Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Summary

Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Abstract

Os osteoclasstos maduros são células multinucleadas que podem degradar o osso através da secreção de ácidos e enzimas. Eles desempenham um papel crucial em várias doenças (por exemplo, osteoporose e câncer ósseo) e, portanto, são objetos importantes de pesquisa. In vitro, sua atividade pode ser analisada pela formação de poços de resorção. Neste protocolo, descrevemos um método simples de ensaio de poços usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio (CaP), que podem ser facilmente visualizadas e quantificadas. Precursores osteoclastas derivados de células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMCs) foram cultivados nas placas revestidas na presença de estímulos osteoclastogênicos. Após 9 dias de incubação, os osteoclastas foram fixadas e manchadas para imagens de fluorescência, enquanto o revestimento cap foi contra-manchado por calcein. Para quantificar a área resorbedada, o revestimento cap em placas foi manchado com 5% AgNO₃ e visualizado por imagens de campo brilhante. A área do poço de resorção foi quantificada por meio do ImageJ.

Introduction

Os osteoclalts (OCs) são macrófagos específicos do tecido derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), desempenhando um papel fundamental na remodelagem óssea juntamente com os osteoblastos¹. Distúrbios ósseos induzidos por hormônios sexuais, imunológicos e malignos que destroem osso sisticamente ou localmente são devido ao excesso de atividade osteoclástica, incluindo osteoporose relacionada à menopausa², artrite reumatoide³, doença periodontal⁴, doença óssea de mieloma⁵ e metástase^{óssea osteolítica 6}. Em contraste, de....

Protocol

O protocolo foi revisado e aprovado pelo comitê de ética local (aprovação nº 287/2020B02).

1. Preparação de placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio

1. Preparação de solução de estoque de cálcio (25 mM CaCl₂·2H₂O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl₂·6H₂O no buffer Tris)
   1. Prepare o buffer tris de 1,0 M e ajuste o pH para 7,4 usando 1 M HCl.
   2. Configure um béquer de vidro em um agitador magnético e adicione 100 mL de tampão tris de 1,0 M.
   3. Pesar 0,368 g de CaCl₂·2H₂O, 8,0 g de NaCl e 0,305 g de MgCl₂·6H₂

Results

O revestimento de fosfato de cálcio na parte inferior das placas de cultura celular foi realizado em duas etapas de revestimento que compreendem uma pré-calcificação de 3 dias e uma etapa de calcificação de 1 dia. Como mostrado na Figura 1, o fosfato de cálcio distribuído uniformemente foi obtido na parte inferior das placas de 96 poços. O revestimento aderiu muito bem ao fundo após as etapas de lavagem realizadas.

Discussion

Aqui descrevemos um método simples e confiável para um ensaio de ressorção osteoclástica usando OCs derivados e expandidos in vitro a partir de PBMCs. As placas de cultura celular revestidas de CaP usadas podem ser facilmente preparadas e visualizadas usando materiais disponíveis em laboratório. Além dos PBMCs não variados adotados neste protocolo, os OCs gerados a partir de células monócíticas murinas²¹ e células macrófagos de medula óssea¹⁷ também foram cultivado.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electroforese GmbH	35110	Nitrato
de prata a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alfa, GlutaMAX, sem nucleosídeos
anfotericina B	Biochrom	03-028-1B	Solução de anfotericina B
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Cloreto de cálcio di-hidratado
Calceína	Sigma-Aldrich	C0875	Calceína
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	soro bovino fetal
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Tampão de fixação	Biolegend	420801	Paraformaldeído
HCl	Merk	1.09057.1000	Ácido clorídrico
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Humano Recombinante M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Cloreto de magnésio
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- hidrogenofosfato de sódio anidro
NaCl	Merk	S7653-250G	cloreto de sódio
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonato de Sódio
PBS	Lonza	17-512F	Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (1X), DBPS sem cálcio e magnésio
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Mistura de penicilina-estreptomicina
Faloidina-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Faloidina
RANKL	PeproTech	310-01	Ligante sRANK humano recombinante (derivado de E.coli)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris (hidroximetil) aminometano
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alquil fenil polietilenoglicol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Enzimas de dissociação celular recombinante