Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante
Neste artigo
Resumo
Resumo
A enterocolite necrosante (NEC) é uma doença devastadora que afeta bebês prematuros, caracterizada por inflamação intestinal e necrose. Os enteróides surgiram recentemente como um sistema promissor para modelar patologias gastrointestinais. No entanto, atualmente utilizados métodos para manipulação enteróide ou não têm acesso à superfície apical do epitélio (tridimensional [3D]) ou são demorados e intensivos em recursos (monocamadas bidimensionais [2D]). Esses métodos muitas vezes requerem etapas adicionais, como a microinjeção, para que o modelo se torne fisiologicamente translacionável. Aqui, descrevemos um protocolo fisiologicamente relevante e barato para estudar nec in vitro , invertendo a polaridade enteroid, resultando na superfície apical voltada para fora (apical-out). Um protocolo de coloração imunofluorescente para examinar a integridade da barreira enteróide e a expressão da proteína juncional após a exposição ao fator de necrose tumoral -alfa (TNF-α) ou lipopólise (LPS) sob condições normóxicas ou hipoxicas também são fornecidos. Também é avaliada a viabilidade de enteróides apical-out 3D expostos a LPS normóxicos ou hipoxicos ou TNF-α por 24 h. Enteroides expostos a LPS ou TNF-α, em combinação com a hipóxia, apresentaram interrupção da arquitetura epitelial, perda de expressão proteica de junção e redução da viabilidade celular. Este protocolo descreve um novo modelo nec-in-a-dish apical-out que apresenta uma plataforma fisiologicamente relevante e econômica para identificar potenciais alvos epiteliais para terapias NEC e estudar a resposta intestinal pré-clusão à terapêutica.
Introdução
A enterocolite necrosante (NEC), doença inflamatória grave do intestino delgado que ocorre em até 10% dos bebês prematuros, está comumente associada à alta morbidade e mortalidade 1,2. As taxas de mortalidade que se aproximam de 50% em bebês com baixo peso ao nascer (<1500 g), que necessitam de intervenção cirúrgica, não são incomuns3. Embora a etiologia exata da NEC não seja compreendida atualmente, acredita-se que fatores de risco, como a alimentação de fórmulas, se compõem com anomalias fisiológicas, como disbiose, epitélio intestinal imaturo e barreira intestinal disfuncional, no de....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos animais deste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oklahoma Health Sciences Center. Amostras de conveniência do intestino delgado de um primata não humano pré-médio (NHP, 90% de gestação, babuíno de oliva, Papio anubis) foram obtidas após eutanásia para estudo separado (Protocolo nº 101523-16-039-I).
1. Estabelecimento do modelo enteroid nec-in-a-dish apical-out
- Preparação de mídias e tratamentos enteróides
NOTA: Uma vez preparada seguindo a técnica asséptica padrão, a mídia pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O uso de enteróides para modelar inflamação intestinal, mesmo dentro do contexto de enterocolite necrosante, agora é comum. No entanto, a maioria dos métodos atualmente utilizados ou não tem acesso à superfície apical dos enteróides, negando a relevância fisiológica dos compostos destinados a eventual uso como terapêutica oral, ou são tecnicamente difíceis e demorados, como acontece com as monocamadas derivadas de enteróides. Para aumentar a utilidade dos modelos enteroid in vitro atuais da NEC, invertemos a pol.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O desenvolvimento recente de modelos enteróides derivados de criptes epiteliais intestinais permite um tecido in vitro mais fisiologicamente relevante no qual estudar a patogênese de enterocolite necrosante. Apesar de incluir todos os principais tipos de células diferenciadas do epitélio intestinal, os enteróides 3D ainda estão sujeitos a várias limitações significativas. Os enteróides convencionais de saída basolateral são suspensos em cúpulas de hidrogel 3D ECM, a composição e a densidade das quais podem limit.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar e não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial dos Institutos Nacionais de Saúde. O HC é apoiado pela concessão P20GM134973 dos Institutos Nacionais de Saúde. A KB é apoiada pela Fundação Hospitalar Infantil (CHF) e pela Fundação Presbiteriana de Saúde (PHF). Agradecemos ao Laboratório de Biologia Molecular e Pesquisa de Citometria da OUHSC pelo uso da Instalação Central, que forneceu imagens confocal.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Tubo cônico de 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo Ensaio de viabilidade de células 3D | Promega | G9681 | |
| Microplacas de 24 poços Corning Costar Ultra-Low Attachment | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Vidro de Cobertura 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
| Anticorpo Secundário Anti-Rato IgG (H+L) Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa Fluor 488 | Anticorpo IgG | A-21202 | |
| Burro, conjugado Cy3 | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco/Mistura de Presunto Nutriente F-12 (DMEM-F12) com tampão HEPES de 15 mM | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Anticorpo E-caderina (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| Solução de formaldeído 4%, tamponado, pH 6,9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | Fiji | N/A | |
| IntestiCult Meio de Crescimento Organoide (Humano) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 Microscópio Confocal | Leica Biosystems | ||
| Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O111:B4, purificados por cromatografia de filtração em gel | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Fisher | Scientific | 12-544-7 | |
| Soro de burro normal | Sigma-Aldrich | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Microplaca de fundo plano | Thermo Scientific | 136101 | |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato), 1x [-] cálcio, magnésio, pH 7,4 | Corning | 21-040-CM | |
| Prolong Glass Antifade Mountant com NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| Anticorpo anti-vilina recombinante [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| TNF-&alfa; proteína 100 µ humano recombinante; g | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
| SpectraMax iD3 Leitor de Microplacas Multimodo | Dispositivos Moleculares | ||
| Incubadora Tri-Gas com Camisa de Água Thermo Forma Série II, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 Iodeto (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tubos, 0,5 mL, tampa plana | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
Referências
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: an immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776(2011).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Jo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
