Fabricação e Caracterização de Nano-Matriz de Base Janus Camada por Camada para Promover a Regeneração da Cartilagem

Summary

Este protocolo descreve a montagem de um andaime de nanomatriz de base Janus (JBNm) camada por camada, adicionando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e Fator de Crescimento Transformador Beta-1 (TGF-β1) sequencialmente. O JBNm foi fabricado e caracterizado; além disso, apresentou excelente bioatividade, estimulando funções celulares como adesão, proliferação e diferenciação.

Abstract

Vários andaimes de biomateriais foram desenvolvidos para orientar a adesão e proliferação celular, na esperança de promover funções específicas para usos in vitro e in vivo. A adição de fatores de crescimento a esses andaimes de biomateriais é geralmente feita para fornecer um ambiente ideal de cultura celular, mediando a diferenciação celular e suas funções subsequentes. No entanto, os fatores de crescimento em um andaime de biomaterial convencional são tipicamente projetados para serem liberados após a implantação, o que pode resultar em efeitos colaterais não intencionais no tecido ou nas células circundantes. Aqui, a nanomatriz de base Janus inspirada no DNA (JBNm) alcançou com sucesso um microambiente altamente localizado com uma estrutura camada por camada para construções de tecido cartilaginoso autossustentáveis. Os JBNms são auto-montados a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e fator de crescimento transformador beta-1 (TGF-β1) via bioafinidade. O JBNm foi montado na proporção TGF-β1:matrilina-3:JBNt de 1:4:10, pois esta foi a razão determinada na qual a montagem adequada na estrutura camada por camada poderia ocorrer. Primeiramente, a solução de TGF-β1 foi adicionada à solução de matrilina-3. Em seguida, esta mistura foi pipetada várias vezes para garantir homogeneidade suficiente antes da adição da solução JBNt. Isso formou o JBNm camada por camada, depois de pipetar várias vezes novamente. Uma variedade de experimentos foi realizada para caracterizar a estrutura JBNm camada por camada, JBNts sozinho, matrilina-3 sozinho e TGF-β1 sozinho. A formação do JBNm foi estudada com espectros de absorção UV-Vis, e a estrutura do JBNm foi observada com microscopia eletrônica de transmissão (MET). À medida que o inovador andaime JBNm camada por camada é formado em escala molecular, o JBNm marcado com corante fluorescente pôde ser observado. O TGF-β1 é confinado dentro da camada interna do JBNm injetável, o que pode impedir a liberação de fatores de crescimento para áreas circundantes, promover condrogênese localizada e promover um microambiente anti-hipertrófico.

Introduction

Os andaimes na engenharia de tecidos desempenham um papel vital no fornecimento de suporte estrutural para a fixação celular e subsequente desenvolvimento tecidual¹. Normalmente, as construções de tecidos convencionais sem qualquer andaime dependem do ambiente de cultura celular e adicionam fatores de crescimento para mediar a diferenciação celular. Além disso, essa adição de moléculas bioativas em andaimes é frequentemente a abordagem preferida para orientar a diferenciação e a função celular ^2,3. Alguns andaimes podem imitar o microambiente bioquímico dos tecidos nativos de forma inde....

Protocol

1. Síntese dos JBNts

1. Preparar o monômero JBNt utilizando métodos previamente publicados, envolvendo a síntese de uma variedade de compostos¹².
2. Purificar o monómero bruto JBNt depois de ter sido sintetizado com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando uma coluna de fase reversa. Use o solvente A: 100% água, o solvente B: 100% acetonitrila e o solvente C: solução de água HCl com pH = 1. Use uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Coletar o maior pico obtido na HPLC aos 7,2 min.

2. Fabricação para JBNt/Matn1/TGF-β1 (Vídeo 1)

N....

Results

Seguindo o protocolo, os JBNts foram sintetizados com sucesso e caracterizados com absorção de UV-Vis e MET. O JBNm é um andaime sólido injetável que passa por um rápido processo biomimético. Após a adição de JBNts a uma mistura de solução de TGF-β1/matrilina-3 em ambiente fisiológico, formou-se um andaime sólido de malha branca, indicando a montagem bem-sucedida do JBNm, como pode ser observado na Figura 1. Isso foi demonstrado nos métodos de caracterização.

Em c.......

Discussion

O objetivo deste estudo é desenvolver uma plataforma de andaimes biomiméticos, o JBNm, para superar as limitações dos construtos teciduais convencionais que dependem de ambientes de cultura celular para mediar a diferenciação celular. O JBNm é um andaime de estrutura camada por camada para uma construção de tecido cartilaginoso autossustentável. O design inovador é baseado em novos nanomateriais inspirados no DNA, os JBNts. O JBNm, composto por JBNts³⁰, TGF-β1 e matrilina-3, é montado através de u.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermo Fisher	50062Z	soro da cabra de 10%	usado para obstruir ações inespecíficas do ligamento do anticorpo durante a coloração.
Placa de 24 poços	Corning	07-200-740	Placa de 24 poços usada para cultura celular comparativa.
Placa preta não tratada de 384 poços	Thermo Fisher	262260	Placa de 384 poços usada para medições de absorção.
Tampa de vidro com câmara de 8 poços	Thermo Fisher	155409PK	Tampa de 8 poços usada para cultura celular comparativa.
Corning	07-200-91	de fundo plano de 96 poços	Placa de 96 poços usada para cultura celular comparativa.
Placa de 96 poços Thermo	Fisher	260895	placa de 96 poços usada para cultura e análise de células comparativas.
Gel de agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Hidrogel usado para cultura de células.
Gel de agarose	Sigma Aldrich	A9539	Hidrogel usado como ambiente para cultura de células.
Kit de Rotulagem de Proteínas em Microescala Alexa Fluor	Thermo Fisher	A30006 (488) e A30007 (555)	Corante fluorescente usado para marcar proteínas.
Anticorpo anti-colágeno X	Thermo Fisher	41-9771-82	Anticorpo usado para manchar o colágeno-X.
Máquina de PCR Bio-Rad	Bio-Rad		usado para realizar PCR em amostras.
Células de linha			usadas para analisar as habilidades proliferativas de várias amostras.
Kit de contagem de células 8	Milipore Sigma	96992	Ensaio de proliferação celular.
Cell Profiler	Broad Institute		Software usado para analisar imagens de células.
Criostato Microtomático			Equipamento usado para produzir segmentos finos de amostras para uso em coloração e microscopia.
DAPI	Invitrogen	D1306	Coloração fluorescente azul que se liga a regiões de DNA de adenina-timina.
Cubetas descartáveis	FISHER Scientific	14-955-128	Recipiente utilizado para espectrofotometria.
Meio de cultura de células DMEM	Thermo Fisher	10566032	Meio usado para apoiar o crescimento celular.
Soro bovino fetal	GIBCO	A4766801	Soro usado em meio de cultura celular para apoiar o crescimento celular.
Meio de Montagem Fluoromount-G	Thermo Fisher	00-4958-02	Solução usada para montar lâminas para imunocoloração.
Composto de formaldeído			usado para fixar amostras antes da microtomagem.
Anticorpo secundário altamente adsorvido anti-coelho de cabra IgG (H+L) Anticorpo secundário Thermo	Fisher	A16110	usado para coloração de proteínas.
Células-tronco mesenquimais humanas	LONZA	PT-2501	Células usadas para analisar habilidades diferenciativas de várias amostras.
Meio condrogênico de haste mesenquimal humana	LONZA	PT-3003	Meio celular usado para promover a diferenciação condrogênica.
ImageJ	National Institutes of Health		Software de análise de imagens usado em conjunto com microscopia.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit	BioRad	1725150	Kit usado para PCR.
Nanotubos à base de Janus (JBNts)			Nanotubo feito de nucleobases sintéticas para atuar como ferramenta de andaime celular.
LaB6 20-120 kV Microscópio Eletrônico de Transmissão	Tecnai		Equipamento utilizado para realizar microscopia eletrônica de transmissão em uma amostra.
MATLAB	MathWorks		Software estatístico utilizado para modelagem e análise de dados.
Matrilina-3	Fisher Scientific	3017MN050	Proteína estrutural usada como locais de adesão para condrócitos.
Espectrofotômetro NanoDrop	Thermo Fisher		Equipamento usado para medir os valores de absorção de uma amostra.
Microscópio Confocal Espectral Nikon A1R	Nikon	A1R HD25	usado para analisar amostras.
Número 1.5 Tampa de Vidro da Câmara	Thermo Fisher	152250	Ambiente para cultura de células estéreis e imagem.
Composto de temperatura de corte ideal Composto reagente			usado para incorporar células antes da microtomagem.
Paraformaldeído	Thermo Scientific	AAJ19943K2	Composto usado para fixar células.
PDC-32G Plasma Cleaner	Harrick Plasma		Cleaner usado para preparar grades antes da microscopia eletrônica de transmissão.
penicilina-estreptomicina	GIBCO	15-140-148	Agente antibiótico usado para desencorajar o crescimento bacteriano durante a cultura de células.
Solução salina tamponada com fosfato	Thermo Fisher	10010023	usada para lavar o meio celular e atuar como um tampão durante a experimentação.
rodamina-faloidina	Invitrogen	R415	F-Actin.
Rneasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904	Kit utilizado para filtrar e homogeneizar amostras durante a extração de RNA.
Solução			sacarose Solução usada para processar amostras antes da microtomagem.
Kit ELISA Humano TGF beta-1	Invitrogen	BMS249-4	Kit de ensaio usado para determinar a presença de TGF-β 1 em uma amostra.
TGF-β 1	PEPROTECH	100-21C	Fator de crescimento utilizado para estimular a diferenciação e proliferação condrogênica.
Triton-X	Invitrogen	HFH10	Composto usado para lisar células não fixadas durante o processo de coloração.
Reagente TRIzol	Thermo Fisher	15596026	Reagente usado para isolar RNA.
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		Equipamento usado para medir os valores de potencial zeta de uma amostra.