Name: Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Aprenda a usar imagem por espectrometria de massa para analisar o microambiente tumoral em amostras de tecido fixado em formalina e emblocado em parafina. Esta técnica permite caracterizar até 40 marcadores simultaneamente com resolução de célula única.

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Os autores reconhecem Don Norwood dos Serviços de Edição, Biblioteca Médica de Pesquisa na MD Anderson para edição deste artigo e o Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory no Departamento de Patologia Molecular Translacional da MD Anderson. Esta publicação resultou em parte de pesquisas facilitadas pelo apoio científico e financeiro para os Centros de Monitoramento e Análise imune do Câncer-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fornecidos através do National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) para o Centro de Monitoramento e Análise De Câncer do Centro de Câncer da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Institute (CIMAC).

Amostras de tecido foram obtidas para fins de pesquisa de acordo com o Conselho de Revisão Institucional do Centro de Câncer Anderson da Universidade do Texas, e as amostras foram ainda mais desidentificdas.
1. Seleção de anticorpos
<ol><li>Defina as perguntas de pesquisa para escolher os melhores clones de anticorpos disponíveis. Use o Atlas de Proteína Humana, pesquisa publicada e sites de fabricantes de anticorpos como recursos de pesquisa. NOTA: A seleção de controles adequados de tecido humano e os mesmos controles de tecido humano a serem manchados nas diferentes etapas é fundamental para garantir que os marcadores estejam manchados corretamente, no lugar certo e no compartimento celular correto. Uma microarray de tecido pequeno (TMA) incluindo tecido normal e tecidos neoplásicos é sempre recomendado para validação de manchas.</li>
	<li>Use apenas anticorpos livres de portadores para projetar o painel. NOTA: O uso de formulações de anticorpos sem portadores é necessário se um anticorpo comercial sem transporte não estiver disponível; Os kits de purificação podem ser usados para ajustar o anticorpo à formulação correta. Aditivos proteicos como a albumina de soro bovino são conhecidos por diminuir a capacidade de conjugação.</li>
	<li>Teste e titule cada anticorpo usando imunohistoquímica cromogênica padrão para determinar o padrão subcelular da expressão de um marcador; membrana, citoplasmática ou coloração nuclear; e expressão em células específicas em tecidos de controle. NOTA: No entanto, cada anticorpo deve ser testado em citrate pH 6 e pH 9 ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA), e se o painel será manchado com citrato pH 6 ou pH 9 EDTA deve ser determinado. Recomenda-se o uso do pH 9 EDTA para a obtenção de bons sinais, especialmente quando se trabalha com essa metodologia.</li>
	<li>Escolha a concentração de coloração ideal de acordo com o padrão de expressão em controles positivos.</li>
	<li>Atribua cada anticorpo a um dos isótopos metálicos disponíveis de acordo com a abundância de marcadores imunohistoquímicos, localização subcelular e co-expressão celular com os outros alvos.</li>
	<li>Manche o anticorpo com o metal atribuído correspondente e compare com a expressão no mesmo tecido de controle utilizado anteriormente. NOTA: A conjugação metálica de anticorpos começa com preparação de anticorpos, redução e conjugação subsequente (Arquivo Suplementar 1). Cada tubo de polímero carregado de metal é suficiente para rotular 100 μg de um anticorpo.</li>
</ol>2. Design do painel de anticorpos
<ol><li>Crie pequenos lotes de coloração de anticorpos. Teste até cinco marcadores em um coquetel. NOTA: Testar anticorpos já conjugados e analisados usando imunohistoquímica em lotes facilita a identificação precoce de interferências de canais e proporciona a oportunidade de reconjugar os anticorpos com outro metal. Também oferece uma oportunidade de avaliar a co-expressão adequada do marcador.</li>
	<li>Colora cada pequeno lote com quatro concentrações diferentes de anticorpos (0,05 μg/mL, 0,2 μg/mL, 1 μg/mL e 4,0 μg/mL). NOTA: Comparando diferentes títulos, identifique a concentração de anticorpos que resulta na localização correta e na expressão mais alta com a coloração mínima de fundo (melhor relação sinal-ruído).</li>
</ol>3. Seção de tecido FFPE
<ol><li>Selecione slides revestidos de ouro (específicos para este fim) e mantenha-os perto do microtoma. Prepare o microtoma inserindo uma nova lâmina no suporte. Coloque a espessura da seção em 4-5 μm.</li>
	<li>Coloque blocos FFPE no gelo antes de seccionar. Prepare um banho de flutuação tecidual aquecendo água destilada ou água desionizada (diH2O) a 40-45 °C. NOTA: O uso de diH2O ou água destilada reduz a possibilidade de contaminação.</li>
	<li>Comece a seção. Coloque a seção de tecido na água usando pinças e deixe achatar. Use as lâminas para remover seções de tecido da água.</li>
	<li>Coloque os slides em um rack de slides e deixe-os secar à temperatura ambiente durante a noite.</li>
</ol>4. Mancha de anticorpos FFPE
NOTA: O processo de coloração ocorre em dois dias separados.
ATENÇÃO: As soluções empregadas neste protocolo são potencialmente corrosivas e representam riscos para a pele e os olhos. O uso de luvas, um jaleco e equipamentos de proteção para os olhos e rostos é aconselhável e parte da política de biossegurança da nossa instituição.
<ol><li>Preparação do reagente (dia 1)<ol><li>Diluir 50 mL de soro fisiológico 20x tris-tamponado com Tween (TBS-T) em 950 mL de diH2O para fazer 1 L de TBS-T.</li>
		<li>Diluir 8 mL de ácido tris-etilenodiaminetetraacético (EDTA) em 72 mL de diH2O para fazer uma solução de recuperação de epitope induzida pelo calor de 1x (HIER).</li>
		<li>Diluir o soro de burro em 1x TBS-T para uma concentração final de 5% para fazer tampão de bloqueio. Armazene a solução a 4 °C até estar pronta para uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação HIER: Módulo de pré-tratamento (PT) ATENÇÃO: Use luvas de proteção químicas ao manusear quaisquer reagentes ou peças imersas em quaisquer reagentes usados no módulo PT.<ol><li>Diluir 140 mL de salina tamponada com fosfato de 10x (PBS) em 1.260 mL de diH2O para fazer 1,4 L de 1x PBS. Alternativamente, dilui sete comprimidos PBS em 1,4 L de diH2O.</li>
		<li>Encha um tanque com 1,4 L de PBS e coloque o recipiente preparado de câmara de deslizamento com 100 mL de solução HIER 1x no tanque.</li>
		<li>Pré-aqueça o tanque em um módulo PT a 75 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Excesso de remoção de parafina<ol><li>Asse slides a 70 °C em forno por pelo menos 20 min. NOTA: Alguns tecidos ou seções podem precisar de tempos de cozimento mais longos. O tempo recomendado de cozimento para tecido cerebral ou um TMA é de 1 h. Isso pode ser estendido para 16 h (durante a noite) ou de acordo com a experiência de laboratório.</li>
		<li>Coloque lâminas assadas em um suporte de slides e realize as seguintes etapas de lavagem em um shaker sob um capô de fumaça. Lave os slides na seguinte solução: Xileno 2x para 30 s (sem metal), 100% álcool 2x para 30 s (sem metal), 95% álcool 2x para 30 s (sem metal), 80% álcool para 30 s (sem metal), 70% álcool para 30 s (sem metal) e diH2O 2x para 30 s (sem metal).</li>
		<li>Mantenha os slides em um recipiente diH2O fresco até estar pronto para recuperação de antígeno. NOTA: Os slides não devem ser secos até o final do procedimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuperação de antígenos<ol><li>Coloque os slides em uma câmara de slides pré-aquecido contendo 1x tampão HIER dentro do módulo PT. Coloque a tampa no tanque. Feche e grue a tampa.</li>
		<li>Pressione o botão Menu no módulo PT para abrir o menu principal e pressione o botão Ciclo de configuração (tempo e temperatura) para criar um programa personalizado.</li>
		<li>Execute o módulo PT a 97 °C por 40 min. Depois, o módulo PT esfriará automaticamente para 65 °C.</li>
		<li>Remova os slides do módulo PT assim que a temperatura de 65 °C for atingida. Mantenha os slides em temperatura ambiente por 30 minutos. NOTA: O módulo PT não abrirá até que a temperatura esfrie a 65 °C. Não toque na superfície dourada dos slides durante este processo, e use sempre luvas.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueio de anticorpos<ol><li>Coloque um agitador a 70 rpm.</li>
		<li>Lave os slides mergulhando-os em 1x TBS-T por 5 min 2x.</li>
		<li>Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe uma borda ao redor da seção de tecido a pelo menos 1 mm de distância das bordas de deslizamento e deixe-a secar por 15-30 s. NOTA: Tome cuidado para evitar que o fluido da caneta toque na seção tecidual para evitar qualquer interferência tecidual com a coloração. Não pressione a caneta com muita força enquanto desenha a barreira para evitar possíveis vazamentos. Para obter resultados ideais de coloração e aquisição de imagens, as seções de tecido são colocadas no meio dos slides revestidos de ouro em uma estrutura não maior que 15 mm x 30 mm para permitir espaço suficiente para desenhar a barreira sem tocar no tecido ou nos pontos-guia colocados na borda externa do slide.</li>
		<li>Para remover qualquer resíduo de caneta, mergulhe as lâminas em TBS-T.</li>
		<li>Em uma câmara de umidade à temperatura ambiente, incubar a seção de tecido com 100-200 μL de tampão de bloqueio por 20 minutos. Deixe o tecido incubando no tampão de bloqueio até que uma mistura mestre de anticorpos esteja pronta.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do painel de anticorpos NOTA: O volume final do coquetel do painel de anticorpos varia de acordo com a área estimada da superfície da seção tecidual. Para cobrir uma área de 20 mm x 20 mm, prepare 100-200 μL do coquetel. Faça o seguinte para preparar um coquetel de painel de anticorpos de anticorpos conjugados por isótopos metálicos:<ol><li>Confirme o volume final do coquetel que equivale ao volume do coquetel de anticorpos adicionado ao volume do buffer de bloqueio.</li>
		<li>Confirme as especificações de todos os anticorpos, diluições e/ou concentrações de anticorpos em uma planilha de painel para o projeto.</li>
		<li>Gire todos os tubos contendo anticorpos a 10.000 x g por 5 min. Adicione anticorpos individuais ao tampão de bloqueio e misture muito bem. Não perturbe a parte inferior do tubo de anticorpos ao cano-lo.</li>
		<li>Filtre o painel de anticorpos prewetting um dispositivo de filtro centrífugo de 0,1 μm com 100 μL de tampão de bloqueio. Gire o filtro a 10.000 x g por 2 min e remova o fluxo de tampão de bloqueio com uma pipeta.</li>
		<li>Transfira o painel de anticorpos para uma coluna de giro e gire o filtro a 10.000 x g por 2 min. Descarte a coluna de giro e use o fluxo através como o painel de anticorpos filtrado. NOTA: Realize a coloração imediatamente após a realização do coquetel para evitar a troca de metais. Se for necessário o armazenamento do coquetel de anticorpos por um tempo prolongado, ele pode ser submetido à liofilização.</li>
	</ol></li>
	<li>Mancha de anticorpos<ol><li>Remova cuidadosamente o buffer de bloqueio dos slides, derrubando cada slide de lado e tocando suavemente as bordas contra um limpador de tarefas.</li>
		<li>Coloque os slides em uma câmara de umidade e adicione 100-200 μL de mistura mestre de anticorpos ao tecido (evite o contato com o tecido e a criação de bolhas de ar).</li>
		<li>Adicione slides de controle positivos e negativos ao lote de coloração.</li>
		<li>Incubar os slides a 4 °C durante a noite (14-16 h).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do reagente (dia 2)<ol><li>Diluir 100 mL de 10x de baixo bário PBS, pH 7.4, em 900 mL de diH2O para fazer 1x PBS.</li>
		<li>Prepare 350 mL de uma solução de estoque de trabalho de 2% glutaraldeído em PBS de baixo bário (340 mL de pbs de baixo bário + 10 mL de 70% glutaraldeído). NOTA: Realize a diluição sob um capô. Glutaraldeído é um líquido muito viscoso. Use uma pipeta de 1 mL e adicione 1 mL de PBS de baixo bário ao tubo de glutaraldeído toda vez até que se torne líquido o suficiente para sair do tubo.</li>
		<li>Diluir 10x Tris, pH 8.5, em 900 mL de diH20 para fazer 1x Tris.</li>
	</ol></li>
	<li>Fixação e desidratação<ol><li>Remova a mistura mestre de anticorpos de cada slide derrubando o slide de lado e tocando suavemente a borda contra um limpador de tarefas.</li>
		<li>Lave os slides com agitação leve a moderada nos seguintes buffers: 1x TBS-T, 3x vezes por 5 min cada (sem metais); filtrado 2% glutaraldeído por 5 min; filtrado 1x tris, pH 8.5, 3x para 30 s; filtrado diH2O 2x para 30 s; 70% de álcool para 30 s (sem metal); 80% de álcool para 30 s (sem metal); 95% de álcool para 30 s (sem metal); e 100% álcool para 30 s (sem metal).</li>
		<li>Bata suavemente a borda de cada lâmina contra um limpador de tarefas para remover o excesso de álcool e permitir que o álcool residual evapore à temperatura ambiente (~5-10 min).</li>
		<li>Lâminas secas em um desiccator por pelo menos 1 h antes da aquisição de imagem ou mantenham os slides em uma câmara de vácuo para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Aquisição de imagens
<ol><li>Configuração de slides NOTA: Antes de digitalizar o instrumento, os slides devem ser definidos e configurados usando o aplicativo de gerenciamento de imagem baseado na Web seguindo as etapas descritas abaixo.<ol><li>Na página de slides no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web, clique em Accession New Slide e digite os detalhes desejados (nome, identificação de slides, localização e descrição).</li>
		<li>Crie seções de digitalização clicando em Adicionar seção. Preencha as informações de cada seção (nome do projeto, nome do slide, bloco e posição). Para salvar os novos slides/seções criados, clique em Enviar.</li>
		<li>Na guia recursos, abra a página dos painéis e selecione o painel a ser usado. Para novos painéis, clique em Criar novo painel.</li>
		<li>Depois de selecionar o painel, clique em Seções. Adicione as seções criadas na etapa 2. clicando em Editar atribuição de seção. Salvar clicando em Enviar.</li>
	</ol></li>
	<li>Configuração do instrumento NOTA: Este instrumento (ver Tabela de Materiais) é operado usando um programa de software de controle específico (ver Tabela de Materiais).<ol><li>Faça login no software de controle. Clique em Acordar se o instrumento estiver em modo de sono. NOTA: Pelo menos 1h antes da operação, recomenda-se o aquecimento do instrumento, o que ajuda na estabilização do foco do feixe.</li>
		<li>Para carregar um slide, clique em Trocar amostras e clique em Continuar abrindo a porta. Coloque o slide no slot de carregamento com a amostra voltada para cima e a etiqueta à direita. Clique em Continuar fechando a porta. NOTA: Se o slide não estiver carregado corretamente, um som de aviso e uma notificação para ajustar o slide aparecerão.</li>
		<li>Selecione o projeto e selecione o nome de slides para a amostra carregada.</li>
		<li>Visualize a imagem panorâmica no painel óptico de slides.</li>
	</ol></li>
	<li>Seleção e aquisição do Campo de Visão (FOV)<ol><li>Clique no menu Modo e selecione SED (Detector de Elétrons Secundário). Clique no menu do modo de imagem e escolha QC −300 μm.</li>
		<li>Clique em Jog Stage para controlar o local FOV e clique nas setas para navegar e selecione a posição do FOV.</li>
		<li>Clique em Adicionar FOV, defina 400 μm x 400 μm como o tamanho do campo e selecione bem como o modo de imagem e 1 ms de tempo de moradia. Clique em Confirmar. NOTA: O tempo definido dependerá da resolução desejada. O tempo de moradia aumenta à medida que a resolução aumenta. O tempo de aquisição pode variar dependendo de vários fatores, incluindo período de arrombamento do detector e duração da operação. Nosso tempo médio de aquisição para um FOV é de cerca de 17 minutos. Use o instrumento sem parar por até 8 h, o que permite a digitalização de cerca de 28 FOVs. A qualidade das imagens adquiridas diminui após muitas horas consecutivas de uso.</li>
		<li>Depois de criar uma lista de ESPUMA, proceda ao foco da imagem e ajuste a estigma movendo o feixe para uma região de tecido que não será imageda. Ajuste os parâmetros até que uma imagem central clara seja obtida. NOTA: Para otimizar a aquisição de imagens, manter a seção de tecido centralizada no slide é ideal. Ao se concentrar, uma imagem clara apenas da área central pode ser obtida. Se a seção tecidual for muito grande, as bordas estarão fora de foco, e a imagem será borrada.</li>
		<li>Clique em Iniciar Run. As imagens adquiridas serão automaticamente carregadas e armazenadas no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Preparação de imagens
<ol><li>Correção isobárica de imagem NOTA: O objetivo da correção isobárica é remover o sinal de derramamento entre os canais resultantes da presença de isótopos de massa igual ou muito semelhante cujas diferenças de massa não podem ser detectadas usando o analisador de massa.<ol><li>No aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web, clique no ícone green Download para salvar as imagens FOVs (TIFF).</li>
		<li>Baixe a versão mais atualizada do software de processamento de imagens (ver Tabela de Materiais) disponível na guia sobre no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web e salve-o em um arquivo. Abra o arquivo de arquivo .zip e siga as etapas de instalação. Abra o software assim que a instalação estiver concluída.</li>
		<li>Selecione a pasta que contém as imagens a serem corrigidas clicando no ícone Arquivo no painel de entrada do software de processamento de imagens. Uma lista FOV será carregada.</li>
		<li>Clique no ícone Filtro no painel de entrada para aplicar correções padrão. Para cada canal, visualize imagens obtidas antes e depois da correção no lado direito da tela.</li>
		<li>Clique no ícone disquete no painel de saída para salvar a imagem corrigida.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtragem de imagem: Tessellation Voronoi NOTA: Os diagramas de tessellation voronoi ilustram uma divisão do espaço contendo pontos de sementes nas células Voronoi. O objetivo é estimar a densidade celular e definir limites celulares. Usando o cálculo de tessellation Voronoi, uma máscara é gerada e aplicada à imagem original para filtragem.<ol><li>Clique na guia Filtragem e selecione Voronoi Tesselation no menu de parâmetros de filtragem.</li>
		<li>No painel de entrada, selecione a imagem masscorrected.tiff. Clique no ícone Filtro no painel de entrada.</li>
		<li>Clique no ícone disquete no painel de saída para salvar a imagem filtrada. Os dois arquivos resultantes terão os sufixos -Filtrados.tiff e -Filtrados.json. NOTA: A imagem chamada MassCorrected-Filtered.tiff então pode ser enviada para um programa de software de análise digital de terceiros ou um programa de software de código aberto.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos para revelar.

A elucidação abrangente das interações complexas e intrincadas entre os múltiplos componentes de um TME continua sendo um objetivo crucial da pesquisa do câncer. Os fabricantes introduziram inúmeros ensaios multiplexados como parte desse esforço, especialmente nos últimos 5 anos. A análise espacial multiplexada é uma ferramenta versátil e poderosa que facilita a categorização simultânea de vários alvos, preservando a morfologia estrutural em amostras de tumores. Técnicas de análise espacial podem ser realizadas utilizand...

A importância dos numerosos tipos de células em torno das populações de tumores clonais é um elemento crucial na categorização da carcinogênese. O interesse em elucidar essa composição do microambiente tumoral (TME) e as interações tem aumentado continuamente após o estabelecimento de terapia de base imunológica como parte do arsenal de tratamento do câncer. Portanto, as estratégias de tratamento mudaram de uma abordagem centrada no tumor para uma centrada no TME1.
Os esforços para elucidar os papéis das células imunes na vigilância do tumor e no desenvolvimento do câncer aumentaram de forma impressionante nos últimos anos 2,3. Na pesquisa médica, uma infinidade de métodos, incluindo métodos baseados em citometria e tecnologias de imagem singleplex e multiplex, surgiu como parte dessa tentativa de decifrar as interações únicas de múltiplos elementos de TMEs.
Métodos pioneiros como citometria de fluxo (inventada na década de 1960), classificação celular ativada por fluorescência e citometria de massa são focados principalmente na identificação e quantificação dos componentes TME4. Embora as técnicas quantitativas baseadas em citometria permitam fenotipagem da paisagem imunológica, determinar a distribuição espacial celular é impossível. Por outro lado, métodos como a imunohistoquímica singleplex padrão preservam a arquitetura tecidual e permitem aos pesquisadores analisar a distribuição celular, embora um número reduzido de alvos em uma única seção de tecido seja uma limitação desses métodos 5,6. Nos últimos anos, tecnologias de imagem multiplexed para resolução unicelular, como imunofluorescência multiplex, imagem de fluorescência de codificação de barras e espectrometria de massa de imagem surgiram como estratégias abrangentes para a aquisição de informações sobre coloração simultânea de marcadores usando a mesma seçãode tecido 7.
Aqui apresentamos uma tecnologia que casa anticorpos com etiqueta metálica e espectrometria de massa de íons secundários e permite quantificação de resolução de células únicas, co-expressão de marcador (fenotipagem) e análise espacial usando amostras de tecido 8,9. As amostras de FFPE são os materiais mais utilizados para amostras de arquivamento de tecidos e representam um recurso mais facilmente disponível para tecnologias de imagem multiplexada do que amostras congeladas frescas10. Além disso, essa tecnologia oferece a possibilidade de readquirivelmente imagens meses depois. Aqui, discutimos nossos protocolos de coloração e processamento de imagens usando amostras de tecido FFPE.

<table><tbody><tr><td>Álcool reagente 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td></td></tr><tr><td>Álcool reagente de 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3404</td><td></td></tr><tr><td>Álcool reagente de 80%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3279</td><td></td></tr><tr><td>Álcool reagente de 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R315</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS-T</td><td>Ionpath</td><td>567005</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS de baixo bário pH 7,4</td><td>Ionpath</td><td></td><td></td>567004</tr><tr><td>10X Tris pH 8.5&nbsp;</td><td>Ionpath</td><td>567003</td><td></td></tr><tr><td>4&deg; C Refrigerador</td><td>ThermoScientific</td><td>REVCO</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira de aerossol P10</td><td>Olympus</td><td>24-401</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira de aerossol P20</td><td>Olympus</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira de aerossol P200</td><td>Olympus</td><td>24-412</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de barreira de aerossol P1000</td><td>Olympus</td><td>24-430</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrífugo Ultrafree-MC</td><td>Fisher Scientific</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Deionized H2O</td><td>Ionpath</td><td>567002</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de coloração de lâmina EasyDip, Green</td><td>Microscopy Sciences</td><td>71385-G</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de coloração de lâmina EasyDip, Amarelo</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>71385-Y</td><td></td></tr><tr><td>EasyDip Kit de Coloração de Lâminas (Jar+Rack), Branco</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>71388-01</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Aço Inoxidável EasyDip</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>71388-50</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído 70% Grau EM</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>16360</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Recuperação de Epítopos Induzidos por Calor (HIER): 10X Tris com EDTA, pH 9</td><td>Dako</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina resistente ao calor câmara</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>62705-01</td><td></td></tr><tr><td>Caneta de barreira hidrofóbica</td><td>Fisher</td><td>50-550-221</td><td></td></tr><tr><td>MIBI/O software</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MIBIcontrol software</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MIBIslide</td><td>Ionpath</td><td>567001</td><td></td></tr><tr><td>MIBIscope</td><td>Ionpath</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Umidade (Câmara Úmida)</td><td>Simport</td><td>M922-1</td><td></td>Comprimidos</tr> de Solução <tr><td>Salina Tamponada com Fosfato (PBS)</td><td>Módulo Fisher Scientific</td><td>BP2944100</td><td></td></tr><tr><td>PT</td><td>Thermo Scientific</td><td>A80400012</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de Filtro Descartáveis Estéreis de Fluxo Rápido</td><td>Fisher Scientific</td><td>097403A</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>BioRocker</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de Rotação (Filtro de Rotação Ultrafree-MC, 0.5mL 0.1&mu; m)</td> <td>MillQ</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Forno deslizante</td><td>Fisher Scientific</td><td>6901</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador de armário de vácuo</td><td>VWR</td><td>30621-076</td><td></td></tr><tr><td>Chicote de tarefa</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Os avanços nas terapias imunológicas revolucionaram o tratamento e a pesquisa do câncer. Isso desencadeou uma demanda crescente pela caracterização da paisagem imunológica do tumor. Embora a imunohistoquímica padrão seja adequada para estudar a arquitetura tecidual, limita-se à análise de um pequeno número de marcadores. Por outro lado, técnicas como citometria de fluxo podem avaliar múltiplos marcadores simultaneamente, embora as informações sobre morfologia tecidual sejam perdidas. Nos últimos anos, estratégias multiplexadas que integram a análise fenotípica e espacial surgiram como abordagens abrangentes para a caracterização da paisagem imunológica tumoral. Aqui, discutimos uma tecnologia inovadora que combina anticorpos com rótulos metálicos e espectrometria de massa de íons secundários com foco nas etapas técnicas de desenvolvimento e otimização de ensaios, preparação de tecidos e aquisição e processamento de imagens. Antes da coloração, um painel de anticorpos com etiqueta metálica deve ser desenvolvido e otimizado. Este sistema de imagem hi-plex suporta até 40 anticorpos com etiqueta metálica em uma única seção de tecido. Note-se que o risco de interferência de sinal aumenta com o número de marcadores incluídos no painel. Após o desenho do painel, deve-se dar especial atenção à atribuição do isótopo metálico ao anticorpo para minimizar essa interferência. Testes preliminares do painel são realizados usando um pequeno subconjunto de anticorpos e testes subsequentes de todo o painel em tecidos de controle. Seções de tecido fixas em parafina são obtidas e montadas em lâminas revestidas de ouro e ainda mais manchadas. A coloração leva 2 dias e se assemelha muito à coloração imunohistoquímica padrão. Uma vez que as amostras são manchadas, elas são colocadas no instrumento de aquisição de imagens. Os campos de exibição são selecionados e as imagens são adquiridas, carregadas e armazenadas. O estágio final é a preparação de imagens para a filtragem e remoção de interferências usando o software de processamento de imagens do sistema. Uma desvantagem dessa plataforma é a falta de software analítico. No entanto, as imagens geradas são suportadas por diferentes softwares de patologia computacional.

As seções de tecido TMA de amígdalas e pulmonares (5 mm de espessura) foram obtidas e colocadas no meio de lâminas revestidas de ouro seguindo as especificações relativas ao tamanho do tecido e margens seguras dos slides. As margens de vidro livres de 5 mm e 10 mm entre a borda do tecido e as bordas laterais e inferiores das lâminas de vidro, respectivamente, são necessárias para uma coloração ideal. As seções de tecido foram assadas durante a noite em um forno antes da coloração para garantir a adequada adesão da seção ...

Na era da imunoterapia contra o câncer, o interesse em elucidar a dinâmica do microambiente tumoral aumentou de forma impressionante. Este protocolo detalha uma técnica de imagem de espectrometria de massa em relação às suas etapas de coloração e imagem, que permitem uma análise espacial altamente multiplexada.

Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

Esses protocolos permitem quantificação de resolução de células únicas, co-expressão de marcadores e uma análise especial usando amostras de tecido congelado com estatação fixa e parafina parafina para elucidar os papéis das células imunes no câncer. Esta técnica é uma ferramenta poderosa que facilita a caracterização simultânea de um marcador 40 em uma única seção de tecido, preservando amplamente a estrutura do tecido nas amostras. O passo crítico é a otimização e validação de anticorpos.A não conclusão da etapa pode resultar em imagens de baixa qualidade que podem comprometer a retenção de dados e resultados reprodutíveis de alta qualidade. Comece girando para baixo todos os anticorpos contendo tubos a 10.000 x G por cinco minutos, adicione anticorpos individuais ao tampão de bloqueio e misture bem. Não perturbe a parte inferior do tubo de anticorpos ao cano-lo.Filtre o painel de anticorpos pré-molhando um dispositivo de filtro centrífugo de 0,1 micrômetro com 100 microliters de tampão de bloqueio. Gire o filtro a 10.000 x G por dois minutos e remova o fluxo de tampão de bloqueio com uma pipeta. Em seguida, transfira o painel de anticorpos para uma coluna de giro e gire o filtro a 10.000 x G por dois minutos.Descarte a coluna de giro e use o fluxo através como o painel de anticorpos filtrado. Para a coloração do anticorpo, remova o tampão de bloqueio dos slides, derrubando cada slide de lado e tocando suavemente as bordas contra um limpador de tarefas. Coloque os slides em uma câmara de umidade e adicione 100 a 200 microliters de mistura mestre de anticorpos ao tecido.Adicione slides de controle positivos e negativos ao lote de coloração e incubar os slides a 4 graus Celsius durante a noite. Para configurar o instrumento, faça login no software de controle e clique em Wake Up, se o instrumento estiver no modo de sono. Clique em Trocar amostra para carregar um slide e, em seguida, clique em Continuar abrindo a porta.Coloque o slide no slot de carregamento com uma amostra voltada para cima e a etiqueta à direita, clique em Continuar a fechar a porta. Selecione o projeto e selecione o nome de slides para a amostra carregada. Visualize a imagem panorâmica no painel de imagem óptica de slide para o campo de exibição ou seleção FOV, clique no menu Mode e selecione O Detector de Elétrons Secundário, em seguida, clique no menu modo de imagem e escolha QC 300 micrômetro.Clique em Jog Stage para controlar o local FOV e clique nas setas para navegar e selecione a posição do FOV. Clique em adicionar FOV, defina 400 micrômetros por 400 micrômetros como o tamanho do campo e selecione Fine como o Modo de Imagem e 1 milissegundo de Dwell Time, clique em Confirmar. Depois de criar uma lista de FOV, proceda ao foco da imagem e ajuste a Estigmas movendo o feixe para uma região de tecido que não será imageda.Ajuste os parâmetros até que uma imagem central clara seja obtida, clique em Iniciar Run. As imagens adquiridas serão automaticamente carregadas e armazenadas no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web. A matriz mostrada aqui descreve a porcentagem de crosstalk derivada da pureza da sonda e óxidos.Aqui as caixas azuis indicam maior ou igual a 0,5% de crosstalk e caixas claras indicam menos de 0,5% de crosstalk. Para as tags de massa, sondas que contribuíram com pelo menos 0,5% de crosstalk em nenhum canal, um ou dois canais, ou mais de dois canais são mostrados aqui. Canais em massa que recebem pelo menos 0,5% de crosstalk de nenhuma sonda, uma ou duas sondas, ou mais de duas sondas também são mostrados.As imagens representativas de coloração em diferentes tecidos como adenocarcinoma pulmonar, rim não neoplásico e amígdalas são retratadas aqui. Uma imagem de uma seção de tecido de amígdalas manchada usando essa técnica e visualizada usando um programa de software de análise de imagem digital de terceiros antes de filtrar e corrigir é apresentada aqui. A imagem da mesma seção sob as mesmas condições após as etapas de filtragem e correção é mostrada aqui.Esse método gera imagens que podem ser carregadas para um software de análise de imagem digital de terceiros, permitindo análises abrangentes como compartimentação de tecidos, segmentação celular, co-expressão de marcadores, bem como análise de vizinhos e análises distantes. Métodos de imagem altamente multiplex estão disponíveis através de pesquisas. Ao construir diferentes painéis, os pesquisadores podem investigar amostras de câncer, normal, paraneoplásica, inflamatória e infecciosa.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Análises aprofundadas de proteomas de células cancerígenas facilitam a identificação de novos alvos de drogas e biomarcadores diagnósticos. Descrevemos um fluxo de trabalho experimental para análise quantitativa de (fosfo-)proteomas em subpopulações de células cancerígenas derivadas de tumores líquidos e sólidos. Isso é conseguido combinando estratégias de enriquecimento celular com espectrometria de massa quantitativa baseada em Super-SILAC.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

Aqui nós descrevemos um método para separar e enriquecer os componentes do microambiente de imune e não imune a tumor em tumores subcutâneos estabelecidas. Esta técnica permite a análise separada de infiltrar imune tumor e frações não imune tumor que podem permitir a caracterização abrangente do microambiente imune do tumor.

Enriquecimento e caracterização do microambiente que imune e não imune Tumor em tumores murino subcutâneos estabelecidas

Um novo método de preparação da amostra foi desenvolvido para acomodar coculture célula e tecido para detectar a troca de pequena molécula usando espectrometria de massa de imagens.

Capturando a molécula pequena comunicação entre os tecidos e células usando a imagem latente de espectrometria de massa

Aqui, descrevemos uma estratégia simples e acessível para visualizar, quantificar e mapear células imunes em seções de tecido tumoral parafina fixada em formalina. Essa metodologia combina técnicas de imagem e análise digital existentes com o objetivo de ampliar a capacidade de multiplexação e a análise multiparâmetro de ensaios de imagem.

Visualização, Quantificação e Mapeamento de Populações de Células Imunes no Microambiente tumoral

Este protocolo apresenta um método para aumentar o conteúdo percentual de tumores de amostras de tecido embutidas em parafina.

Melhorando o conteúdo do tumor através da macrodisseção do tumor

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de alto rendimento para segmentação de regiões de interesse confirmadas pela patologia de imagens de seção de tecidos manchados e finos para enriquecimento de populações celulares resolvidas por histologia usando microdisseção a laser. Esta estratégia inclui um novo algoritmo que permite a transferência de demarcações denotando populações celulares de interesse diretamente para microscópios a laser.

Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

Neste artigo, um protocolo para amplificação manual do sinal de tiramida (TSA) por imunofluorescência multiplex (mIF) combinado com análise de imagem e análise espacial é descrito. Este protocolo pode ser usado com cortes fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) para a coloração de dois a seis antígenos por lâmina, dependendo do scanner de lâminas disponível no laboratório.

Imunofluorescência Multiplex Combinada com Análise Espacial de Imagens para Avaliação Clínica e Biológica do Microambiente Tumoral

Este artigo descreve um protocolo de imunofluorescência multiplex otimizado para caracterizar a arquitetura tridimensional de metástases peritoneais.

Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

Aqui, estabelecemos um método proteômico baseado em espectrometria de massa usando regiões isoladas de interesse em seções de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina. Este protocolo é usado para analisar o proteoma de áreas específicas do tecido em seções de tecido arquivadas fixadas em formalina e embebidas em parafina.

Uma abordagem simplificada para proteômica baseada em espectrometria de massa usando regiões de tecido selecionadas

Este protocolo fornece um guia passo a passo para projetar um painel de anticorpos de imunofluorescência multiplex para imagens baseadas em código de barras de DNA de tecidos murinos de melanoma FFPE. Também descrevemos um pipeline de análise de imagem usando ferramentas de código aberto para gerar insights proteômicos espaciais sobre o microambiente imunológico do tumor de melanoma murino.

Imagem de imunofluorescência multiplex baseada em código de barras de DNA para analisar amostras FFPE de melanoma murino geneticamente reprogramado

Aprenda a usar imagem por espectrometria de massa para analisar o microambiente tumoral em amostras de tecido fixado em formalina e emblocado em parafina. Esta técnica permite caracterizar até 40 marcadores simultaneamente com resolução de célula única.

Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina (Vídeo) | JoVE Journal

Expandindo a compreensão do microambiente tumoral usando imagens de espectrometria de massa de amostras de tecido fixo e parafina

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