Capturando a Conformação Cromossômica Através de Escalas de Comprimento

Resumo

O Hi-C 3.0 é um protocolo Hi-C aprimorado que combina reticulantes de formaldeído e glutarato de disuccinimidil com um coquetel de enzimas de restrição DpnII e DdeI para aumentar a relação sinal-ruído e a resolução da detecção da interação cromatina.

Resumo

A captura de conformação cromossômica (3C) é usada para detectar interações tridimensionais de cromatina. Normalmente, a reticulação química com formaldeído (AF) é usada para fixar interações de cromatina. Em seguida, a digestão da cromatina com uma enzima de restrição e a subsequente religação das extremidades do fragmento convertem a proximidade tridimensional (3D) em produtos de ligadura exclusivos. Finalmente, após a reversão das ligações cruzadas, remoção de proteínas e isolamento do DNA, o DNA é cortado e preparado para sequenciamento de alto rendimento. A frequência de ligadura de proximidade de pares de loci é uma medida da frequência de sua colocalização no espaço tridimensional em uma população celular.

Uma biblioteca Hi-C sequenciada fornece informações de todo o genoma sobre frequências de interação entre todos os pares de loci. A resolução e a precisão do Hi-C dependem de uma reticulação eficiente que mantém os contatos da cromatina e da fragmentação frequente e uniforme da cromatina. Este trabalho descreve um protocolo Hi-C in situ melhorado, Hi-C 3.0, que aumenta a eficiência da reticulação combinando dois reticulantes (formaldeído [FA] e glutarato de disuccinimidil [DSG]), seguido de digestão mais fina usando duas enzimas de restrição (DpnII e DdeI). O Hi-C 3.0 é um protocolo único para a quantificação precisa de características de dobramento do genoma em escalas menores, como loops e domínios topologicamente associados (TADs), bem como características em escalas maiores de todo o núcleo, como compartimentos.

Introdução

A captura de conformação cromossômica tem sido utilizada desde 2002¹. Fundamentalmente, cada variante de captura de conformação depende da fixação das interações DNA-proteína e proteína-proteína para preservar a organização da cromatina 3D. Isto é seguido por fragmentação de DNA, geralmente por digestão de restrição e, finalmente, religação de extremidades de DNA próximas para converter loci espacialmente proximais em sequências de DNA covalentes únicas. Os protocolos 3C iniciais usavam PCR para amostrar interações específicas "um-para-um". Ensaios 4C subsequentes permitiram a detecção de interações "um-para-todos"², enquanto o 5C detectou interações "muitos-para-muitos"³. A captura de conformação cromossômica se concretizou completamente após a implementação de sequenciamento de alta produção (NGS) de próxima geração, que permitiu a detecção de interações genômicas "all-to-all" usando Hi-C⁴ em todo o genoma e técnicas comparáveis, como 3C-seq⁵, TCC⁶ e Micro-C ^7,8 (ver também revisão por Denker e De Laat⁹).

Em Hi-C, nucleotídeos biotinilados são usados para marcar saliências de 5′ após a digestão e antes da ligadura (Figura 1). Isso permite a seleção de fragmentos adequadamente digeridos e religados usando contas revestidas com estreptavidina, diferenciando-o do GCC¹⁰. Uma importante atualização do protocolo Hi-C foi implementada por Rao et ^al.11, que realizaram a digestão e religação em núcleos intactos (ou seja, in situ) para reduzir os produtos de ligadura espúria. Além disso, a substituição da digestão HindIII pela digestão MboI (ou DpnII) reduziu o tamanho do fragmento e aumentou o potencial de resolução do Hi-C. Esse aumento permitiu a detecção de estruturas de escala relativamente pequena e uma localização genômica mais precisa de pontos de contato, como alças de DNA entre pequenos cis-elementos, por exemplo, alças entre sítios ligados à CTCF geradas por extrusão de alça^11,12. No entanto, esse potencial tem um custo. Primeiro, um aumento de duas vezes na resolução requer um aumento de quatro vezes (2²) nas leituras de sequenciamento¹³. Em segundo lugar, os pequenos tamanhos de fragmentos aumentam a possibilidade de confundir fragmentos vizinhos não digeridos com fragmentos digeridos e religados¹⁴. Como mencionado, em Hi-C, fragmentos digeridos e religados diferem dos fragmentos não digeridos pela presença de biotina na junção de ligadura. No entanto, a remoção adequada da biotina das extremidades não ligadas é necessária para garantir que apenas as junções de ligadura sejam puxadas para baixo^14,15.

Com a diminuição do custo do NGS, torna-se viável estudar o dobramento cromossômico com mais detalhes. Para diminuir o tamanho dos fragmentos de DNA e, assim, aumentar a resolução, o protocolo Hi-C pode ser adaptado para usar com maior frequência enzimas de restrição de corte¹⁶ ou para usar combinações de enzimas de restrição^17,18,19. Alternativamente, a MNase ^7,8 em Micro-C e DNase em DNase Hi-C²⁰ podem ser tituladas para alcançar a digestão ideal.

Uma avaliação sistemática recente dos fundamentos dos métodos 3C mostrou que a detecção de características de dobramento cromossômico em todas as escalas de comprimento melhorou muito com reticulação sequencial com 1% de AF seguida de 3 mM DSG¹⁷. Além disso, o Hi-C com digestão HindIII foi a melhor opção para detectar características de dobramento em larga escala, como compartimentos, e que o Micro-C foi superior na detecção de características de dobramento em pequena escala, como laços de DNA. Esses resultados levaram ao desenvolvimento de uma estratégia "Hi-C 3.0" única e de alta resolução, que utiliza a combinação de reticulantes FA e DSG seguida de dupla digestão com endonucleases DpnII e DdeI²¹. O Hi-C 3.0 fornece uma estratégia eficaz para uso geral, pois detecta com precisão os recursos de dobragem em todas as escalas de comprimento¹⁷. A parte experimental do protocolo Hi-C 3.0 é detalhada aqui e os resultados típicos que podem ser esperados após o sequenciamento são mostrados.

Figura 1: Procedimento Hi-C em seis etapas. As células são fixadas primeiro com AF e, em seguida, DSG (1). Em seguida, a lise precede uma dupla digestão com DdeI e DpnII (2). A biotina é adicionada por saliência de preenchimento e as extremidades embotadas proximais são ligadas (3) antes da purificação do DNA (4). A biotina é removida das extremidades não ligadas antes da sonicação e seleção de tamanho (5). Finalmente, o pull-down da biotina permite a ligadura do adaptador e a amplificação da biblioteca por PCR (6). Abreviaturas: FA = formaldeído; DSG = glutarato de disuccinimidilo; B = Biotina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Fixação por reticulação

1. Fixação de formaldeído: a partir de células em monocamada
   1. Ter células semeadas em meio apropriado para colher 5 × 10⁶ células por placa de 150 mm.
      NOTA: Os usuários podem escolher qualquer recipiente preferido que garanta o crescimento ideal de qualquer linhagem celular de mamíferos. Além disso, as células podem ser isoladas do tecido.
   2. Aspirar o meio com uma pipeta Pasteur acoplada a um purgador de vácuo a partir de uma placa de 150 mm, lavar 2x com ~10 mL de HBSS.
   3. Imediatamente antes da reticulação, prepare uma solução de reticulação de AG a 1% em um tubo de 50 mL, combinando 22,5 mL de HBSS e 625 μL de AF a 37% até uma concentração final de 1%. Misture suavemente balançando.
      CUIDADO: Use exaustor; O formaldeído é tóxico.
   4. Para reticular as células, despeje 23,125 mL da solução de AG a 1% em cada placa de 15 cm.
   5. Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos e agitar suavemente as placas à mão a cada 2 minutos.
   6. Adicione 1,25 mL de glicina 2,5 M (128 mM final) e gire suavemente a placa para extinguir a reação de reticulação.
   7. Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos e continuar a incubação no gelo durante, pelo menos, 15 minutos para parar a reticulação.
   8. Raspe as células das placas com um raspador de cela ou policial de borracha.
   9. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL com um pipeta. Centrifugar a 1.000 × g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante por aspiração.
   10. Lave o pellet celular uma vez com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco, usando uma pipeta para ressuspensão. Em seguida, centrifugar a 1.000 × g por 10 min à temperatura ambiente. Prossiga imediatamente para a ligação cruzada DSG.
       NOTA: Tenha cuidado ao lavar o pellet da célula, pois os pellets de célula podem estar soltos e as células podem ser perdidas.
2. Fixação de formaldeído: a partir de células em suspensão
   1. Ter células semeadas em meio apropriado para colher 5 × 10⁶ células por vaso.
      NOTA: Os usuários podem escolher qualquer recipiente preferido que garanta o crescimento celular ideal de qualquer linhagem celular de mamíferos.
   2. Imediatamente antes da colheita, conte as células e transfira 5 × 10⁶ células para um tubo cônico de 50 mL.
   3. Peletizar suavemente as células centrifugando a 300 × g durante 10 min à temperatura ambiente.
   4. Preparar a solução de reticulação de AG a 1% adicionando 1,25 mL de AF a 37% a 45 mL de HBSS e misturar invertendo o tubo várias vezes.
      NOTA: Adicione todo o 1,25 mL de AF sem dividir a quantidade.
      CUIDADO: O formaldeído é altamente tóxico.
   5. Ressuscite o pellet celular na solução de reticulação de 46,25 mL de AG a 1% preparada na etapa anterior, pipetando para cima e para baixo.
   6. Incubar à temperatura ambiente por exatamente 10 min no rotador, balancim ou por inversão manual suave do tubo a cada 1-2 min.
   7. Apague a reação de reticulação adicionando 2,5 mL de glicina 2,5 M (128 mM final) e misture bem invertendo o tubo.
   8. Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, no gelo por pelo menos 15 minutos para parar completamente a reticulação.
   9. Centrifugar à temperatura ambiente para peletizar as células reticuladas a 1.000 × g durante 10 min e eliminar o sobrenadante por aspiração.
   10. Lave as células uma vez com 10 mL de DPBS e, em seguida, centrifugar a 1.000 × g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte completamente o sobrenadante usando uma pipeta e prossiga imediatamente para a reticulação DSG.
       NOTA: Tenha cuidado ao lavar o pellet da célula, pois os pellets de célula podem estar soltos e as células podem ser perdidas.
3. Reticulação com glutarato de disuccinimidil
   1. Ressuspender as células peletizadas em 9,9 mL de DPBS antes de adicionar 100 μL de 300 mM DSG (3 mM final). Misture por inversão.
      NOTA: DSG é sensível à umidade. É importante preparar um novo estoque de 300 mM DSG em DMSO no dia da reticulação.
      CUIDADO: DSG em DMSO é altamente tóxico.
   2. Reticule as células à temperatura ambiente por 40 minutos em um rotador.
   3. Adicionar 1,925 mL de glicina 2,5 M (400 mM final), inverter para misturar e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
   4. Centrifugar as células a 2.000 × g durante 15 min à temperatura ambiente.
      NOTA: Tenha cuidado ao remover o sobrenadante de pellets de células soltas.
   5. Ressuspender o pellet em 1 mL de albumina sérica bovina (BSA)-DPBS a 0,05% e transferir para um tubo de 1,7 mL.
      NOTA: A adição de BSA pode ajudar a reduzir a aglomeração celular.
   6. Centrifugar as células a 2.000 g × durante 15 min a 4 °C e remover o sobrenadante por pipeta.
      NOTA: Para evitar a perda do pellet, remova rápida e completamente o sobrenadante.
   7. Congelar rapidamente o pellet em azoto líquido e conservar a -80 °C ou avançar imediatamente para o passo seguinte.

2. Captura de conformação cromossômica

1. Lise celular e digestão por cromatina
   1. Ressuspeite (pipeta) as alíquotas celulares reticuladas (~5 × 10⁶ células) em 1 mL de tampão de lise gelada (receita na Tabela Suplementar S1) contendo 10 μL de coquetel inibidor de protease e transferir para um homogeneizador de ondulação por 15 min de incubação no gelo.
      NOTA: Adicione inibidores de protease ao tampão de lise imediatamente antes do uso.
   2. Mova lentamente o pilão A para cima e para baixo 30 vezes para homogeneizar as células no gelo e incubar no gelo por 1 minuto para permitir que as células esfriem, antes de mais 30 golpes.
   3. Transfira o lisado para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
      NOTA: Mantenha a suspensão em movimento porque, às vezes, as células ficam na ponta da pipeta.
   4. Centrifugar a suspensão lisada a 2.500 × g durante 5 min à temperatura ambiente.
   5. Descarte o sobrenadante e agite ou mova o grânulo molhado para ressuspender. Remova o máximo possível do sobrenadante para obter uma substância semelhante a iogurte com o mínimo de aglomerados.
   6. Ressuscite o pellet em 500 μL de tampão de restrição gelado 1x (a partir de 10x; ver receita na Tabela Suplementar S1) e centrifugar por 5 min a 2.500 × g. Repita este passo para uma segunda lavagem.
      NOTA: O pellet no buffer de restrição 1x é mais granular do que o pellet anterior no buffer de lise.
   7. Ressuscite as células em um volume final de 360 μL de 1x Buffer de Restrição por pipetagem depois de adicionar ~340 μL ao volume de transição do pellet, que depende do tamanho da célula.
   8. Retirar 18 μL de cada lisado para o ensaio da integridade da cromatina (CI). Conservar as amostras de IC a 4 °C.
   9. Adicionar 38 μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1% a cada tubo Hi-C (volume total de 380 μL) e misturar cuidadosamente por pipetagem sem introduzir bolhas.
      CUIDADO: SDS é tóxico.
   10. Incubar as amostras a 65 °C sem agitar durante exactamente 10 minutos para abrir a cromatina.
   11. Coloque imediatamente os tubos no gelo e prepare a mistura de digestão com Triton X-100 para extinguir o SDS conforme descrito na Tabela 1.
   12. Adicionar 107 μL da mistura de digestão ao tubo Hi-C (total de 487 μL) para digerir a cromatina durante a noite (~16 h) a 37 °C num termócamo com agitação intervalada (por exemplo, 900 rpm, 30 s ligado, 4 min desligado).
       NOTA: A adição de Tritão a uma concentração final de 1% serve para extinguir o SDS.
2. Biotinilação de extremidades de DNA
   1. Após digestão durante a noite, transferir as amostras para 65 °C durante 20 min para desativar a atividade restante da endonuclease.
   2. Durante a incubação, prepare uma mistura mestra de preenchimento, conforme mostrado na Tabela 2.
   3. Após a incubação, colocar as amostras imediatamente sobre o gelo.
   4. Retirar um controlo da digestão (CC) de 10 μL para cada amostra e armazenar a 4 °C.
   5. Remova a condensação da tampa com um pipeta ou girando. A cada amostra, adicionar 58 μL de mistura de enchimento de biotina (volume total da amostra de 535 μL) e pipetar suavemente sem formar bolhas.
   6. Incubar as amostras a 23 °C durante 4 h numa termófora (por exemplo, 900 rpm, 30 s ligado, 4 min desligado).
3. Ligadura de fragmentos de DNA proximal
   1. Prepare a mistura de ligadura como mostrado na Tabela 3 enquanto o preenchimento de biotina está incubando.
   2. Adicionar 665 μL da mistura de ligadura a cada amostra (volume total da amostra de 1,200 μL). Misture suavemente por pipetagem.
   3. Incubar as amostras a 16 °C durante 4 h numa terminadora com agitação intervalada (por exemplo, 900 rpm, 30 s ligado, 4 min desligado). Conservar estas amostras contendo cromatina covalentemente ligada a 4 °C durante alguns dias.
4. Reversão da reticulação
   1. Traga os volumes das amostras de IC e DC para 50 μL com 1x Tris Low EDTA (TLE; veja a receita na Tabela Suplementar S1).
   2. Adicionar 10 μL de 10 mg/mL de proteinase K às amostras de IC e DC.
   3. Incubar a 65 °C durante a noite com agitação intervalada (por exemplo, 900 rpm, 30 s ligado, 4 min desligado). Alternativamente, execute uma reversão de 30 minutos de reticulação para esses controles durante a purificação do DNA das amostras Hi-C.
   4. A cada amostra de Hi-C, adicionar 50 μL de 10 mg/ml de proteinase K e incubar a 65 °C durante, pelo menos, 2 h com agitação intervalada (por exemplo, 900 rpm, 30 s ligado, 4 min desligado).
   5. Adicionar mais 50 μL de 10 mg/ml de proteinase K a cada tubo Hi-C (volume total da amostra de 1.300 μL) e continuar a incubar a 65 °C durante a noite. Conservar a 4 °C até à purificação do ADN.
      NOTA: A divisão das incubações de proteinase K garante a digestão total das proteínas.
5. Purificação de DNA
   1. Deixe arrefecer os tubos desde 65 °C até à temperatura ambiente.
   2. Transfira cada amostra para um tubo cônico de 15 mL e adicione 2,6 mL (2x volume) de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico a cada tubo.
      CUIDADO: Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico é um irritante muito tóxico e é potencialmente cancerígeno.
   3. Vórtice cada tubo por 1 min e, em seguida, transfira seu conteúdo para um tubo de bloqueio de fase de 15 mL.
   4. Centrifugar as amostras por 5 min na velocidade máxima (1.500-3.500 × g) em uma centrífuga de bancada.
   5. Despeje cuidadosamente a fase aquosa em um tubo de ultracentrífuga de 35 mL e adicione água ultrapura a um volume final de 1.250 μL.
      NOTA: Use tubos para encaixar a ultracentrífuga disponível ou divida em vários tubos de microcentrífuga.
   6. Adicionar^{um volume de} 1/10 (~125 μL) de acetato de sódio 3 M e misturar bem por inversão.
   7. Adicione um volume de 2,5x (~3,4 mL) de etanol 100% gelado a cada amostra, equilibre os tubos para ultracentrifugação adicionando etanol 100% gelado e misture bem por inversão.
   8. Incube os tubos em gelo seco por ~ 15 min (evite a solidificação).
   9. Centrifugar os tubos a 18.000 × g durante 30 min a 4 °C.
      NOTA: Para rotores angulares: marque os tubos para onde o pellet estará.
   10. Usando uma pipeta, remova e descarte o sobrenadante completamente do lado não pellet.
       NOTA: Neste ponto, o pellet deve se tornar visível e pode ser marcado no tubo, porque pode não ser claramente visível após a secagem na próxima etapa.
   11. Seque as amostras ao ar por aproximadamente 10 minutos ou até que estejam visivelmente secas.
   12. Solubilizar cada pellet em 450 μL de 1x TLE por pipetagem ou rodopio e transferir para 0,5 mL de Unidade de Filtro Centrífugo (UFC) com um corte de peso molecular de 3 kDa.
   13. Centrifugar a UFC à velocidade máxima durante 10 minutos e eliminar o fluxo. Lave cada tubo de ultracentrífuga com um adicional de 450 μL de 1x TLE e transfira para sua UFC para outra lavagem.
       NOTA: Lavar a UFC desta forma limita a perda de DNA, reduzindo a concentração de sal.
   14. Centrifugar a UFC à velocidade máxima durante 10 minutos e eliminar o fluxo.
   15. Adicione 80 μL de 1x TLE à coluna e vire a coluna em um novo tubo de coleta antes de centrifugar por 2 min na velocidade máxima para obter um volume final de ~100 μL.
   16. Adicionar 1 μL de RnaseA (1 mg/ml; diluição de 10 vezes de 10 mg/ml de reserva) a cada amostra e incubar a 37 °C num bloco de calor, em banho-maria ou numa termificante durante, pelo menos, 30 min.
   17. Após o tratamento com Rnase, retirar as amostras a 37 °C e conservar a 4 °C até à fase de controlo de qualidade.
6. Verificação da qualidade da cromatina, digestão enzimática e ligadura da amostra
   1. Arrefecer as amostras CI e DC à temperatura ambiente após inversão das ligações cruzadas no passo 2.4.5. Em seguida, transfira para um tubo de bloqueio de fase prescrição de 2 mL.
      NOTA: Certifique-se de que o conteúdo do bloqueio de fase está centrifugado para um pellet (velocidade máxima de 2 minutos).
   2. Adicionar 200 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e misturar as amostras por vórtice durante 1 min.
   3. Centrifugar os tubos por 5 min na velocidade máxima.
   4. Transfira a fase aquosa de cada amostra (~50 μL) para um novo tubo de microfuga de 1,7 mL.
   5. Adicionar 1 μL de Rnase A (a partir de 1 mg/ml) e incubar a 37 °C durante, pelo menos, 30 min.
   6. Carregar as amostras em gel de agarose a 0,8%, conforme recomendado na Tabela 4.
      NOTA: Os resultados esperados de um controle de qualidade são mostrados na Figura 2.
   7. Quantifique o DNA por densitometria a partir do gel ou usando Qubit ou Nanodrop.
      NOTA: A quantificação precisa garante o volume de entrada correto na próxima parte do protocolo. Use vários padrões com uma quantidade conhecida para construir uma curva padrão.

Tabela 1: Reagentes de digestão. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Reagentes de preenchimento de biotina. *Note que a alteração de enzimas pode exigir diferentes tampões e dNTPs biotinilados. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3: Reagentes da mistura de ligadura. Abreviatura: BSA = albumina sérica bovina. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 4: Parâmetros de carregamento de gel para avaliação de qualidade e seleção de tamanho. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 2: Gel de agarose mostrando resultados típicos de controle de qualidade de purificação de pós-DNA . (A) O controle de IC deve indicar uma banda de DNA de alto peso molecular. (B) As amostras DC e Hi-C mostram uma variedade de tamanhos de DNA. A amostra Hi-C, tendo sido combinada em fragmentos maiores, deve ser de maior peso molecular do que a DC. A faixa de concentração dos marcadores permite gerar uma curva padrão. Observe que, neste exemplo, o CI foi carregado em um gel separado, mas é aconselhável carregar e executar todas as amostras e controles juntos. Abreviaturas: IC = integridade da cromatina; DC = controle da digestão; Hi-C = ligado à proximidade. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação da biblioteca de sequenciamento Hi-C

1. Remoção de biotina de extremidades não ligadas
   1. Preparar reações de remoção de biotina conforme mostrado na Tabela 5.
      NOTA: Normalmente, 10 μg de DNA são suficientes, mas até 30 μg podem ser usados.
   2. Distribuir 2 alíquotas de 65 μL de cada reação de 130 μL em dois tubos de PCR.
   3. Transferir para um termociclador ou máquina de PCR e incubar conforme descrito na Tabela 5.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas aqui a 4 °C (dias a semanas), -20 °C (longo prazo) ou imediatamente transferidas para a sonicação.
2. Sonication
   1. Agrupe as duplicatas da amostra da etapa de remoção de biotina (volume total de amostra de 130 μL) em um tubo sonicator de 130 μL para sonicação.
   2. Sonicate as amostras usando os parâmetros fornecidos na Tabela 6 para obter uma distribuição estreita e apertada abaixo de 500 pb.
      NOTA: Diferentes tipos de sonicator podem ser usados, mas para uma distribuição estreita de fragmentos (100-500 pb), as configurações do sonicator podem exigir otimização.
3. Seleção de tamanho com contas magnéticas
   1. Pipetar o DNA sonicado do(s) tubo(s) sonicador(es) em um tubo de baixa ligação de 1,7 mL.
   2. Leve cada amostra a um volume total de 500 μL com 1x TLE. Tente obter o volume o mais próximo possível de 500 μL, uma vez que a proporção de amostra para a mistura de esferas magnéticas é essencial para a seleção de tamanho.
   3. Adicionar 400 μL de mistura de grânulos magnéticos a cada tubo para obter uma proporção de mistura de grânulos magnéticos para o volume da amostra de 0,8.
      NOTA: Nessas condições, as contas capturam fragmentos de DNA >300 pb, que será a Fração Superior. O sobrenadante conterá fragmentos <300 pb, que será a Fração Inferior.
   4. Misture os tubos por vórtice e incube por 10 min à temperatura ambiente em um rotador. Para esta e outras proporções de seleção de tamanho, certifique-se de que o volume total da amostra se misture bem. Procure o "modo errático" que alguns rotores têm, o que funciona bem para volumes menores.
   5. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente num separador magnético de partículas (MPS).
   6. Durante a incubação, adicionar 500 μL da mistura de grânulos magnéticos a um tubo fresco de 1,7 μL de baixa ligação para cada amostra.
      NOTA: Estes tubos serão utilizados para a próxima selecção de tamanho da fracção inferior, gerando uma mistura de grânulos magnéticos para a relação amostral de 1,1:1.
   7. Deixe os tubos no MPS por 5 min.
   8. Retirar o sobrenadante das esferas e ressuspender com 150 μL da mistura de grânulos magnéticos.
      NOTA: Esta etapa evita a saturação das contas com DNA, aumentando o número de contas sem aumentar o volume.
   9. Transfira o sobrenadante do passo 3.3.5 para o tubo rotulado preparado para seleccionar a fracção inferior (passo 3.3.8).
      NOTA: 150 μL de mistura de grânulos magnéticos + 400 μL de 0,8x mistura de grânulos magnéticos (total de 550 μL) dividido por 500 μL de amostra inicial = 1,1x mistura de grânulos magnéticos em relação à amostra.
   10. Misture os tubos de fração inferior por vórtice e incube por 10 min à temperatura ambiente em um rotador.
       NOTA: As esferas se ligarão a fragmentos de DNA >100 pb, resultando em uma fração final ligada a contas de 100-300 pb.
   11. Coloque os tubos de fração inferior no MPS por 5 min (temperatura ambiente).
   12. Remova o sobrenadante e centrifugar os tubos brevemente para remover ainda mais o sobrenadante, tanto quanto possível.
   13. Lave as contas de ambas as frações duas vezes usando 200 μL de etanol a 70% e recupere as contas por 5 min no MPS de cada vez.
   14. Após um giro rápido em uma centrífuga, remova o etanol completamente e seque ainda mais as contas no MPS.
       NOTA: Seque até que o álcool esteja completamente evaporado. O pellet deve parecer chocolate escuro sem rachaduras (pode levar ~ 10 min).
   15. Ressuscite ambas as frações em 50 μL de buffer TLE 1x. Incube à temperatura ambiente durante 10 minutos e bata ou mexa nos tubos de dois em dois minutos para estimular a mistura e a eluição.
   16. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 5 minutos para ambas as frações.
   17. Mantenha o sobrenadante de cada amostra. Pipetar o sobrenadante para um tubo de baixa ligação de 1,7 mL.
       NOTA: As amostras podem ser mantidas a 4 °C durante alguns dias ou a -20 °C a longo prazo.
   18. Execute um gel de agarose a 2% como na Tabela 4 para determinar a qualidade e a quantidade da amostra. Veja a Figura 3 para um exemplo de tal gel.
       NOTA: Se por experiência, sonicação é altamente reprodutível, pode-se pular este gel e proceder ao reparo final imediatamente. Recomenda-se que os usuários mantenham as Frações Superiores até após a titulação da PCR. Quantidades de DNA subótimas que exigiriam muita amplificação por PCR podem ser resgatadas do material na Fração Superior.
   19. Quantifique a quantidade de DNA do gel diretamente após gerar uma curva padrão a partir da entrada de escada de DNA conhecida ou usando um Qubit ou Nanodrop.
4. Reparo final
   1. Preparar a mistura de reparação final como no Quadro 7 (quantidade por reacção indicada).
   2. Transfira os 46 μL restantes de DNA eluído da Fração Inferior para tubos de PCR e adicione 24 μL da mistura de reparo final preparada. Incubar em uma máquina de PCR, conforme proposto na Tabela 7.
   3. Quando o programa estiver concluído, mantenha as amostras a 4 °C até ser puxado para baixo.
5. Pull-down de produtos de ligadura biotinilada com grânulos revestidos com estreptavidina
   1. Determine a quantidade de contas revestidas com estreptavidina para cada biblioteca a partir da seleção de tamanho quantificada (etapa 3.3.19).
      NOTA: Estas contas revestidas com estreptavidina (10 mg/mL de solução) podem se ligar a 20 μg de DNA de fita dupla por mg de contas (= 20 μg / 100 μL de contas). Use 2 μL para cada 1 μg de DNA Hi-C, mas não menos que 10 μL.
   2. Misture as contas revestidas de estreptavidina e pipete o volume de contas necessário para cada biblioteca (calculado na etapa anterior) em tubos individuais de baixa ligação de 1,7 mL.
   3. Ressuspenda as contas em 400 μL de tampão de lavagem Tween (TWB; ver receita no Quadro Suplementar S1) e incube durante ~3 minutos à temperatura ambiente num rotador (ver instruções no passo 3.3.4).
   4. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e remova o sobrenadante.
   5. Lave as contas pipetando mais 400 μL de TWB.
   6. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e remova o sobrenadante.
   7. Adicione 400 μL de 2x Binding Buffer (BB) (receita na Tabela Suplementar S1) às contas e suspenda novamente. Além disso, adicione 330 μL de 1x TLE e a solução do End-repair (da etapa 3.4.3).
   8. Incubar as amostras durante 15 minutos à temperatura ambiente enquanto mistura num rotador.
   9. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e remova o sobrenadante.
   10. Adicione 400 μL de 1x BB às contas e ressuscite.
   11. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e remova o sobrenadante.
   12. Adicione 100 μL de 1x TLE para lavar as contas.
   13. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e remova o sobrenadante.
   14. Finalmente, adicione 41 μL de 1x TLE para ressuspender as contas.
6. Cauda A
   1. Preparar a mistura de cauda A como na Tabela 8.
   2. Pipetar as reações em tubos de PCR e incubar como na Tabela 8.
   3. Coloque os tubos de PCR no gelo imediatamente após a remoção do termociclador e transfira o conteúdo para tubos de baixa ligação de 1,7 mL.
   4. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e descarte o sobrenadante.
   5. Adicionar 400 μL de 1x tampão de ligadura, diluído a partir de 5x tampão DNA ligase T4 com água ultrapura.
   6. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e, em seguida, descarte o sobrenadante.
   7. Adicione 1x tampão de ligadura a um volume final de 40 μL.
7. Oligos do adaptador de recozimento
   1. Preparar os oligoestoques adaptadores de 100 μM (Tabela 9).
      NOTA: Ordem de 250 nmoles de oligos purificados por HPLC.
   2. Recozido os adaptadores em tubos de PCR conforme descrito na Tabela 9.
   3. Use um termociclador de PCR para aumentar gradualmente a temperatura em 0,5 °C/s para 97,5 °C. Segure a 97,5 °C durante 2,5 min.
   4. Use um termociclador de PCR para aumentar gradualmente a temperatura a 0,1 ° C / s por 775 ciclos (atingindo 20 ° C). Manter a temperatura a 4 °C até nova utilização.
   5. Adicionar 83 μL de 1x tampão de recozimento (receita na Tabela Suplementar S1) para diluir os adaptadores a 15 μM. Armazenar os adaptadores a -20 °C.
8. Ligadura do adaptador de sequenciamento
   1. Preparar a mistura de ligadura do adaptador num tubo de ligação baixa de 1,7 ml (Tabela 10).
   2. Vigília por 2 h à temperatura ambiente.
   3. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 1 min e descarte o sobrenadante.
   4. Adicionar 400 μL de TWB e pipetar as contas para cima e para baixo cuidadosamente antes da incubação no rotador durante 5 minutos à temperatura ambiente. Separe as contas do sobrenadante no MPS e repita esta etapa mais uma vez.
   5. Separe as contas do sobrenadante no MPS (~1 min), descarte o sobrenadante e adicione 200 μL de 1x BB.
   6. Separe as contas do sobrenadante no MPS (~1 min) e descarte o sobrenadante.
   7. Adicione 200 μL de 1x tampão pré-PCR (de 10x; receita na Tabela Suplementar S1) e transfira para um novo tubo de baixa ligação de 1,7 mL.
   8. Separe as contas do sobrenadante no MPS (~1 min) e descarte o sobrenadante.
   9. Adicione 20 μL de 1x de buffer pré-PCR e misture por pipetagem.
   10. Manter os tubos no gelo durante a utilização ou conservar a 4 °C.
9. Otimização do número do ciclo de PCR por titulação
   1. Definir 30 μL de reacções de mistura mestra por amostra, tal como no quadro 11 (quantidade por reacção indicada).
   2. Execute o menor número de ciclos e obtenha uma alíquota de 5 μL. Execute 2-3 ciclos adicionais na reação restante antes de tomar a próxima alíquota de 5 μL. Repita para coletar quatro alíquotas.
   3. Use os parâmetros de PCR da Tabela 11 para cada alíquota.
   4. Adicionar 5 μL de água e 2 μL de corante 6x a cada amostra de 5 μL. Execute em um gel TBE de agarose a 2% (receita na Tabela Suplementar S1) com 25-150 ng de escada de baixo peso molecular. Consulte a Figura 4 para obter os resultados esperados.
      NOTA: Um número ideal de ciclos para a amplificação de PCR da biblioteca final [etapa 3.10] é o menor número de ciclos para obter o produto visível no gel menos um ciclo.
10. Amplificação de PCR da biblioteca final
    1. Configure reações de 12 x 30 μL para amplificar cada biblioteca final para sequenciamento, conforme na Tabela 11.
    2. Ciclo das reações de PCR de acordo com a Tabela 11 após determinar o número de ciclos após a titulação da PCR (etapa 3.9.3).
    3. Quando a PCR estiver completa, agrupe as amostras replicadas em um tubo de microfugo de baixa ligação de 1,7 mL.
    4. Coloque os tubos no MPS e transfira o sobrenadante para um novo tubo de microfuga de baixa ligação de 1,7 mL.
    5. Ressuspenda as contas revestidas com estreptavidina restantes em 20 μL de 1x buffer pré-PCR.
       NOTA: Este modelo pode ser reutilizado quando armazenado a 4 °C durante dias a semanas ou a longo prazo a -20 °C.
11. Remoção de primers com mistura de contas magnéticas
    1. Use 1x buffer TLE (receita na Tabela Suplementar S1) para ajustar o volume da etapa 3.10.4 para exatamente 360 μL.
    2. A cada amostra, adicionar 360 μL da mistura de grânulos magnéticos e pipeta para cima e para baixo para misturar.
    3. Num rotador, misture as amostras durante 10 minutos à temperatura ambiente.
    4. Separe as contas do sobrenadante no MPS à temperatura ambiente (3-5 min).
    5. Lave as contas duas vezes usando 200 μL de etanol a 70% e recupere as contas por 5 minutos no MPS de cada vez.
    6. Giro rápido em uma centrífuga e pipeta completa fora do etanol. Seque as contas no ar no MPS para evaporar ainda mais o etanol.
       NOTA: O pellet deve parecer chocolate escuro sem rachaduras (pode levar ~ 10 min).
    7. Adicionar 30 μL de água ultrapura e ressuspender para eluír o ADN durante 10 minutos à temperatura ambiente. Mexa os tubos a cada 2 minutos para ajudar a misturar.
    8. Separe as contas do sobrenadante no MPS por 5 min.
    9. Recolher o sobrenadante de cada amostra num tubo fresco de 1,7 ml.
    10. Execute 1 μL da biblioteca em um gel TBE de agarose a 2% (receita na Tabela Suplementar S1) para obter uma distribuição do tamanho do fragmento e quantificar a biblioteca final (Figura 5).
        NOTA: A digestão ClaI só pode ocorrer para junções DpnII-DpnII e serve como um controle de ligadura positivo que deve resultar em uma distribuição de tamanho de fragmento mais baixa para a biblioteca final. As bibliotecas finais podem ser armazenadas por alguns dias a 4 °C, a longo prazo a -20 °C ou imediatamente diluídas e submetidas a sequenciamento.

Tabela 5: Reagentes de remoção de biotina e temperaturas Clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 6: Parâmetros para sonicação. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 7: Reagentes e temperaturas de reparo final. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 8: Reagentes e temperaturas de retailing A. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 9: Primers de PCR e oligos de adaptador final emparelhado com recozimento de reagentes para recozimento. Abreviação: 5PHOS = fosfato de 5'. Os asteriscos indicam bases de DNA fosforotioadas. ^# Combine um oligo indexado com o oligo Universal para recozimento em um adaptador indexado. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 10: Reagentes de ligadura do adaptador. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 11: Reagentes de PCR e parâmetros de ciclagem. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 3: Gel de agarose mostrando resultados típicos de seleção pós-tamanho. As frações superior e inferior para quatro amostras (numeradas de 1 a 4) de DpnII-DdeI Hi-C são mostradas. A primeira faixa para cada amostra contém a fração superior, derivada de uma mistura de contas magnéticas de 0,8x, e a segunda e terceira faixas contêm uma diluição da fração inferior derivada de uma mistura de contas magnéticas de 1,1x. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Gel de agarose com resultados de titulação por PCR. A partir de 5 ciclos de PCR, as amostras são coletadas após cada 2 ciclos (5, 7, 9 e 11 ciclos) para cada uma das quatro bibliotecas. Com base nessa figura, 6 ciclos foram escolhidos como o ciclo ideal para cada amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Produtos finais de PCR. Após a limpeza e seleção de tamanho, os produtos de PCR (Hi-C) foram carregados ao lado de uma fração digerida por ClaI da mesma biblioteca (ClaI). Fragmentos digeridos por ClaI indicam a presença de ligaduras DpnII-DpnII procuradas. Observe que o ClaI não digere as junções DpnII-DdeI e, portanto, nem todas as ligaduras contribuirão para uma redução de tamanho dessa restrição. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

As figuras deste manuscrito foram geradas a partir de um experimento separado, replicado do publicado anteriormente por Lafontaine et ^al.21. Após a obtenção dos dados de sequenciamento de alto rendimento, o Open Chromatin Collective (Open2C: https://github.com/open2c) foi utilizado para processar os dados Hi-C. Um pipeline semelhante pode ser encontrado no portal de dados do projeto 4D Nucleome (https://data.4dnucleome.org/resources/data-analysis/hi_c-processing-pipeline). Resumidamente, o destilador de tubulação Nextflow (https://github.com/open2c/distiller-nf) foi implementado para (1) alinhar as sequências de moléculas Hi-C ao genoma de referência, (2) analisar o alinhamento .sam e formar arquivos com pares Hi-C, (3) filtrar duplicatas de PCR e (4) agregar pares em matrizes binadas de interações Hi-C. Essas matrizes formatadas HDF5, chamadas de coolers, podem então ser (1) visualizadas em um servidor HiGlass (https://higlass.io/) e (2) analisadas usando um grande conjunto de ferramentas computacionais de código aberto presentes na coleção "cooltools" mantida pelo Open Chromatin Collective (https://github.com/open2c/cooltools) para extrair e quantificar recursos de dobra, como compartimentos, TADs e loops.

Alguns indicadores de qualidade das bibliotecas Hi-C3.0 podem ser avaliados imediatamente após o mapeamento de pares de leitura para um genoma de referência, usando algumas métricas/indicadores simples. Primeiro, normalmente ~ 50% dos pares de leitura sequenciados podem ser mapeados exclusivamente para células humanas. Devido à natureza polimérica dos cromossomos, a maioria dessas leituras mapeadas (~60%-90%) representa interações dentro de um cromossomo (cis), com frequências de interação decaindo rapidamente com o aumento da distância genômica (decaimento dependente da distância). O decaimento dependente da distância pode ser melhor visualizado em um "gráfico de escala", que mostra a probabilidade de contato (por braço cromossômico) em função da distância genômica. Descobrimos que o uso de diferentes reticuladores e enzimas pode alterar o decaimento dependente da distância em distâncias de longo e curto alcance¹⁷. A adição de reticulação DSG aumenta a detectabilidade de interações a curtas distâncias quando combinada com enzimas como Mnase e combinações de DpnII-DdeI que produzem fragmentos menores (Figura 6A).

O decaimento dependente da distância também pode ser observado diretamente a partir de matrizes de interação 2D: as interações tornam-se mais infrequentes quando localizadas mais longe da diagonal central (Figura 6B). Além disso, características de dobramento genômico, como compartimentos, TADs e alças, podem ser identificadas a partir de matrizes Hi-C e gráficos de escala como desvios do decaimento dependente da distância média geral do genoma. É importante ressaltar que a reticulação com DSG, além da AF, diminui as ligaduras aleatórias, que são irrestritas devido à natureza polimérica dos cromossomos e, portanto, mais propensas a ocorrer entre os cromossomos (em trans) (Figura 6C). A redução da ligadura aleatória leva ao aumento da relação sinal-ruído, especialmente para interações intracromossômicas intercromossômicas e de longo alcance (>10-50 Mb).

Figura 6: Resultados representativos de bibliotecas Hi-C mapeadas e filtradas. (A) Gráficos de escala com probabilidade de contato e sua derivada para várias enzimas, ordenados por comprimento de fragmento (topo) e reticulação com FA ou FA + DSG (abaixo). A digestão com MNAse (microC) ou DpnII-DdeI (Hi-C 3.0) aumenta significativamente os contatos de curto alcance (acima), assim como a adição de DSG ao FA (inferior). (B) As colunas mostram mapas de calor Hi-C da digestão DpnII após apenas a reticulação FA e a digestão DpnII ou DdeI após a reticulação FA+DSG. As setas brancas mostram o aumento da força dos "pontos" após a reticulação DSG e a digestão DdeI, o que implica uma melhor detecção de alças de DNA. As linhas mostram diferentes partes do cromossomo 3 em resolução crescente, alinhando-se com o painel C: linha superior: cromossomo 3 inteiro (0-198,295,559 Mb); fila do meio: 186-196 Mb; linha inferior: 191,0-191,5 Mb. (C) Gráficos de cobertura para as regiões representadas em A. As setas pretas mostram a cobertura mais baixa (%cis lê) para reticulação somente de FA. Abreviaturas: FA = formaldeído; DSG = glutarato de disuccinimidilo; chr = cromossomo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nem todas as leituras mapeadas são úteis. Um segundo indicador de qualidade é o número de duplicatas de PCR. Leituras duplicadas exatas são altamente improváveis de ocorrer por acaso após ligadura e sonicação. Assim, tais leituras provavelmente resultaram da amplificação por PCR e precisam ser filtradas. Duplicatas geralmente surgem quando muitos ciclos de PCR são necessários para amplificar bibliotecas de baixa complexidade. Geralmente, para Hi-C, a maioria das bibliotecas só precisa de 5-8 ciclos de amplificação final de PCR, conforme determinado pela titulação PCR (ver etapa 3.9; Figura 4). No entanto, bibliotecas com complexidade suficiente podem ser obtidas mesmo após 14 ciclos de amplificação por PCR.

Outra categoria de leituras duplicadas, as chamadas duplicatas ópticas, pode surgir do processo de amplificação em plataformas de sequenciamento Illumina que usam células de fluxo padronizadas (como HiSeq4000). Duplicatas ópticas são encontradas sobrecarregando a célula de fluxo, fazendo com que aglomerados (grandes) sejam chamados de dois aglomerados separados, ou de reagrupamento local da molécula final emparelhada original após uma primeira rodada de PCR. Como ambos os tipos de duplicatas ópticas são locais, elas podem ser identificadas e distinguidas das duplicatas de PCR por sua localização na célula de fluxo. Enquanto bibliotecas com duplicatas de PCR de >15% precisariam de regeneração, bibliotecas com duplicatas ópticas podem ser recarregadas após a otimização do processo de carregamento.

Tabela Suplementar S1: Buffers e soluções. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Etapas críticas para o manuseio de células
Embora seja possível usar um número menor de células de entrada, este protocolo foi otimizado para ~ 5 × 10⁶ células por pista de sequenciamento (~ 400 M lê) para garantir a complexidade adequada após o sequenciamento profundo. As células são melhor contadas antes da fixação. Para a geração de bibliotecas ultraprofundas, geralmente multiplicamos o número de pistas (e células) até que a profundidade de leitura desejada seja atingida. Para uma fixação ideal, o meio contendo soro deve ser substituído por PBS antes da fixação da AF, e soluções fixadoras devem ser adicionadas imediatamente e sem gradientes de concentração ^15,22. Para a colheita celular, a raspagem é preferida à tripsinização, porque a transição de uma forma mais plana para uma forma esférica após a tripsinização pode afetar a conformação nuclear. Após a adição de DSG, pellets de células soltas e aglomeradas são facilmente perdidos. Tenha cuidado ao manusear as células nesta fase e adicione até 0,05% de BSA para diminuir a aglomeração.

Modificações no método
Esse protocolo foi desenvolvido utilizando células humanas¹⁷. No entanto, com base na experiência com a captura de conformação cromossômica, esse protocolo deve funcionar para a maioria das células eucarióticas. Para uma entrada significativamente menor (~1 × 10⁶ células), aconselhamos o uso de metade dos volumes para os procedimentos de lise e captura de conformação [etapas 2.1-2.4]. Isso também permitiria que o isolamento do DNA [etapa 2.5] fosse realizado em uma centrífuga de mesa com tubos de 1,7 mL, o que poderia melhorar a peletização para baixas concentrações de DNA. A quantificação do ADN (passo 2.6.6) indicará como proceder. Para baixas quantidades de DNA isolado (1-5 μg), sugerimos pular a seleção de tamanho (etapa 3.3) e prosseguir com a remoção de biotina após reduzir o volume de 130 μL para ~45 μL com uma UFC.

Este protocolo foi desenvolvido especificamente para garantir dados de alta qualidade após subsequente reticulação com AF e DSG e digestão com DpnII e DdeI. No entanto, estratégias alternativas de reticulação, como a AF seguida de EGS (bis(succinimidil succinato)), que também é usada em ChIP-seq²³ e ChIA-PET²⁴, podem funcionar igualmente bem¹⁷. Da mesma forma, diferentes combinações enzimáticas, como DpnII e HinfI¹⁸ ou MboI, MseI e NlaIII¹⁹ podem ser usadas para digestão. Ao adaptar combinações enzimáticas, certifique-se de usar nucleotídeos biotinilados que possam preencher as saliências específicas de 5 'e usar os tampões mais ideais para cada coquetel. DpnII vem com seu próprio tampão e o fabricante da enzima recomenda um tampão específico para a digestão DdeI. No entanto, para a dupla digestão com DpnII e DdeI neste protocolo, o tampão de restrição é recomendado porque é avaliado em 100% de atividade para ambas as enzimas.

Solução de problemas de captura de conformação
As três etapas principais na captura da conformação cromossômica: reticulação, digestão e religação foram realizadas antes que os resultados possam ser visualizados em gel. Para determinar a qualidade de cada uma dessas três etapas e discernir onde os problemas poderiam ter surgido, as alíquotas antes (IC) e após a digestão (DC) são tomadas e carregadas no gel junto com a amostra de Hi-C ligada (Figura 2). Este gel é usado para determinar a qualidade da amostra Hi-C e se valerá a pena continuar o protocolo. Sem o IC e a DO, é difícil identificar possíveis passos subótimos. Vale a pena notar que a ligadura subótima pode ser devido a um problema na própria ligadura, no preenchimento ou em um problema com a reticulação. Para solucionar problemas de reticulação, certifique-se de não usar mais de 1 × 10⁷ células por biblioteca e comece com novos reagentes de reticulação e células limpas (ou seja, enxaguadas com PBS). Para ligadura, certifique-se de que as células e a mistura de ligadura sejam mantidas no gelo. Adicionar T4 DNA ligase imediatamente antes da incubação de 4 h a 16 °C e misturar bem.

Solução de problemas de preparação da biblioteca
Se forem necessários mais de 10 ciclos de PCR ou nenhum produto de PCR puder ser visto em gel após a titulação por PCR (Figura 4), há algumas opções para salvar a amostra Hi-C. Trabalhando de volta a partir da titulação de PCR, a primeira opção é tentar a PCR novamente. Se ainda não houver produto suficiente, é possível tentar outra rodada de retailing A e ligadura do adaptador (etapa 3.6) depois de lavar as contas duas vezes com 1x buffer TLE. Após esta ligadura adicional de cauda A e adaptador, pode-se proceder à titulação por PCR como antes. Se ainda não houver produto, a última opção é resonicar a fração 0,8x da etapa 3.3 e prosseguir a partir daí.

Limitações e vantagens do Hi-C3.0
É importante perceber que o Hi-C é um método de base populacional que captura a frequência média de interações entre pares de loci na população celular. Algumas análises computacionais são projetadas para desembaraçar combinações de conformações de uma população²⁵, mas, em princípio, o Hi-C é cego para as diferenças entre as células. Embora seja possível realizar Hi-C 26,27 de célula única e inferências computacionais possam ser feitas ^28, o Hi-C de célula única não é adequado para a obtenção de informações 3C de ultra-alta resolução. Uma limitação adicional do Hi-C é que ele detecta apenas interações pareadas. Para detectar interações multicontato, pode-se usar cortadores frequentes combinados com sequenciamento de leitura curta (Illumina)¹⁶ ou realizar multicontato 3C²⁹ ou 4C³⁰, usando sequenciamento de leitura longa de plataformas PacBio ou Oxford Nanopore. Derivados de Hi-C para detectar especificamente contatos entre e ao longo de cromátides irmãs também foram desenvolvidos^31,32.

Embora o Hi-C¹⁹ e o Micro-C³³ possam ser usados para gerar mapas de contato em resoluções subquilobase, ambos exigem uma grande quantidade de leituras de sequenciamento e isso pode se tornar um empreendimento caro. Para chegar a uma resolução semelhante ou até maior sem os custos, o enriquecimento para regiões genômicas específicas (captura-C 34) ou interações proteicas específicas (ChiA-PET 35, PLAC-seq³⁶, Hi-ChIP³⁷) pode ser aplicado. A força e a desvantagem dessas aplicações de enriquecimento é que apenas um número limitado de interações é amostrado. Com tais enriquecimentos, o aspecto global do Hi-C (e a opção da normalização global) é perdido.

Importância e potenciais aplicações do Hi-C3.0
Esse protocolo foi projetado para permitir 3C ultraprofundos de alta resolução e, ao mesmo tempo, detectar recursos de dobragem em larga escala, como TADs e compartimentos¹⁷ (Figura 6). Este protocolo começa com 5 × 10⁶ células por tubo para cada biblioteca Hi-C, que deve ser material mais do que suficiente para sequenciar uma ou duas pistas em uma célula de fluxo para obter até 1 bilhão de leituras emparelhadas. Para sequenciamento ultraprofundo, múltiplos tubos de 5 × 10⁶ células devem ser preparados, dependendo do número de leituras mapeadas e duplicatas de PCR. Na resolução mais alta (<1 kb), as interações de looping são encontradas principalmente entre os locais da CTCF, mas as interações promotor-potenciador também podem ser detectadas. Os leitores podem consultar Akgol Oksuz et ^al.17 para uma descrição detalhada da análise dos dados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Escada de 1 kb	New England Biolabs	N3232L
Agarose	Invitrogen	16500100
contas magnéticas Agencourt AMPure XP, 60 mL	Beckman Coulter	A63881
Amicon Ultra-0.5 (CFU)	UFC500396		EMD Millipore
(5x)	Veja a receita em materiais
ATP 10 mM	ThermoFisher	R0441
Avanti J-25i Ultra-centrífuga refrigerada de alta velocidade	Beckman Coulter
tubo de ultracentrífuga beckman 35 mL	Beckman Coulter	357002
Binding Buffer (2x)	Veja a receita em materiais
biotina-14-dATP 0.4 mM	Invitrogen	19524-016
BSA 10 mg/mL	New England Biolabs	B9000S	diluído a partir de 20 mg/mL
Raspador de células	Falcon	353089
Raspador de células	Corning	3008
Tubos cônicos de polipropileno 50 mL	Denville	C1062-P
Tubo cônico 15 mL	Denville	C1017-P
Micro tubo Covaris Fibra AFA com tampa de pressão 130 µ L	Covaris	520045/520077
Covaris Sonicator	Covaris	E220/E220evolution/M220
Frasco de cultura 175 cm2	Falcon	353112
Placas de cultura 150 mm x 25 mm	Corning	430599
dATP 1 mM	Invitrogen	56172
dATP 10 mM	Invitrogen	56172
dCTP 10 mM	Invitrogen	56173
DdeI	New England Biolabs	R0175L
dGTP 10 mM	Invitrogen	56174
DMSO	Sigma	D2650-5x10ML
dNTP mix 25 mM	Invitrogen	10297117
Homogeneizador Dounce	DWK Life Sciences	8853010002/8853030002
DPBS	Gibco	14190-144
DpnII	New England Biolabs	R0543M
DSG	ThermoScientific	20593
dTTP 10 mM	Invitrogen	56175
Etanol 70%	Fisher	A409-4	Diluído de 100%
Brometo de Etídio	Fisher	BP1302-10
Formaldeído (37%)	Fisher	BP531-500
Corante de carregamento de gel (6x)	New England Biolabs	B7024S
Glicina em água ultrapura 2.5	M Sigma	G8898-1KG
HBSS	Gibco	14025-092
Igepal CA-630 detergente	MP Biomedicals	198596
Klenow DNA polimerase 5 U/µ L	New England Biolabs	M0210L
Klenow Fragmento 3-->5' exo-, 5 U/µ L	New England Biolabs	M0212L
tampão de ligação (10x)	New England Biolabs	B7203S
Tubo de microcentrífuga LoBind
de DNA de Baixo Peso Molecular	New England Biolabs	N3233L
	materiais
Separador de partículas magnéticas	ThermoFisher	12321D
Tubos de microfuga 1,7 mL	Axygen	MCT-175-C
MyOne Streptavidin C1 grânulos	Invitrogen	65001
NEBuffer 2.1 (10x)	New England Biolabs	B7002S
NEBuffer 3.1 (10x)	New England Biolabs	B7203S
Tubos de PCR (tira)
	Biorad	T100
Pfu Ultra II Buffer (10x)	Agilent		Vem com Pfu Ultra
	Agilent	600674
Tubo de bloqueio de fase 15 mL	Qiagen	129065
Tubos de bloqueio de fase 2 mL	Qiagen	129056
Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico	Invitrogen	15593-049
Coquetel inibidor de protease	ThermoFisher	78440
Proteinase K em água ultrapura 10 mg / mL	Invitrogen	25530-031
Centrífuga Refrigerada	Eppendorf	5810R
RNase A, DNase e protease livre 10 mg/mL	Thermo Scientific	EN0531
Rotator	Argos technologies	EW-04397-40 ou plataforma
SDS 1%	Fisher	BP13111
Acetato de sódio pH = 5,2, 3	M Sigma
Sistema de eletroforese horizontal GT subcelular	Biorad	1704401
T4 DNA ligase 1 U/µ L	Invitrogen	100004817
T4 DNA polimerase	New England Biolabs	M0203L
T4 DNA polimerase	New England Biolabs	M0203L
T4 DNA polimerase 3 U/µ L	New England Biolabs	M0203L
Tampão de ligação T4 (5x)	Invitrogen	Y90001
T4 polinucleotídeo quinase 10 U/µ L	New England Biolabs	M0201L
Centrífuga de mesa	Eppendorf	5425
TBE tampão	Veja a receita em materiais
suplementares Tris Low EDTA Buffer (TLE)	Veja a receita em materiais
Triton X-100 (10%)	Sigma	93443
Truseq adaptador oligos	DNA integrado Technologies (IDT))	https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry	250 nmole e HPLC purificado
Tween 20 detergente	Fisher	9005-64-5
Tween Wash Buffer	Veja a receita em materiais
Vortex	Scientific Industries	(G560)SI-0236