Detecção e quantificação de nanotubos de tunelamento usando imagens de visualização de volume 3D

Summary

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são principalmente nanotubos de membrana de actina F abertos que conectam células vizinhas, facilitando a comunicação intercelular. A característica notável que distingue os TNTs de outras saliências celulares é a natureza flutuante dos nanotubos entre as células. Aqui, caracterizamos os TNTs construindo uma visão de volume 3D de imagens confocais z-stack.

Abstract

Descobertas recentes revelaram que as células realizam transferência intercelular direta, de longo alcance, através de conduítes de membrana de actina em nanoescala, ou seja, "nanotubos de tunelamento" (TNTs). Os TNTs são definidos como extensões de membrana abertas e circundadas por bicamadas lipídicas que medeiam a continuidade entre células vizinhas de diâmetros que variam entre 50 nm e 1 μm. Os TNTs foram demonstrados inicialmente em células neuronais, mas estudos sucessivos revelaram a existência de TNTs em vários tipos celulares e doenças, como doenças neurodegenerativas, infecções virais e câncer. Vários estudos se referiram a nanoestruturas de membrana fechadas e eletricamente acopladas entre células vizinhas como TNTs ou estruturas semelhantes a TNT.

A elucidação da ultraestrutura em termos de continuidade da membrana no desfecho é tecnicamente desafiadora. Além disso, estudos sobre comunicação célula-célula são desafiadores em termos de caracterização de TNTs usando métodos convencionais devido à falta de marcadores específicos. Os TNTs são definidos principalmente como saliências de membrana abertas à base de F-actina. No entanto, uma grande limitação é que a F-actina está presente em todos os tipos de saliências, tornando desafiador diferenciar TNTs de outras saliências. Uma das características notáveis dos TNTs à base de actina F é que essas estruturas pairam entre duas células sem tocar o substrato. Portanto, TNTs distintos corados com F-actina podem ser convenientemente distinguidos de outras saliências, como filópodes e neurites, com base em seu pairar entre as células.

Recentemente, mostramos que a internalização da amilóide-β_{oligomérica 1-42} (oAβ) via endocitose dependente de actina estimula a quinase-1 ativada por p21 ativada (PAK1), que medeia a formação de TNTs contendo F-actina coexpressos com fosfo-PAK1 entre células neuronais SH-SY5Y. Este protocolo descreve um método de análise de volume 3D para identificar e caracterizar TNTs a partir das imagens capturadas de z-stack de protuberâncias de membrana imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 em células neuronais tratadas com oAβ. Além disso, os TNTs distinguem-se do desenvolvimento de neurites e excrescências neuronais com base em condutos de membrana imunocorados de tubulina F-actina e β-III.

Introduction

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são condutos de membrana à base de actina F, principalmente abertos, e desempenham um papel vital na transferência intercelular de carga e organelas¹. A característica única dos TNTs é que eles conectam células vizinhas sem qualquer contato com o substrato; têm mais de 10-300 μm de comprimento e os seus diâmetros variam entre 50 nm a 1 μm ^2,3. Os TNTs são estruturas transitórias e sua vida útil dura entre alguns minutos a várias horas. Os TNTs foram demonstrados pela primeira vez em células neuronais^{PC12 1}; posteriormente, numerosos estudos mostraram sua existência em vários tipos celulares in vitro e in vivo ^4,5. Diversos estudos têm revelado a significância patológica dos TNTs em diversos modelos de doenças, como doenças neurodegenerativas, câncer e infecções virais ^6,7,8.

As heterogeneidades estruturais dos TNTs têm sido demonstradas por diversos estudos em diversos sistemas celulares⁹. As diferenças são baseadas na composição do citoesqueleto, no mecanismo de formação e nos tipos de carga transferidos¹⁰. Primeiramente, considera-se que a continuidade da membrana aberta e positiva para F-actina que paira entre duas células vizinhas e transfere organelas consiste em TNTs¹¹. No entanto, a falta de clareza ou diversidade observada na formação de TNTs aumenta a dificuldade no desenvolvimento de marcadores específicos de TNT. Assim, é difícil identificar estruturas de TNT por métodos convencionais de detecção e distinguir nanotubos de membrana em termos de saliências abertas e fechadas¹². No entanto, a característica dos TNTs pairarem como saliências de membrana de actina F entre duas células é relativamente mais fácil e mais viável de identificar usando técnicas de imagem convencionais. Outras saliências celulares à base de actina, como filópodes e filópodes dorsais, não podem pairar entre duas células distantes, particularmente quando as células são fixas. É importante ressaltar que neurites em desenvolvimento fechadas, eletricamente acoplados e são frequentemente denominados estruturas semelhantes ao TNT¹³.

Sabe-se que a F-actina desempenha um papel importante na formação de TNT, e vários estudos têm demonstrado que o inibidor de F-actina citocalasina D inibe a formação de TNTs^14,15. Em contraste, os inibidores dos microtúbulos não têm qualquer efeito sobre a formação de TNT¹⁶. Nas últimas 2 décadas, houve vários relatos sobre o papel significativo que os TNTs desempenham na disseminação da patologia e da resistência e terapia tumoral¹⁷. Portanto, há uma demanda interminável por melhores técnicas para caracterização do TNT.

A falta de marcadores específicos de TNTs e a diversidade na morfologia e composição citoesquelética dificultam o desenvolvimento de um método único de caracterização. Alguns estudos têm utilizado técnicas automatizadas de detecção de imagens e quantificação de TNT^18,19. No entanto, existem várias vantagens do atual método de análise manual de volume 3D sobre a análise automática de imagens para a detecção e quantificação de TNTs. Muitas vezes, os olhos humanos treinados podem detectar essas nanoestruturas pairando mais facilmente do que um método automatizado de detecção de imagem. Além disso, os métodos de detecção automática podem ser difíceis de implementar em laboratórios sem experiência em algoritmos. O presente método poderia ser amplamente adotado pelos pesquisadores devido à sua precisão e reprodutibilidade.

Em um estudo recente, mostramos que a oAβ promove a biogênese de TNTs em células neuronais por meio de um mecanismo de endocitose mediado por PAK1, dependente de^actina12. TNTs induzidos por oAβ também expressam PAK1 ativado (ou fosfo-PAK1). Desenvolvemos um método de reconstrução de imagem de visão de volume 3D para distinguir TNTs imunocorados por oAβ, F-actina e fosfo-PAK1. β-III tubulina positiva, neurites em desenvolvimento muitas vezes se assemelham a estruturas flutuantes semelhantes a TNT²⁰. Assim, distinguimos ainda mais os TNTs à base de F-actina dos neurites positivos para tubulina β-III e de outras saliências semelhantes ao TNT. Imagens de visualização de volume 3D têm sido usadas para identificar TNTs com base em suas características de pairar sobre o substrato e permanecer conectado entre duas células vizinhas. Este trabalho descreve a identificação e detecção de condutos de membrana contendo actina ou TNTs usando imagens confocais z-stack e, finalmente, quantificação manual das estruturas identificadas a partir de imagens de reconstrução de visualização de volume 3D. O método apresentado não pode distinguir TNTs próprios abertos de estruturas semelhantes a TNT fechadas; este método ajuda a identificar TNTs em cultura de células 2D in vitro em um substrato plano. No entanto, o método é fácil de implementar e reproduzir e pode ser amplamente utilizado para a quantificação precisa de apenas TNTs à base de actina e para distingui-los de neurites e estruturas β-tubulina positivas semelhantes a TNT.

Protocol

NOTA: As células SH-SY5Y cultivadas em meio DMEM/F-12 foram diferenciadas com ácido retinóico de 10 μM por 7 dias e tratadas com oligômeros de 1 μM oAβ por 2 h a 37 °C (5% de CO₂). Após o tratamento, as células foram fixadas com solução fixadora de Karnovsky e duplamente imunocoradas com anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina ligadora de F-actina. Posteriormente, imagens confocais de pilha z foram obtidas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Os TNTs foram quantificados por contagem manual e distinguidos de outras neurites/saliências celulares por meio da construção de imagens de visualização de volume 3D e identificação das estruturas a partir de sua característica de pairar entre duas células sem tocar o substrato (Figura 1).

1. Cultura e diferenciação celular

1. Cultura das células neuronais SH-SY5Y em meio DMEM/F12 (Ham) 1:1 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de mistura de penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN). Semeia as células em um prato de imagem de 35 mm com um poço de 14 mm composto por uma tampa # 1.5 no centro do prato preso ao fundo. Semeia as células na placa de imagem a uma concentração de 12.000 células/^cm2 e realize os experimentos com 60% a 70% de confluência.
2. Diferenciar parcialmente as células com ácido retinóico (AR) de 10 μM de uma solução-mãe de 100 mM (5 mg de AR em 15 mL de dimetilsulfóxido [DMSO]). Em seguida, incubar as células por 7 dias a 37 °C (5% de CO 2) para diferenciação com mudança de meio a cada₂ dias.
   NOTA: Tenha cuidado ao manter a confluência (60%-70%) das células (células indiferenciadas e parcialmente diferenciadas). A densidade celular pode influenciar a formação de TNTs entre as células.

2. Preparação de oligômeros de β_{amiloide 1-42} (oAβ) para tratar células neuronais

1. Dissolver Aβ _1-42 (1 mg) em 200 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol e dividir a solução em 20 alíquotas, cada uma contendo 0,05 mg de péptidos. Liofilizar e armazenar as alíquotas a -20 °C para utilização posterior.
2. Preparar a _{solução-mãe} (5 mM) do Aβ _1-42 liofilizado em DMSO adicionando 2,2 μL de DMSO a 0,05 mg de péptido liofilizado. Para dissolver cuidadosamente os peptídeos, vortex a solução e sonicate por 2 min em um sonicator de banho de água.
3. Diluir a solução-mãe até uma concentração de 100 μM em DMEM, pH 7,4 e vórtice para converter os peptídeos em monômeros, seguida de incubação a 4 °C por 24 h para obtenção de oligômeros de Aβ _1-42 (oAβ)^12,21,22.
4. Caracterizar oAβ antes dos experimentos como relatado anteriormente^21,22 por microscopia eletrônica de transmissão.
5. Trate as células SH-SY5Y parcialmente diferenciadas com 1 μM oAβ. Remova o meio antes dos tratamentos e adicione DMEM fresco sem FBS. Após a mudança do meio, adicionar oAβ previamente preparado (100 μM) ao meio até uma concentração final de 1 μM. Incubar as células com 1 μM oAβ durante 2 h a 37 °C (5% CO₂). Inclua um controle negativo na forma de células não tratadas.

3. Imunocoloração de F-actina e PAK1 ativada para caracterização de TNTs

1. Realize imunocoloração diferencial usando o anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina falotoxina ligadora de F-actina.
2. Lavar as células de controle e as células tratadas com oAβ com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 2 x 2 min antes da fixação. Preparar a solução fixadora de Karnovsky utilizando fixador de formalina a 2% e glutaraldeído a 2,5% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2. Em seguida, fixe as células no prato de imagem adicionando a solução fixadora de Karnovsky (apenas o suficiente para cobrir as células) por 45 minutos à temperatura ambiente.
3. Lave as células fixas 2 x 2 min usando tampão de incubação. Preparar o tampão de incubação (20x) dissolvendo 0,1 g de saponina em 5 mL de FBS e diluir para 1x adicionando 95 mL de 1x PBS.
4. Após a fixação, adicionar o primeiro anticorpo contra o fofo-PAK1 a uma diluição de 1:250 no tampão de incubação e incubar durante a noite a 4 °C numa câmara húmida escura.
5. No dia seguinte, após 24 h de incubação, lavar as células 2 x 2 min com o tampão de incubação; em seguida, adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 (diluição 1:1.000) e à faloidina 555 (diluição 1:1.000). Incubar as células na câmara escura húmida durante 1,5 h à temperatura ambiente.
6. Após a incubação, lave as células 2 x 2 min com tampão de incubação. Coloração do núcleo adicionando 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em uma diluição de 1:2.000 e incubar por 5 min a 10 min à temperatura ambiente no escuro.
7. Prepare o meio de montagem DABCO usando 25 mg de DABCO em 90% de glicerol e 10% 1x PBS. Para dissolver corretamente, ajuste o pH para 8,6 usando o grau espectrofotométrico, dilua o HCl (diluído 1:20 com água) e mantenha a solução em um balancim para mistura.
8. Como agente antibranqueador, adicione o meio de montagem DABCO diretamente no prato de imagem que contém a tampa na parte inferior. Aguarde pelo menos 1-2 h e prossiga diretamente para a realização de imagens confocais.
   NOTA: Não são necessários adesivos para fixar as tampas.

4. Imunocoloração de F-actina e tubulina β-III para distinguir TNTs de neurites

1. Realizar imunocoloração diferencial com anticorpo de tubulina β-III e falotoxina faloidina ligadora de F-actina.
2. Lave as células tratadas com oAβ 2x com 1x PBS antes de adicionar a solução fixadora de Karnovsky. Incubar as células por 45 min à temperatura ambiente e lavar as células 2 x 2 min com tampão de incubação.
3. Após a fixação, adicionar o anticorpo contra a tubulina β-III (TUBb3) a uma diluição de 1:250 no tampão de incubação e incubar a 4 °C durante a noite na câmara húmida escura.
4. No dia seguinte, lave as células com tampão de incubação (2 x 2 min) e adicione anticorpos secundários conjugados ao Alexa Fluor 488 (diluição 1:1.000) e à faloidina 555 (diluição 1:1.000) juntos ao mesmo prato. Em seguida, incubar as células por 1,5 h à temperatura ambiente na câmara escura e úmida.
5. Lave as células 2x com tampão de incubação e adicione DAPI de coloração nuclear em uma diluição de 1:2.000 por 5-10 min à temperatura ambiente no escuro.
6. Adicione o agente antibranqueamento DABCO no meio de montagem, conforme mencionado acima, e aguarde 2 horas antes da imagem.

5. Imagem com microscopia confocal

1. Para identificar TNTs, capture imagens z-stack de células imunocoradas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Tire as imagens usando a objetiva DIC de óleo 40x/1.40 com DAPI, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e conjuntos de filtros de tetrametilrodamina (TRITC).
2. Primeiro, selecione os canais clicando nos lasers necessários sequencialmente nas janelas Faixa 1, Faixa 2 e Faixa 3 no software confocal. Clique na opção T-PMT abaixo da janela Faixa 1 para obter as imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) com canais de fluorescência.
   NOTA: As imagens DIC são capturadas por um detector diferente rotulado como T-PMT.
3. Selecione a guia de aquisição do software, clique na guia Z-stack e aguarde a abertura de uma janela. Em seguida, clique em varredura ao vivo para focar as células na parte inferior do prato. Selecione essa imagem focada como a primeira pilha. Em seguida, concentre-se para ver a parte superior da célula e selecione-a como a última pilha. Pare a varredura ao vivo e clique no número ao lado da guia ideal para corrigir o tamanho da etapa das pilhas. O tamanho da etapa determina o número de fatias e os intervalos com base na espessura das células.
   NOTA: O tamanho da etapa será selecionado com base na amostragem de Nyquist para obter fatias suficientes e garantir que não haja lacunas entre as duas pilhas. A amostragem de Nyquist é determinada com base na objetiva e nos comprimentos de onda das luzes²³.
4. Tire imagens sequenciais de três canais de DAPI, FITC e TRITC com lasers de 405 nm, 488 nm e 561 nm e capture com um tempo de permanência de pixels de 1,02 μs. Capture imagens no canal DIC com canais de fluorescência para observar o limite celular.
5. Capture uma pilha de imagens com as dimensões de x: 224,92 μm e y: 224,92 μm, com cada pixel de 220 nm² de tamanho e z-scaling de 415 nm.
6. Tire imagens capturando várias pilhas z (15-22 pilhas) da parte inferior para a parte superior das células. Adquira pelo menos 10 imagens do campo aleatório do prato de cultura para obter um total de ~ 200-300 células.
7. Analise as imagens capturadas off-line para identificar os TNTs por análise de visualização de volume 3D

6. Análise de imagens confocais z-stack para identificar e quantificar TNTs

1. Abra as imagens confocais salvas no formato de dados .czi no software Fiji para análise.
2. Selecione a opção Hyperstack para ver cada z-stack e canal da imagem. Procure as hiperpilhas das pilhas z e canais, que são abertos em uma única janela, como mostra a Figura 2. Role as barras de rolagem do canal (indicado pelas setas vermelha e verde) e z-stack (indicado pelas setas azuis) para selecionar a pilha exata de um determinado canal de interesse.
   NOTA: Em células fixas, como os TNTs pairando ou os conduítes de membrana permanecem acima da superfície, as estruturas não são visíveis nas partes inferiores das pilhas z. No entanto, em células fixas, os neurites encontram-se na superfície e são detectáveis nas partes inferiores das pilhas z (z = 0 a 2). Consulte a Figura 2 para as etapas de identificação.
3. Como mostrado na Figura 2, selecione o canal manchado de F actina (indicado por setas vermelhas) primeiro rolando a barra de canais. Em seguida, role manualmente as pilhas z (indicadas por setas azuis) para ver cada pilha uma a uma. Identifique as estruturas coradas com actina F que parecem estar conectando células, são visíveis nas partes inferiores das pilhas z e estão próximas à superfície do prato de imagem (z = 2) como neurites (indicadas por setas brancas).
   NOTA: A maioria dos neurites é fácil de identificar, pois aparecem como saliências estendidas (indicadas por setas rosas).
4. Identifique os TNTs, os conduítes F-actin-positivos, pairando célula a célula, rolando as pilhas z em direção ao topo (de z = 4 na Figura 2; indicado por setas amarelas). Procure neurites perto das partes inferiores das pilhas z em direção à superfície e observe que elas começam a desaparecer com a rolagem das pilhas z em direção ao topo (em z = 6 na Figura 2; neurites não são claramente visíveis).
5. Identifique TNTs fosfo-PAK1-positivos de forma semelhante aos TNTs F-actin-positivos analisando a natureza pairando dos conduítes das pilhas z. Como a coloração fosfo-PAK1 é mais fraca do que a coloração F-actina, procure TNTs corados com fosfo-PAK1 em z = 4 (fracamente visível) e em z = 6 (proeminente).
6. Além disso, observe as imagens DIC para verificar se as estruturas TNT coradas com F-actina e fosfo-PAK1 são condutos de membrana entre as células (Figura 3). Além disso, mescle os canais F-actina (vermelho) e fosfo-PAK1 (verde) para verificar se os TNTs identificados são estruturas cocoradas de F-actina e fosfo-PAK1 (Figura 3).
7. Para quantificar os TNTs, conte o número total de células e os TNTs identificados manualmente e represente os números como porcentagens.
8. Para distinguir TNTs positivos para F-actina e conduítes flutuantes β-III positivos para TNT (TUBb3) de imagens de pilha z, mescle os canais F-actina (vermelho) e TUBb3 (verde) (Figura 4). Em seguida, analise as pilhas z das imagens mescladas.
   1. Procure TNTs exclusivamente corados com F-actina que sejam fracamente visíveis em z = 3 e proeminentes em z = 6 e z = 9 (setas amarelas). Da mesma forma, identifique os conduítes flutuantes duplo-positivos para F-actina e β-III (TUBb3), semelhantes a TNT, em z = 6 e z = 9 (setas ciano). Identifique outras saliências coradas de tubulina F-actina e β-III, sem pairar, das partes inferiores das pilhas z (setas brancas).
9. Meça o diâmetro dos TNTs usando a ferramenta de linha em Fiji. Verifique a escala de medição clicando em Analisar | Defina Escala para que a "distância em pixels" seja definida automaticamente a partir das imagens .czi. Meça os diâmetros dos TNTs no plano xy.
   NOTA: A maioria dos diâmetros está entre 1 pixel e 4 pixels (ou seja, 220-880 nm); cada pixel tem 220 nm. Consulte a Figura 5 para um resumo do protocolo para a análise de imagens confocais z-stack.

7.3D reconstrução de imagens z-stack para caracterizar TNTs

1. Use o plug-in visualizador de volume em Fiji, que permite o reconhecimento 3D e a visualização 3D habilitada para limite (Figura 6).
2. Divida as imagens z-stack em canais individuais. Em seguida, corte as imagens z-stack de canal único (canal F-actina) para usar a visualização de reconstrução 3D para destacar um ou dois TNTs ou neurites de cada vez. Habilite o plug-in de visualização de volume para visualizar as visualizações xy, yz e xz.
3. Fixe um único TNT ou neurito no plano xy (setas brancas representam neurites na Figura 6A; setas amarelas representam TNTs na Figura 6B) e marque as seções transversais dos eixos xz (vermelho) e yz (verde). Observe os neurites na parte inferior do plano xz nos planos xz e yz (setas brancas, Figura 6A) e os TNTs nas pilhas z superiores (setas amarelas, Figura 6B).
4. Selecione o TNT ou neurito individual para reconstruir a visualização do volume 3D no plano xz (Figura 6C, D). Na reconstrução 3D, observe os neurites na parte inferior do plano z (setas brancas, Figura 6C) e os TNTs aparecendo como estruturas pairando conectando duas células sem tocar no plano z inferior (setas amarelas, Figura 6D).

Results

Aqui, identificamos e caracterizamos TNTs induzidos por oAβ em células neuronais SH-SY5Y através da construção de visualizações de volume 3D a partir de imagens confocais z-stack (Figura 1). As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1. Imagens confocais de z-stack de células imunocoradas foram analisadas para identificar TNTs (Figura 2). Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas TNT coradas com F-actina e ...

Discussion

Vários pesquisadores nas últimas 2 décadas vêm tentando entender e caracterizar a estrutura dos TNTs¹⁸. A falta de marcadores específicos dificulta o progresso, e há uma demanda crescente por um método conveniente e padronizado que possa ser usado para identificar, caracterizar e quantificar TNTs. Os TNTs são definidos como conduítes de membrana à base de actina F que pairam entre duas células. Estudos têm demonstrado que neurites em desenvolvimento β-tubulina-positivas, fechadas, pairam entre dua...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prato de 35 mm com tamanho de poço de 14 mm feito de lamínula #1.5	Cellvis	D35-14-1.5-N	Prato de imagem usado para semear células para experimentos de coloração
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligômeros de beta amilóide para tratar as células
Farinha Alexa 488 Cabra Anti-coelho IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Anticorpo secundário para fosfo-PAK1
Gabinete de Segurança Biológica	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Fornecer condições ascéticas durante a cultura de células
CO2 Incubadora	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	Para células em crescimento à temperatura corporal ou próxima à temperatura corporal
Microscópio confocal de varredura a laser	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Capaz de gerar imagens tridimensionais de grandes espécimes em super-resolução
DABCO [1,4-Diazobiciclo-(2,2,2) octanas]	Merck	8034560100	Reagente anti-branqueamento
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear corante
Mídia DMEM	Gibco	11965092	Usado para a preparação de 100uM de Aβ (1-42)
DMEM/F12 (mistura 1:1 de DMEM e presunto» s F12)	Gibco	12500062	Meios de cultura para SH-SY5Y
DMSO (sulfeto de dimetila) Grau de cultura de células	Cryopur	CP-100	Grau de cultura de células usado como agente de dissolução para ácido retinóico
DMSO (sulfeto de dimetila) Grau molecular	Himedia	MB058	Usado como um dos agentes de dissolução para o liofilizado Aβ (1-42)
Soro Fetal Bovino	Gibco	16000044	Suplemento principal para meios de cultura (origem americana)
Fixador de formalina (tamponado neutro 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Componente na solução fixadora de Karnovsky
Glutaraldeído (Grau I, 25% em H2O)	Sigma	G5882	Componente na solução fixadora de Karnovsky
Solução HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)	TCI	H024	Usado para dissolver Aβ (1-42) Software
processamento/análise de imagem de 1 mg: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Usado para processar/analisar as imagens e diferenciar os TNTs dos neurites usando seu plug-in chamado "visualizador de volume".
Liofilizador	Cristo, Alfa	2,4 LDmais	0,05 mg alíquotas de Aβ (1-42) pode ser armazenado em -20 ° C após liofilização apenas
Mistura de penicilina-estreptomicina-neomicina	Thermo fisher Scientific	15640055	Mistura de antibióticos
Faloidina-iFlor 555	Abcam	ab176756	Coloração de ligação à F-actina
Fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) [Coelho]	CST	# 2601	Anticorpo primário
Anticorpo policlonal para tubulina beta 3 (TUBb3)	Clone de	nuvemPAE711Hu01	Anticorpo primário
Ácido retinóico	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Reagente diferenciador
Saponina	Merck	8047-15-2	Detergente usado no tampão de incubação em imunocoloração
Sonicator em banho-maria (Quart, Aquecedor de válvula de drenagem)	Limpador ultrassônico	3,0 L / 3,2	Sonicator usado para dissolver Aβ (1-42) estoque, após DMSO adicionado a ele durante a preparação de 100 µ M Aβ (1-42)
Software de microscopia	ZEN ZEISS (Carl Zeiss)		Software de imagem para aquisição de imagens de microscopia confocal com automação inteligente