa a resistência à insulina nos tecidos periféricos para manter os níveis glicêmicos normais14. No entanto, eventual perda ou exaustão de células β, juntamente com resistência insulínica exacerbada, leva a níveis elevados de glicose no sangue consistentes com DT25. Portanto, a resistência insulínica e a hiperinsulinemia podem contribuir para o desenvolvimento de doenças metabólicas derivadas da obesidade15. Além disso, a obesidade pode causar inflamação local crônica de baixo grau, promovendo resistência à insulina no tecido adiposo15,16,17. Além disso, alterações no tecido adiposo derivadas da obesidade, como fibrose, inflamação e redução da angiogênese e adipogênese, levam a níveis séricos mais baixos de adiponectina (um sensibilizador de insulina) e aumento da secreção de fatores como inibidor do ativador do plasminogênio 1 (PAI-1), ácidos graxos livres e exossomos na corrente sanguínea, exacerbando a resistência à insulina17.
Muitos aspectos subjacentes à resistência à insulina permanecem desconhecidos. Modelos in vitro e in vivo têm sido desenvolvidos para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina nos principais tecidos-alvo, incluindo o tecido adiposo. A vantagem dos modelos in vitro é que os pesquisadores têm maior controle das condições ambientais e podem avaliar a resistência à insulina em tipos celulares específicos. Particularmente, as células precursoras de adipócitos (APCs) têm o fenótipo individual do tecido doador, o que pode refletir melhor a fisiologia do que as linhagens celulares de adipócitos. Um dos principais fatores indutores de resistência à insulina in vitro é o fator de necrose tumoral-α (TNF-α). O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória secretada por adipócitos e macrófagos no tecido adiposo18. Embora seja necessária para o adequado remodelamento e expansão do tecido adiposo19, a exposição prolongada ao TNF-α induz resistência à insulina no tecido adiposo in vivo e nos adipócitos in vitro20. O tratamento crônico com TNF-α de vários tipos celulares leva ao aumento da fosforilação da serina, tanto do IR quanto do IRS-1, promovendo assim a diminuição da fosforilação da tirosina21. O aumento da fosforilação da IRS-1 sobre resíduos de serina inibe a atividade da tirosina quinase IR e pode ser um dos principais mecanismos pelos quais o tratamento crônico do TNF-α prejudica a ação da insulina22,23. O TNF-α ativa vias envolvendo o inibidor de serina/treonina quinase do fator nuclear ĸB quinase β (IKKβ) e c-Jun N quinase terminal (JNK)24. JNK induz um complexo programa transcricional pró-inflamatório, mas também fosforila diretamente IRS-16.
A compreensão da patogênese da resistência à insulina tem se tornado cada vez mais importante para orientar o desenvolvimento de futuras terapias contra a DM2. As VPAs têm se mostrado um excelente modelo para o estudo da biologia das células adiposas, incluindo a sensibilidade e resistência à insulina, e para a identificação das propriedades intrínsecas dos adipócitos independente do ambiente sistêmico. As APCs podem ser facilmente obtidas de diferentes depósitos adiposos e, sob condições apropriadas, diferenciadas em adipócitos maduros. Com esse método, efeitos diretos sobre a resistência/sensibilidade à insulina podem ser avaliados em adipócitos.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Isolamento de células precursoras de adipócitos de camundongo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing tampon&nbsp;</td><td>Microesferas</td> Anti-Biotina LONZA <td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separador</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana do porão (matrigel)</td> <td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Fator de crescimento</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo Monoclonal (30-F11) - Biotina&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, Tipo 1</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM baixa glicose</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Fator de crescimento</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS mix</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Fator de crescimento</td></tr><tr><td>Ácido linoleico-albumina</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 meio</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp;</td>Filtro de Pré-Separação <td>Peprotech</td><td>315-18 Fator de</td><td>crescimento</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>(70 &micro; m)</td> <td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Rato Purificado Anti-Rato CD16 / CD32&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>2. Diferenciação de adipócitos e indução de resistência à insulina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Coquetel de diferenciação</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>Coquetel de diferenciação</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td>Coquetel de diferenciação</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazona</td><td>Cayman</td><td>71742</td><td>Coquetel de diferenciação</td></tr><tr><td>TNF&alpha;</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><forte>3. Avaliação da via de sinalização da insulina por western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-tubulina beta</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>Tampão Laemmli</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Tampão RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>Tampão RIPA</td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>FluorChem EProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>Buffer de corrida e transferência</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>2- mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>Buffer</td></tr> <tr><td>de transferênciaNaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>BioRad</td><td>Solução de bloqueio</td><td>de 1706404</td></tr><tr><td>Proteína padrão prestada&nbsp;</td><td></td><td>Coquetel de</td> inibidores de protease 1610395 <td></td>BioRad</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>Receptor de Fosfo-Insulina &beta; &nbsp;</td><td>Anticorpo de sinalização celular</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) Anticorpo</td> de <td>sinalização celular</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-IRS1 (Tyr608)</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>tampão RIPA</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>Buffer de corrida e laemmli</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Substrato quimioluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>Buffer, execução, transferência e laemmli</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>Tampão RIPA - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

A resistência à insulina é um efeito reduzido da insulina sobre suas células-alvo, geralmente derivado da diminuição da sinalização dos receptores de insulina. A resistência à insulina contribui para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (DM2) e outras doenças derivadas da obesidade de alta prevalência em todo o mundo. Portanto, a compreensão dos mecanismos subjacentes à resistência à insulina é de grande relevância. Vários modelos têm sido utilizados para estudar a resistência à insulina tanto in vivo quanto in vitro; Os adipócitos primários representam uma opção atraente para estudar os mecanismos de resistência à insulina e identificar moléculas que neutralizam essa condição e os alvos moleculares de drogas sensibilizadoras de insulina. Neste trabalho, estabelecemos um modelo de resistência insulínica utilizando adipócitos primários em cultura tratada com fator de necrose tumoral α (TNF-α).
As células precursoras de adipócitos (APCs), isoladas do tecido adiposo subcutâneo de camundongos digerido pela colagenase por tecnologia de separação magnética celular, são diferenciadas em adipócitos primários. A resistência à insulina é então induzida pelo tratamento com TNF-α, uma citocina pró-inflamatória que reduz a fosforilação/ativação da tirosina dos membros da cascata de sinalização da insulina. A diminuição da fosforilação do receptor de insulina (IR), substrato do receptor de insulina (IRS-1) e proteína quinase B (AKT) são quantificados por western blot. Este método fornece uma excelente ferramenta para estudar os mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo.

Nos últimos anos, o aumento da prevalência de obesidade e DM2 tem motivado uma intensa busca pelos mecanismos mediadores da resistência à insulina no tecido adiposo. Com o protocolo aqui descrito, as VPAs podem ser diferenciadas em adipócitos maduros para avaliar a resistência e a sensibilidade à insulina. Uma vez que as VPAs atingem a confluência, são necessários 10 dias para completar sua diferenciação em adipócitos maduros e sua indução de resistência à insulina mediada pelo TNF-α (Figura 1</stron...

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

A resistência insulínica pode ser avaliada em adipócitos primários, permitindo o estudo de doadores sob diferentes contextos fisiopatológicos, como magros versus obesos, ou células de diferentes depósitos de gordura. Os adipócitos primários mantêm muitas de suas propriedades intrínsecas e podem ser cultivados sob condições definidas por um longo período de tempo, com um controle rigoroso dos fatores ambientais celulares. Para iniciar o processo de diferenciação, as células devem estar a 80% de confluência.Se a diferenciação começa em uma confluência menor ou maior, as células se diferenciarão menos ou perderão sua capacidade de diferenciação. Após sacrificar o animal, desinfete os camundongos esfregando com etanol 70%. Dissecar o tecido adiposo subcutâneo inguinal de cada camundongo e coletá-lo em um tubo cônico de 15 mililitros, contendo 15 mililitros de solução de colagenase tipo um sobre gelo.Cortar o tecido adiposo em pequenos pedaços com tesoura cirúrgica estéril e digerir as amostras por incubação com solução de colagenase tipo um a 37 graus Celsius em um agitador orbital a 150 RPM por 30 minutos. Verifique a digestão a cada 10 minutos para garantir que funcione e evitar a digestão excessiva. Filtrar usando uma seringa de malha de 200 micrômetros para eliminar o tecido não digerido com colagenase e passar o filtro sobre a borda do tubo para drenar o maior número possível de células para a solução.Adicione 15 mililitros de DMEM 1% BSA frio para interromper a digestão e centrifugar a 400 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Aspirar a camada superior contendo adipócitos maduros e a maior parte da camada líquida. Adicione 20 mililitros de PBS 2% FBS frio e ressuspenda o pellet.Após centrifugar novamente por cinco minutos, retirar o sobrenadante aspirando a camada superior para eliminar os adipócitos e gordura restantes. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão lisante ACK. Incubar no gelo por cinco minutos.Adicione 10 mililitros de PBS 2% FBS e misture. Após centrifugar por cinco minutos e aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 200 microlitros de solução anti-FC. Incubar no gelo por cinco minutos e transferir a suspensão celular para um tubo de cinco mililitros que se encaixa nos racks pré-resfriados de um separador magnético de células.Após centrifugar por cinco minutos e eliminar o sobrenadante, adicionar 200 microlitros da mistura de biotina do anticorpo monoclonal CD 31 e biotina do anticorpo monoclonal CD 45. Misture bem e incube no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione 400 microlitros de PBS 2% FBS e centrifugar novamente a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Aspirar o sobrenadante e incubá-lo em 100 microlitros de microesferas anti-biotina por 15 minutos no gelo. Adicione 400 microlitros de PBS 2% FBS e centrifugar novamente a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius, como mostrado anteriormente. Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 350 microlitros de PBS 2% FBS.Para remover os agregados celulares, ou partículas grandes, das suspensões de célula única com um filtro de pré-separação de 70 micrômetros, ative o filtro com 100 microlitros de PBS 2% FBS. Passe a suspensão da célula através do filtro e colete-a em um tubo limpo. Em seguida, lave o filtro com 100 microlitros de PBS 2%FBS.Para realizar a separação magnética das células utilizando a estratégia de separação negativa, coloque a amostra na posição A do rack refrigerado e dois tubos vazios nas posições B e C para recuperar as células não marcadas e marcadas. Em seguida, carregue o tampão de lavagem e o tampão de execução nos frascos correspondentes. Na seção de separação, selecione o número de amostras a serem separadas e selecione o protocolo de esgotamento.Pressione executar e inicie a separação. No final do programa, recupere as células não marcadas. Em seguida, revestir uma placa de 12 poços com matriz de membrana basal adicionando 400 microlitros de matriz de membrana basal de 2,5% para cobrir toda a superfície de cada poço.Retire o excesso de solução e deixe a placa secar dentro da capela de fluxo laminar por pelo menos uma hora. Após centrifugar por cinco minutos e descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet em 500 microlitros de meio de cultura. Semeando as células precursoras dos adipócitos, ou APCs, em um poço da placa de 12 poços previamente revestida com matriz de membrana basal de 2,5%.Incubar a 37 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% e trocar o meio a cada 48 horas até que as células atinjam 80% de confluência. Depois de remover completamente o meio, lave as células com 350 microlitros de PBS 2% FBS. Colher as células com 350 microlitros de 0,05% de EDTA por dois minutos a 37 graus Celsius e adicionar dois mililitros de meio de crescimento.Recolher as células num novo tubo cónico de 50 mililitros e centrifugar a 400 G durante cinco minutos. Passar as APCs para placas de 12 poços, previamente revestidas com matriz de membrana basal de 2,5%, e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque o meio a cada 48 horas até que as células atinjam 80% de confluência.A 80% de confluência, aspirar qualquer meio de crescimento e substituí-lo por 500 microlitros de meio de diferenciação, contendo 3,3 nanomolares de proteína morfogenética óssea em cada poço. Após 48 horas, substituir o meio por 500 microlitros por meio de diferenciação de poço, e o coquetel de diferenciação. Retirar o meio 72 horas depois e adicionar 100 nanomolares de insulina em 500 microlitros de meio de diferenciação fresco.48 horas depois, induzir resistência à insulina com quatro nanogramas por mililitro de fator de necrose tumoral alfa, ou TNF alfa. Aspirar qualquer meio de diferenciação e substituí-lo por 500 microlitros de meio simples 2% FBS com TNF alfa. Após incubar por 24 horas, adicionar quatro nanogramas por mililitro de TNF alfa em um meio simples 0% FBS.Ativar a via de sinalização da insulina 24 horas depois, adicionando insulina nanomolar 100 e incubar por 15 minutos a 37 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5%, como mostrado anteriormente. Após a incubação, retire o meio e lave com 500 microlitros de PBS, inclua um poço controle sem o tratamento com insulina. Extrair proteína e medir a fosforilação de marcadores de sinalização de insulina por Western blot.Células precursoras de adipócitos subcutâneos a 80% de confluência antes de induzir diferenciação nas placas de cultura de 12 poços e adipócitos primários após sete dias de indução da diferenciação são mostrados nesta figura. A resistência insulínica induzida pelo TNF alfa nos adipócitos primários subcutâneos foi demonstrada pela diminuição da fosforilação induzida pela insulina do receptor de insulina, do substrato um do receptor de insulina e da proteína quinase B ou AKT. A membrana foi sondada com anti-receptor de insulina fosforilada, substrato anti-receptor de insulina fosforilada, AKT antifosforilada e anti-beta tubulina foi usada como controle de carga.O sinal foi visualizado com detecção por quimioluminescência. As manchas representativas e a quantificação a partir de três experimentos independentes são mostradas aqui. Ao tentar esse procedimento, uma coisa que precisa ser cuidada é que a indução de resistência à insulina com TNF alfa é com SFB a 2% por 24 horas e com SFB a 0% nas últimas 24 horas.

differentiated-mouse-adipocytes-primary-culture-model-insulin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra a diferenciação das células estromais da medula óssea (BMSCs) em adipócitos. No processo de duas etapas, na presença de fatores de crescimento e hormônios específicos, as BMSCs indiferenciadas primeiro se diferenciam em pré-adipócitos. A segunda etapa envolvendo o tratamento com glicose e insulina leva à formação de adipócitos maduros com múltiplas gotículas lipídicas.

Diferenciação de células estromais da medula óssea de camundongos in vitro em adipócitos

Principais pré-adipócitos brancos isolados de tecidos adiposos brancos em ratos podem ser diferenciadas em células bege / brite. Apresentado aqui é um sistema modelo celular fiável para estudar a regulação molecular de "escurecimento" da gordura branca.

Isolamento e diferenciação de células estromais vasculares para Células Bege / Brite

A cultura agregada madura de membrana (MAAC) é um novo método para cultivar adipócitos humanos maduros. Aqui detalhamos como isolar adipócitos do adipose humano e como configurar o MAAC.

Isolamento e Cultura de Adipócitos Maduros Humanos Usando culturas agregadas de adipócitomaduros de membrana (MAAC)

Apresentado aqui é um protocolo para fornecer oligonucleotídeos como RNA de pequena interferência (siRNA), imitações de micro-RNA (miRs) ou anti-micro-RNA (anti-miR) em adipócitos maduros para modular proteína e expressão micro-RNA.

Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Este procedimento descreve um método para o isolamento e cultura do órgão murino de Corti com ou sem o limbo espiral e neurônios do gânglio espiral. Nós também demonstrar um método para a expressão de um gene exógeno repórter no órgão de Corti explante por eletroporação.

Cultura primária e Eletroporação Plasmid do Órgão de Corti murino.

Modelos animais ortotópico de câncer de ovário replicar melhor as doenças humanas e, portanto, melhorar nosso entendimento sobre a progressão do câncer e da resposta do tumor à terapia. Um modelo de camundongo recebe uma injeção de intrabursal luciferase células que expressam tumor de ovário. O tratamento é administrado através de gavagem oral. O crescimento do tumor é monitorado...

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Aprenda a isolar e diferenciar adipócitos primários de camundongos para estudar resistência à insulina. Este protocolo demonstra indução de resistência com TNF-alpha e análise de fosforilação por Western blot.

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

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