Detecção e quantificação de nanotubos de tunelamento usando imagens de visualização de volume 3D

Summary

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são principalmente nanotubos de membrana de actina F abertos que conectam células vizinhas, facilitando a comunicação intercelular. A característica notável que distingue os TNTs de outras saliências celulares é a natureza flutuante dos nanotubos entre as células. Aqui, caracterizamos os TNTs construindo uma visão de volume 3D de imagens confocais z-stack.

Abstract

Descobertas recentes revelaram que as células realizam transferência intercelular direta, de longo alcance, através de conduítes de membrana de actina em nanoescala, ou seja, "nanotubos de tunelamento" (TNTs). Os TNTs são definidos como extensões de membrana abertas e circundadas por bicamadas lipídicas que medeiam a continuidade entre células vizinhas de diâmetros que variam entre 50 nm e 1 μm. Os TNTs foram demonstrados inicialmente em células neuronais, mas estudos sucessivos revelaram a existência de TNTs em vários tipos celulares e doenças, como doenças neurodegenerativas, infecções virais e câncer. Vários estudos se referiram a nanoestruturas de membrana fechadas e eletricamente acopladas entre células vizinhas como TNTs ou estruturas semelhantes a TNT.

A elucidação da ultraestrutura em termos de continuidade da membrana no desfecho é tecnicamente desafiadora. Além disso, estudos sobre comunicação célula-célula são desafiadores em termos de caracterização de TNTs usando métodos convencionais devido à falta de marcadores específicos. Os TNTs são definidos principalmente como saliências de membrana abertas à base de F-actina. No entanto, uma grande limitação é que a F-actina está presente em todos os tipos de saliências, tornando desafiador diferenciar TNTs de outras saliências. Uma das características notáveis dos TNTs à base de actina F é que essas estruturas pairam entre duas células sem tocar o substrato. Portanto, TNTs distintos corados com F-actina podem ser convenientemente distinguidos de outras saliências, como filópodes e neurites, com base em seu pairar entre as células.

Recentemente, mostramos que a internalização da amilóide-β_{oligomérica 1-42} (oAβ) via endocitose dependente de actina estimula a quinase-1 ativada por p21 ativada (PAK1), que medeia a formação de TNTs contendo F-actina coexpressos com fosfo-PAK1 entre células neuronais SH-SY5Y. Este protocolo descreve um método de análise de volume 3D para identificar e caracterizar TNTs a partir das imagens capturadas de z-stack de protuberâncias de membrana imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1 em células neuronais tratadas com oAβ. Além disso, os TNTs distinguem-se do desenvolvimento de neurites e excrescências neuronais com base em condutos de membrana imunocorados de tubulina F-actina e β-III.

Introduction

Os nanotubos de tunelamento (TNTs) são condutos de membrana à base de actina F, principalmente abertos, e desempenham um papel vital na transferência intercelular de carga e organelas¹. A característica única dos TNTs é que eles conectam células vizinhas sem qualquer contato com o substrato; têm mais de 10-300 μm de comprimento e os seus diâmetros variam entre 50 nm a 1 μm ^2,3. Os TNTs são estruturas transitórias e sua vida útil dura entre alguns minutos a várias horas. Os TNTs foram demonstrados pela primeira vez em células neuronais^{PC12 1}; posteriormente, numer....

Protocol

NOTA: As células SH-SY5Y cultivadas em meio DMEM/F-12 foram diferenciadas com ácido retinóico de 10 μM por 7 dias e tratadas com oligômeros de 1 μM oAβ por 2 h a 37 °C (5% de CO₂). Após o tratamento, as células foram fixadas com solução fixadora de Karnovsky e duplamente imunocoradas com anticorpo fosfo-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) e faloidina ligadora de F-actina. Posteriormente, imagens confocais de pilha z foram obtidas usando um microscópio de varredura a laser confocal. Os TNTs foram quantificados por contagem manual e distinguidos de outras neurites/saliências celulares por meio da construção de imagens de visualização de volume 3D e identificação das ....

Results

Aqui, identificamos e caracterizamos TNTs induzidos por oAβ em células neuronais SH-SY5Y através da construção de visualizações de volume 3D a partir de imagens confocais z-stack (Figura 1). As células foram duplamente imunocoradas com F-actina e fosfo-PAK1. Imagens confocais de z-stack de células imunocoradas foram analisadas para identificar TNTs (Figura 2). Além disso, as imagens DIC foram analisadas para verificar se as estruturas TNT coradas com F-actina e .......

Discussion

Vários pesquisadores nas últimas 2 décadas vêm tentando entender e caracterizar a estrutura dos TNTs¹⁸. A falta de marcadores específicos dificulta o progresso, e há uma demanda crescente por um método conveniente e padronizado que possa ser usado para identificar, caracterizar e quantificar TNTs. Os TNTs são definidos como conduítes de membrana à base de actina F que pairam entre duas células. Estudos têm demonstrado que neurites em desenvolvimento β-tubulina-positivas, fechadas, pairam entre dua.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Prato de 35 mm com tamanho de poço de 14 mm feito de lamínula #1.5	Cellvis	D35-14-1.5-N	Prato de imagem usado para semear células para experimentos de coloração
Aβ (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligômeros de beta amilóide para tratar as células
Farinha Alexa 488 Cabra Anti-coelho IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Anticorpo secundário para fosfo-PAK1
Gabinete de Segurança Biológica	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Fornecer condições ascéticas durante a cultura de células
CO2 Incubadora	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	Para células em crescimento à temperatura corporal ou próxima à temperatura corporal
Microscópio confocal de varredura a laser	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Capaz de gerar imagens tridimensionais de grandes espécimes em super-resolução
DABCO [1,4-Diazobiciclo-(2,2,2) octanas]	Merck	8034560100	Reagente anti-branqueamento
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear corante
Mídia DMEM	Gibco	11965092	Usado para a preparação de 100uM de Aβ (1-42)
DMEM/F12 (mistura 1:1 de DMEM e presunto» s F12)	Gibco	12500062	Meios de cultura para SH-SY5Y
DMSO (sulfeto de dimetila) Grau de cultura de células	Cryopur	CP-100	Grau de cultura de células usado como agente de dissolução para ácido retinóico
DMSO (sulfeto de dimetila) Grau molecular	Himedia	MB058	Usado como um dos agentes de dissolução para o liofilizado Aβ (1-42)
Soro Fetal Bovino	Gibco	16000044	Suplemento principal para meios de cultura (origem americana)
Fixador de formalina (tamponado neutro 10%)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Componente na solução fixadora de Karnovsky
Glutaraldeído (Grau I, 25% em H2O)	Sigma	G5882	Componente na solução fixadora de Karnovsky
Solução HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol)	TCI	H024	Usado para dissolver Aβ (1-42) Software
processamento/análise de imagem de 1 mg: FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Usado para processar/analisar as imagens e diferenciar os TNTs dos neurites usando seu plug-in chamado "visualizador de volume".
Liofilizador	Cristo, Alfa	2,4 LDmais	0,05 mg alíquotas de Aβ (1-42) pode ser armazenado em -20 ° C após liofilização apenas
Mistura de penicilina-estreptomicina-neomicina	Thermo fisher Scientific	15640055	Mistura de antibióticos
Faloidina-iFlor 555	Abcam	ab176756	Coloração de ligação à F-actina
Fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) [Coelho]	CST	# 2601	Anticorpo primário
Anticorpo policlonal para tubulina beta 3 (TUBb3)	Clone de	nuvemPAE711Hu01	Anticorpo primário
Ácido retinóico	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Reagente diferenciador
Saponina	Merck	8047-15-2	Detergente usado no tampão de incubação em imunocoloração
Sonicator em banho-maria (Quart, Aquecedor de válvula de drenagem)	Limpador ultrassônico	3,0 L / 3,2	Sonicator usado para dissolver Aβ (1-42) estoque, após DMSO adicionado a ele durante a preparação de 100 µ M Aβ (1-42)
Software de microscopia	ZEN ZEISS (Carl Zeiss)		Software de imagem para aquisição de imagens de microscopia confocal com automação inteligente