Artigo de método

Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina

DOI:

10.3791/64015

⸱

29 de junho de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

Neste artigo

Resumo

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Na era da imunoterapia contra o câncer, o interesse em elucidar a dinâmica do microambiente tumoral aumentou de forma impressionante. Este protocolo detalha uma técnica de imagem de espectrometria de massa em relação às suas etapas de coloração e imagem, que permitem uma análise espacial altamente multiplexada.

Resumo

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Os avanços nas terapias imunológicas revolucionaram o tratamento e a pesquisa do câncer. Isso desencadeou uma demanda crescente pela caracterização da paisagem imunológica do tumor. Embora a imunohistoquímica padrão seja adequada para estudar a arquitetura tecidual, limita-se à análise de um pequeno número de marcadores. Por outro lado, técnicas como citometria de fluxo podem avaliar múltiplos marcadores simultaneamente, embora as informações sobre morfologia tecidual sejam perdidas. Nos últimos anos, estratégias multiplexadas que integram a análise fenotípica e espacial surgiram como abordagens abrangentes para a caracterização da paisagem imunológica tumoral. Aqui, discutimos uma tecnologia inovadora que combina anticorpos com rótulos metálicos e espectrometria de massa de íons secundários com foco nas etapas técnicas de desenvolvimento e otimização de ensaios, preparação de tecidos e aquisição e processamento de imagens. Antes da coloração, um painel de anticorpos com etiqueta metálica deve ser desenvolvido e otimizado. Este sistema de imagem hi-plex suporta até 40 anticorpos com etiqueta metálica em uma única seção de tecido. Note-se que o risco de interferência de sinal aumenta com o número de marcadores incluídos no painel. Após o desenho do painel, deve-se dar especial atenção à atribuição do isótopo metálico ao anticorpo para minimizar essa interferência. Testes preliminares do painel são realizados usando um pequeno subconjunto de anticorpos e testes subsequentes de todo o painel em tecidos de controle. Seções de tecido fixas em parafina são obtidas e montadas em lâminas revestidas de ouro e ainda mais manchadas. A coloração leva 2 dias e se assemelha muito à coloração imunohistoquímica padrão. Uma vez que as amostras são manchadas, elas são colocadas no instrumento de aquisição de imagens. Os campos de exibição são selecionados e as imagens são adquiridas, carregadas e armazenadas. O estágio final é a preparação de imagens para a filtragem e remoção de interferências usando o software de processamento de imagens do sistema. Uma desvantagem dessa plataforma é a falta de software analítico. No entanto, as imagens geradas são suportadas por diferentes softwares de patologia computacional.

Introdução

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A importância dos numerosos tipos de células em torno das populações de tumores clonais é um elemento crucial na categorização da carcinogênese. O interesse em elucidar essa composição do microambiente tumoral (TME) e as interações tem aumentado continuamente após o estabelecimento de terapia de base imunológica como parte do arsenal de tratamento do câncer. Portanto, as estratégias de tratamento mudaram de uma abordagem centrada no tumor para uma centrada no TME1.

Os esforços para elucidar os papéis das células imunes na vigilância do tumor e no desenvolvimento do câncer aumentaram de forma impressionante nos último....

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Protocolo

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Amostras de tecido foram obtidas para fins de pesquisa de acordo com o Conselho de Revisão Institucional do Centro de Câncer Anderson da Universidade do Texas, e as amostras foram ainda mais desidentificdas.

1. Seleção de anticorpos

  1. Defina as perguntas de pesquisa para escolher os melhores clones de anticorpos disponíveis. Use o Atlas de Proteína Humana, pesquisa publicada e sites de fabricantes de anticorpos como recursos de pesquisa.
    NOTA: A seleção de controles adequados de tecido humano e os mesmos controles de tecido humano a serem manchados nas diferentes etapas é fundamental para garantir que os marcador....

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Resultados

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As seções de tecido TMA de amígdalas e pulmonares (5 mm de espessura) foram obtidas e colocadas no meio de lâminas revestidas de ouro seguindo as especificações relativas ao tamanho do tecido e margens seguras dos slides. As margens de vidro livres de 5 mm e 10 mm entre a borda do tecido e as bordas laterais e inferiores das lâminas de vidro, respectivamente, são necessárias para uma coloração ideal. As seções de tecido foram assadas durante a noite em um forno antes da coloração para garantir a adequada adesão da seção .......

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Discussão

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A elucidação abrangente das interações complexas e intrincadas entre os múltiplos componentes de um TME continua sendo um objetivo crucial da pesquisa do câncer. Os fabricantes introduziram inúmeros ensaios multiplexados como parte desse esforço, especialmente nos últimos 5 anos. A análise espacial multiplexada é uma ferramenta versátil e poderosa que facilita a categorização simultânea de vários alvos, preservando a morfologia estrutural em amostras de tumores. Técnicas de análise espacial podem ser realizadas utilizand.......

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos para revelar.

Agradecimentos

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Os autores reconhecem Don Norwood dos Serviços de Edição, Biblioteca Médica de Pesquisa na MD Anderson para edição deste artigo e o Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory no Departamento de Patologia Molecular Translacional da MD Anderson. Esta publicação resultou em parte de pesquisas facilitadas pelo apoio científico e financeiro para os Centros de Monitoramento e Análise imune do Câncer-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fornecidos através do National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) para o Centro de Monitoramento e Análise De Câncer do Centro de Câncer da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Insti....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Álcool reagente 100%Sigma-AldrichR8382
Álcool reagente de 95%Sigma-AldrichR3404
Álcool reagente de 80%Sigma-AldrichR3279
Álcool reagente de 70%Sigma-AldrichR315
20X TBS-TIonpath567005
10X PBS de baixo bário pH 7,4Ionpath
10X Tris pH 8.5 Ionpath567003
4° C RefrigeradorThermoScientificREVCO
Pontas de pipeta de barreira de aerossol P10Olympus24-401
Pontas de pipeta de barreira de aerossol P20Olympus24-404
Pontas de pipeta de barreira de aerossol P200Olympus24-412
Pontas de pipeta de barreira de aerossol P1000Olympus24-430
Filtro centrífugo Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
Deionized H2OIonpath567002
Soro de burroSigma-AldrichD9663
Frasco de coloração de lâmina EasyDip, GreenMicroscopy Sciences71385-G
Frasco de coloração de lâmina EasyDip, AmareloMicroscopia eletrônica Sciences71385-Y
EasyDip Kit de Coloração de Lâminas (Jar+Rack), BrancoMicroscopia Eletrônica Sciences71388-01
Suporte de Aço Inoxidável EasyDipMicroscopia Eletrônica Sciences71388-50
Glutaraldeído 70% Grau EMMicroscopia Eletrônica Sciences16360
Tampão de Recuperação de Epítopos Induzidos por Calor (HIER): 10X Tris com EDTA, pH 9DakoS2367
Lâmina resistente ao calor câmaraMicroscopia Eletrônica Sciences62705-01
Caneta de barreira hidrofóbicaFisher50-550-221
MIBI/O softwareIonpathNA
MIBIcontrol softwareIonpathNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
MicrocentrífugaEppendorf5415D
MicrótomoLeicaRM2135
Câmara de Umidade (Câmara Úmida)SimportM922-1
Salina Tamponada com Fosfato (PBS)Módulo Fisher ScientificBP2944100
PTThermo ScientificA80400012
Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis de Fluxo RápidoFisher Scientific097403A
ShakerBioRockerS2025
Coluna de Rotação (Filtro de Rotação Ultrafree-MC, 0.5mL 0.1μ m)MillQUFC30VV00
Forno deslizanteFisher Scientific6901
Dessecador de armário de vácuoVWR30621-076
Chicote de tarefaKimberly Clark34155
XilenoSigma-Aldrich534056-4L
567004Comprimidos de Solução

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
  2. Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvir....

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Tumor MicroenvironmentMass Spectrometry ImagingFormalin Fixed TissueParaffin Embedded TissueMultiplex ImagingMetal Labeled AntibodiesAntibody Panel OptimizationTissue CompartmentalizationCell SegmentationDigital Image Analysis

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