Summary
Визуальная, одномолекулярная биохимия, изучаемая через микрофлюидные камеры, значительно облегчается с помощью стеклянной бочки, газонепроницаемых шприцев, стабильных соединений трубки с проточными клетками и устранения пузырьков путем размещения переключающих клапанов между шприцами и трубками. Протокол описывает двойные оптические ловушки, которые позволяют визуализировать транзакции ДНК и межмолекулярные взаимодействия.
Abstract
Визуальная биохимия является мощным методом наблюдения стохастических свойств отдельных ферментов или ферментных комплексов, которые скрыты при усреднении, которое происходит в объемно-фазовых исследованиях. Для достижения визуализации двойные оптические пинцеты, где одна ловушка фиксирована, а другая подвижна, фокусируются в одном канале многопоточной микрофлюидной камеры, расположенной на ступени перевернутого флуоресцентного микроскопа. Оптический пинцет улавливает отдельные молекулы флуоресцентно меченой ДНК и жидкости, протекающей через камеру и мимо захваченных шариков, растягивает ДНК до В-формы (под минимальной силой, то есть 0 пН) с нуклеиновой кислотой, наблюдаемой в виде белой нити на черном фоне. Молекулы ДНК перемещаются из одного потока в другой, переводя стадию перпендикулярно потоку, чтобы обеспечить инициирование реакций контролируемым образом. Для достижения успеха микрофлюидные устройства с оптически чистыми каналами соединяют со стеклянными шприцами, удерживаемыми на месте в шприцевом насосе. Оптимальные результаты используют соединители, постоянно связанные с проточной ячейкой, трубки, которые являются механически жесткими и химически стойкими, и которые подключены к переключающим клапанам, которые устраняют пузырьки, препятствующие ламинарному потоку.
Introduction
Способность визуализировать взаимодействия белка и ДНК на уровне одной молекулы и в режиме реального времени обеспечила значительное понимание стабильности генома 1,2. В дополнение к работе с отдельными молекулами ДНК по одной за раз, возможность просматривать транзакции между отдельными молекулами поблизости обеспечивает дополнительное понимание 3,4,5. Манипулирование дополнительными молекулами ДНК требует как дополнительных оптических ловушек, так и высококачественных, многоканальных, микрофлюидных проточных клеток6.
Существует несколько методов создания более одной оптической ловушки. К ним относятся сканирующие зеркала гальванометра, акустические оптические модуляторы и дифракционная оптика, которые генерируют голографический оптический пинцет 4,7,8,9. Часто сканирующие зеркала и акустические оптические модуляторы производят ловушки, которые делят время. В описанной здесь установке луч одного лазера Nd:YAG расщепляется на поляризацию, а затем лазерные сканирующие зеркала гальванометра контролируют положение того, что называется мобильной ловушкой (рисунок 1)4. Для облегчения позиционирования зеркал и фильтров для направления улавливающего луча на заднюю апертуру объектива микроскопа используется лазер HeNe. Это облегчает общее выравнивание, так как луч HeNe виден невооруженным глазом, в то время как инфракрасные лучи — нет. Луч HeNe также безопаснее для работы, что делает позиционирование зеркал и других компонентов менее напряженным. Первоначально путь луча для этого лазера отделен от луча 1064 нм, но вводится в тот же путь луча, а затем в объектив микроскопа. Как только физическое выравнивание достигнуто, позиционирование луча 1064 нм поверх луча HeNe выполняется, и это облегчается использованием инфракрасного средства просмотра и различных инструментов визуализации луча для визуализации положения и качества луча. Затем вводится расширитель луча, и полученный расширенный инфракрасный луч выравнивается по задней диафрагме объектива. Наконец, цель удаляется, а мощность в каждом поляризованном луче измеряется и регулируется с использованием волновых пластин λ/2, чтобы быть равной (рисунок 1C). Измерения мощности также выполняются после возврата цели, и обычно происходит потеря мощности 53%. Однако имеется достаточная мощность для формирования устойчивых фиксированных и движущихся оптических ловушек в фокальной плоскости (рисунок 1D).
Для получения изображений транзакций ДНК микрофлюидные проточные клетки играют ключевую роль, поскольку они позволяют проводить контролируемые измерения на уровне одной молекулы с высоким пространственным и временным разрешением (рисунок 2). Термин микрофлюидный относится к способности манипулировать жидкостями в одном или нескольких каналах с размерами от 5-500 мкмдо 10,11. Термин поток относится к фактической жидкости в канале, а канал относится к физическому каналу, в котором движется поток жидкости или потоки. Конструкция одноканальной проточной ячейки имеет общий физический канал, где наблюдаются реакции, и обычно присутствует только один поток жидкости. Таким образом, эти конструкции известны как однопоточные проточные ячейки. Напротив, многопоточные проточные ячейки определяются как микрофлюидное устройство, в котором два или более входных канала сходятся в один, общий, физический канал (рисунок 2A). В пределах общего канала потоки жидкости, которые исходят из отдельных каналов, текут параллельно друг другу и остаются разделенными с минимальным перемешиванием между ними, происходящим из-за диффузии (рисунок 2B). В большинстве экспериментальных установок один насос проталкивает жидкости в каждый канал с одинаковой скоростью. Напротив, когда используется граничное рулевое управление, три или более независимо управляемых насосов проталкивают жидкости через каналы. Однако каждый насос работает с разной скоростью, но чистый расход в общем канале постоянен12. Это позволяет быстро менять компоненты основного канала, просто изменяя скорость насоса.
В дополнение к ламинарному потоку, другим критическим фактором является профиль параболической скорости в ламинарном потоке жидкости. Самая высокая скорость потока происходит в середине потока, а самая медленная - рядом с поверхностями (рисунок 2C)13. Этот профиль должен рассматриваться как полностью растягивающий молекулу ДНК, которая прикреплена к шарику, удерживаемому в потоке, для точной визуализации флуоресцентной ДНК и точных одномолекулярных анализов. Здесь ДНК растягивается до В-формы и удерживается на месте под 0 пН силы. Для этого фокусировка положения оптической ловушки должна быть в положении 10-20 мкм от нижней поверхности крышки (рисунок 2D). Необходимо соблюдать осторожность, чтобы молекула ДНК не растягивалась за пределы В-формы, так как это может ингибировать ферментные реакции. В типичных буферных условиях 1 мкм = 3000 bp ДНК14. Кроме того, захватывая 10-20 мкм от покровного листа, комплекс ДНК позиционируется далеко от поверхности, тем самым сводя к минимуму поверхностные взаимодействия.
Многие методы были использованы для создания каналов микрофлюидных устройств, и они могут быть сделаны в лаборатории или проточные ячейки могут быть приобретены из коммерческих источников 6,15,16,17. Оптимальные материалы, используемые для построения проточных ячеек, должны быть механически жесткими, оптически прозрачными с низкой флуоресценцией и непроницаемыми для органических растворителей6. Часто боросиликатное флоат-стекло или плавленый кремнезем используются для обеспечения стабильной среды потока в течение длительного времени, которая подходит для оптического улавливания, визуализации и обнаружения силы. Эти материалы также позволяют использовать неводные растворители (например, спектрофотометрический метанол) для упрощения поверхностного смачивания и удаления пузырьков воздуха, а также денатуранты (например, 6M гуанидиния гидрохлорид) или моющие средства для очистки проточной ячейки. Наконец, методы, используемые для введения жидкостей в проточные ячейки, варьируются от сложных вакуумных насосных систем до насосов с одним шприцем 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. В описанном здесь подходе используется шприцевой насос, который может вместить до 10 шприцев (рисунок 3А). Это обеспечивает гибкость при использовании одноканальных проточных ячеек или проточных ячеек с несколькими входными каналами. Здесь используется трехканальная проточная ячейка, которая соединена со шприцами, удерживаемыми на месте на шприцевом насосе с использованием трубки поли-эфир-эфир-кетон (PEEK) (рисунок 3A-C). Поток жидкостей контролируется четырехходовыми переключающими клапанами и, таким образом, служит для минимизации введения пузырьков в проточную ячейку (рисунок 3A,D). Кроме того, рекомендуются газонепроницаемые шприцы Hamilton, которые имеют жесткие стеклянные стенки и плунжеры с политетрафторэтиленовым (PTFE) покрытием, поскольку они обеспечивают исключительно плавное движение плунжера, что необходимо для получения плавного потока14,27.
В описанной экспериментальной системе использовались проточные ячейки с двумя-пятью входными каналами. Количество входных каналов диктуется проводимым экспериментом. Для исследования RecBCD и Hop2-Mnd1 было достаточно двух потоковых каналов14,28. Для геликазы фермент связывали со свободным концом ДНК и переводили в поток, содержащий магний и АТФ, чтобы инициировать транслокацию и раскручивание. Для Hop2-Mnd1 оптически захваченную ДНК переводили в соседний поток жидкости, содержащий белки и буферные ± двухвалентных ионов металлов. Использование трехканальных проточных клеток позволяет улавливать ДНК в потоке 1, переводить ДНК в поток 2, чтобы обеспечить связывание белка, а затем в поток 3, где присутствует АТФ, например, инициировать реакции. Вариацией вышесказанного является использование флуоресцентного помеченного белка в канале 2, что приводит к тому, что поток жидкости становится полностью белым и исключает визуализацию ДНК. Когда эта молекула транслируется в поток 3, и белки, и ДНК теперь видны, когда инициируются реакции.
Использование четырехходовых переключающих клапанов для управления потоком жидкости является критически важным компонентом системы для устранения пузырьков в проточных ячейках. Пузырьки наносят ущерб стабильному потоку жидкости, поскольку они сжимаются и расширяются непредсказуемым образом, что приводит к быстрым изменениям скорости потока и введению турбулентности. Когда клапаны расположены между шприцами и впускными трубками, путь потока отключается путем переключения положения клапана при смене шприцев. Когда новый шприц установлен на место, плунжер может быть вручную нажат, так что >6 мкл выбрасывается (мертвый объем клапана), и это почти полностью устраняет пузырьки.
Прикрепление соединителей к проточным ячейкам часто является шагом, ограничивающим скорость использования проточной ячейки. Описано использование двух типов разъемов: съемных, известных как press-fit, и постоянных (нанопортовых сборок). Съемные разъемы легко прикрепляются к проточной ячейке, и различные типы гибких трубок в дополнение к рекомендуемому PTFE могут быть протестированы с этими разъемами. Это быстрый и экономичный способ тестирования трубок и соединителей без ущерба для более дорогих стеклянных проточных ячеек. Напротив, нанопортовые сборки крепятся постоянно, выдерживают давление до 1000 фунтов на квадратный дюйм, и, в наших руках, их использование ограничено трубками PEEK разных диаметров. Это не является недостатком, так как предпочтительно использовать трубки PEEK. Одна стеклянная проточная ячейка с прикрепленными постоянными узлами может быть повторно использована более 1 года при тщательном использовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Выравнивание и тестирование лазерной ловушки с полистирольными шариками
ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки обратитесь к рисунку 1A,B.
ВНИМАНИЕ: Экспериментатор должен носить соответствующие защитные очки или лазерные защитные очки во время выравнивания лазерного луча. Поскольку оптическая система пинцета, описанная в настоящем описании, использует как HeNe, так и ИК-лучи, требуются два отдельных набора лазерной безопасной стеклянной посуды.
- Выравнивание луча HeNe
- Расположите все оптические компоненты на макетной плате. Выровняйте макетную доску так, чтобы она была как можно ближе к углу 90° относительно микроскопа.
- Прикрепите к микроскопу сопрягаемую трубку, содержащую объектив и телановую линзу (рисунок 1А-11,12).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив telan представляет собой линзовую систему, которая используется для фокусировки изображения в промежуточной плоскости изображения в окулярах. - Включите лазер HeNe и откройте затвор (рисунок 1А-18). Луч должен ударить фильтром (рисунок 1А-3) на высоте 54 мм, отражая 50% света на зеркало 5 (рисунок 1А-5). Остальные 50% луча ударяются о зеркало 4 (рисунок 1А-4) на той же высоте, что и зеркало 3.
- Отрегулируйте зеркало 4 (рисунок 1А-4) так, чтобы луч ударялся о зеркало 6 (рисунок 1А-6) на высоте 51 мм.
- Отрегулируйте зеркало 6 (рисунок 1А-6) так, чтобы луч был направлен на нижнее гальваническое зеркало на высоте 51 мм. Луч, выходящий из верхнего гальванического зеркала, будет на уровне 57,5 мм.
- Отрегулируйте зеркало 3 (рисунок 1А-3) так, чтобы этот луч ударялся о зеркало 5 (рисунок 1А-5) на высоте 57,5 мм. После отражения от зеркала 5 луч должен удариться о зеркало 9 (рисунок 1А-9) на той же высоте. Луч эффективно рекомбинируется в зеркале 9, проходит через объектив, а система линз телана на зеркало 21 (рисунок 1А-21), которое отражает его в объектив.
- Поместите чистый слайд микроскопа на сцену микроскопа. Включите камеру и нарисуйте лучи фиксированного и сканирующего лучей по отдельности на экране. Начиная с зеркала 3, затем 5 и 9, наконец, 21, выполняйте небольшие корректировки, чтобы расположить фиксированный луч в центре экрана.
- Чтобы убедиться, что угол выхода из зеркала луча 21 составляет 90°, измените Z-высоту микроскопа и расположите луч, изображенный на верхней и нижней поверхностях слайда. Когда они идентичны, луч находится в правильном положении, которое перпендикулярно сцене. Закройте этот луч с помощью затвора 19 (рисунок 1А-19).
- Начиная с зеркал 4 и 6, выполните небольшие настройки, чтобы расположить фиксированный луч в центре экрана. Затвор этого луча.
- Выравнивание инфракрасного (ИК) луча
ВНИМАНИЕ: Выполняйте все шаги при низкой мощности лазера по соображениям безопасности.- Отрегулируйте волновую пластину 14 (фиг.1А-14) для регулировки соотношения передаваемых и отраженных пучков, расщепляемых на делителе пучка 2 (фиг.1А-2). Делитель луча 2 отражает s-компонент лазерного луча и передает p-компонент.
- Луч, проходящий через 2, ударяется о зеркало 7 (рисунок 1А-7), которое отклоняет луч на нижнее гальваническое зеркало. Он должен следовать по пути луча HeNe на зеркало 21. Выполняйте небольшие движения зеркала 7 для достижения этого позиционирования.
- Отрегулируйте зеркало 2 так, чтобы луч, отраженный зеркалом 2, ударял по зеркалу 10 (рисунок 1А-10) на высоте 57,5 мм.
- Луч отражается от зеркала 10 на зеркало 8 (рисунок 1А-8) на высоте 57,5 мм. Последующий луч должен ударить зеркалом 9 на той же высоте. Если нет, внесите небольшие коррективы в зеркала 10 и 8 по мере необходимости.
- Снимите объектив и поместите головку измерителя мощности над портом в объективную башню.
- Используйте пластины 14, 15 и 16 (рисунок 1A-14,15,16) для регулировки мощности каждого лазерного луча таким образом, чтобы они были равны, как показано на рисунке 1C.
- Поставьте расширитель балки 1 (рисунок 1А-1) на место. Отрегулируйте расширенный лазерный луч, чтобы он был круглым без комы или астигматизма.
- Для проверки оптических ловушек делают раствор из 1 мкм полистирольных шариков, взвешенных в воде. Затем поместите 10 мкл этого раствора на предметное стекло микроскопа, сверху поместите накладку и запечатайте лаком для ногтей. Поместите затвор на ступень микроскопа и проверьте оптические ловушки, захватив эти шарики размером 1 мкм. Убедитесь, что бусины засасываются в ловушки и удерживаются стабильно при перемещении сцены. Отлов должен происходить одинаково эффективно со всех сторон ловушки.
2. Подготовка микрофлюидной камеры
- Если проточная ячейка представляет собой коммерчески сконструированное устройство, изготовленное из полидиметилсилоксана (PDMS) на крышке, перейдите к этапу 3. Если это стеклянное устройство с подключенными разъемами, перейдите к шагу 4.
- Если проточная ячейка не имеет разъемов, сначала прикрепите их к входным отверстиям на слайде микроскопа. В шаге 3 приведены инструкции по подключению соединителей.
3. Соединения проточных ячеек с помощью проточной ячейки PDMS
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2D.
- Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность. Удерживайте трубку из PTFE на расстоянии 3 мм от свободного конца щипцами. Вставьте трубку в предварительно сформированное отверстие (порт может поддерживать давление в линии 2 бара).
- Повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов. Подключите входные отверстия к шприцевому насосу, а выходное отверстие к бутылке для отходов (рисунок 4A,B).
- Наполните каждый стеклянный шприц 1 мл спектрофотометрического метанола. Прикрепите каждый шприц к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувайте каждую линию 50 мкл метанола (рисунок 4C, закрытое положение).
- Переключите положение выходного отверстия на проточную ячейку (рисунок 4C, открытое положение). Перекачивайте 800 мкл метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 мкл/ч для намокания поверхностей и устранения пузырьков.
- На следующий день повторите этот процесс, используя 800 мкл сверхчистой воды. Теперь проточная ячейка готова к использованию.
4. Крепление разъемов для нажимной трубки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2F.
- Если необходимо использовать нажимные соединители трубки, осторожно снимите клейкую ленту с одной стороны разъема и поместите ее над отверстием в слайде микроскопа. Нажмите вниз в течение нескольких секунд. Повторите этот процесс для остальных соединителей.
- Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность. Удерживайте трубку из PTFE на расстоянии 3 мм от свободного конца щипцами. Вставьте трубку в предварительно сформированное отверстие в порту и повторите эту процедуру для каждого из оставшихся портов.
- Прикрепите трубку от впускных отверстий к переключающим клапанам. Перейдите к шагу 7.
5. Прикрепление постоянных собраний
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настройки обратитесь к рисунку 2A-C.
- Выполните крепление либо на чистой, плоской поверхности, либо на специально изготовленном коллекторе, чтобы удерживать проточную ячейку и соединители на месте во время склеивания.
- Поместите проточную ячейку на чистую плоскую поверхность или в утопленную секцию коллектора (рисунок 2B). Поместите небольшое количество стеклянного клея на дно сборки и вставьте уплотнение.
- Расположите нанопорт над одним из входных отверстий на слайде микроскопа. Осторожно надавите вниз и удерживайте на месте без бокового движения. Повторите этот процесс для остальных портов.
- Дайте высохнуть или зажать на месте в коллекторе. Осторожно извлеките проточную ячейку из коллектора и убедитесь, что сборки хорошо выровнены с входными портами в проточной ячейке. Перейдите к шагу 7, когда будете готовы.
6. Соединения и подготовка проточных ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки обратитесь к рисунку 4A,B.
- Поместите проточную ячейку на ступень микроскопа. Прикрепите трубку с помощью герметичных разъемов.
- Наполните каждый стеклянный шприц 1 мл спектрофотометрического метанола. Прикрепите каждый шприц к переключающему клапану. Убедитесь, что клапан имеет выходное отверстие, направленное на отходы, и продувайте каждую линию 50 мкл метанола (рисунок 4C, закрытое положение).
- Переключите положение выходного отверстия на проточную ячейку (рисунок 4C, открытое положение). Перекачивайте 800 мкл метанола через проточную ячейку со скоростью потока 100 мкл/ч для намокания поверхностей и устранения пузырьков.
- На следующий день повторите этот процесс, используя 800 мкл сверхчистой воды. Теперь проточная ячейка готова к использованию.
7. Контроль потока жидкости
- Поверните переключающие клапаны в закрытое положение (рисунок 4C). Извлеките шприцы, выбросьте остаточную воду, а шприцы наполните экспериментальными растворами, например, ДНК-шариками; фермент; и СПС. Верните шприцы в насос и подключите их к переключающим клапанам.
- В этом положении вручную зажмите плунжеры вниз на 5-10 мкл, чтобы удалить пузырьки. Измените положение переключающего клапана на Открыть.
- Используйте схему расхода для достижения оптимальной скорости потока жидкости для улавливания и визуализации, как описано в таблице 1. Оптимальный поток жидкости для оптического улавливания должен обеспечивать стабильное улавливание шариков, и как только ДНК растягивается, она должна быть B-формой (~ 3000 bp / μm).
8. Улавливание полистирольных шариков с прикрепленными одиночными молекулами ДНК
- При 10-кратном увеличении найдите границу между потоками жидкости близко к точкам входа в канал. Добавьте масло к 100-кратному объективу и переключитесь на более высокое увеличение.
- Откройте жалюзи для оптических ловушек (оба или по одному). Сфокусированные лазерные лучи должны захватывать бусины, а ДНК должна немедленно растягиваться.
- После того, как комплекс был захвачен, переведите стадию перпендикулярно потоку (рисунок 3A, C, вставка). Это переместит захваченный комплекс из раствора ДНК в поток 2. Дальнейший перевод переместит комплекс в поток 3.
9. Очистка проточных ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте это ежедневно.
- Выключите насос после завершения эксперимента. Поверните переключающие клапаны в закрытое положение (рисунок 4C).
- Снимите шприцы и опорожните их. Промыть три раза фильтрованной дистиллированной водой.
- Наполните шприцы чистящим раствором. Поместите шприцы в насос и подключите к переключающим клапанам.
- Продувка коммутационных клапанов и изменение положения на открытие. Перекачивайте 800 мкл чистящего раствора со скоростью потока 100 мкл/ч обычно в течение ночи.
- На следующий день закройте переключающие клапаны, а затем снимите и промойте шприцы водой. Промыть проточную ячейку и линии 4-800 мкл воды со скоростью потока 400-800 мкл/ч. Если требуется более напряженная очистка проточных клеток, замените чистящий раствор 6 М гуанидия гидрохлорида.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первоначальные испытания выравнивания и прочности ловушки проводятся с помощью 1 мкм, нефлуоресцентных полистирольных шариков. Поскольку большая часть исследований, проведенных в лаборатории, использует флуоресценцию, мы дополнительно проверяем прочность ловушки с использованием 1 мкм, зеленых полистирольных шариков Dragon (рисунок 1D, E). После этого работа переходит на оптическое улавливание ДНК-шариковых комплексов, где ДНК окрашивается бис-интеркалирующим красителем YOYO-114,29. Когда эти комплексы задерживаются на 10-15 мкм над поверхностью покрова в микрофлюидной проточной клетке, поток жидкости мимо шарика растягивается на ДНК (рисунки 3B, C). Важно измерить длину растянутой жидкостью ДНК, чтобы убедиться, что она растянута до своей длины B-формы, которая является ожидаемой длиной. Например, для лямбда-ДНК бактериофага полная длина немного длиннее 16 мкм, что соответствует 48 504 bp14.
Для характеристики потока жидкости флуоресцентные шарики вводили в проточные ячейки с высотой фокусировки 15 мкм над поверхностью покрова с использованием различных скоростей насоса и в растворах разной вязкости. Были сняты фильмы о положении бисера, а положение бисера отслеживалось с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Результаты показывают, что для шариков диаметром 1 мкм линейная скорость может быть точно отслежена при скорости потока насоса 100 мкл/ч в растворах сахарозы в диапазоне от 10% до 50% (рисунок 5А). В аналогичных условиях сила на шарике может быть рассчитана и найдена в диапазоне от 10 до 400 пН, в зависимости от расхода насоса и вязкости раствора (рисунок 5B). Наконец, влияние диаметра шарика в диапазоне от 120 до 970 нм на силу оценивали в различных концентрациях сахарозы. Данные показывают, что силы в диапазоне от 1 до 27 пН могут быть измерены путем прикрепления шариков разного диаметра к моторному белку и спроса на двигатель тянуть эту бусину против потока жидкости (рисунок 5C).
Рисунок 1: Оптическая компоновка и демонстрация треппинговой активности. (А) Схема оптической компоновки с ИК-лучом красного цвета и лучом HeNe черного цвета. (B) Фотография оптических компонентов, установленных на макетной плате. Номера компонентов в панелях A и B следующие: 1), Расширитель луча; 2), Интерференционное зеркало (Rsmax = 1064 нм; Tpmax = 1064 нм); 3), Интерференционные зеркала (633 нм; R = 50%; T = 50%); 4-6), Интерференционные зеркала (Rmax = 633 нм); 7), Интерференционное зеркало (Rmax = 1064 нм; Tmax= 633 нм); 8), Интерференционное зеркало (Rsmax = 1064 нм; Tpmax = 1064 нм, Tmax = 633 нм); 9), Интерференционное зеркало (Rmax = 1064 нм, 633 нм; Tmax = 1064 нм, 633 нм); 10), Интерференционное зеркало (Rmax = 1064 нм); 11), объектив, f = 110 нм; 12), объектив Телана; 13), Гальванические зеркала; 14-16), ротаторы (/2); 17), затвор канала ИК-сканирования; 18), Видимый затвор канала; 19), ИК Фиксированный канальный затвор; 20), остановки луча и 21), интерференционное зеркало (Rmax = 1064 нм; Tmax = 633 нм). (C) Измерение выходной мощности. Выходная мощность от лазера измеряется перед установкой лазерной головки в оптическую компоновку. После выравнивания ловушки мощность луча измеряется после 100-кратного объектива для каждой ловушки. (D) и (E) Изображения, демонстрирующие стабильное, оптическое улавливание флуоресцентных шариков размером 1 мкм. F, фиксированная ловушка и M, мобильная ловушка с подвижной ловушкой в режиме сканирования, проходящая по малому (D) или большому (E) кругу на частоте 30 мГц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микрофлюидные проточные клетки. (A) Сборка трехканальной проточной ячейки, изготовленной из боросиликатного стекла. (B) Коллектор для стабильного позиционирования проточных ячеек во время склеивания соединителя. Сверху, основание алюминиевого коллектора с утопленным сечением 1 мм для бокового расположения проточной ячейки. Четыре стойки (по одной в каждом углу) направляют крышку коллектора в нужное положение, в то время как более центрально расположенные резьбовые болты используются для зажима крышки на месте. Дно, крышка коллектора с просверленными отверстиями для соответствия стойкам и болтам на основании коллектора. (1), гайки, которые крепятся к опорным болтам коллектора; (2) пружины, которые помещаются между гайками и крышкой коллектора для обеспечения легкого натяжения в процессе склеивания. (C) Крупный план конвергенции входных каналов в общий единый поток жидкости в стеклянной проточной ячейке с уже подключенными соединителями. Четверть помещается рядом с проточной ячейкой в качестве эталона. (D) Изображение проточной ячейки PDMS. Толщина слоев PDMS составляет 3 мм. (E) Плавленая проточная ячейка кремнезема с соединителями luer. (F) Проточная ячейка из боросиликатного стекла с прижимными соединителями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристики потока жидкости через стеклянную проточную ячейку. (A) Поток жидкости внутри проточной ячейки является ламинарным. Схема показывает проточную ячейку сверху, чтобы продемонстрировать, что межканальная диффузия является основным источником смешивания между соседними потоками жидкости. Направление потока обозначается синими стрелками, а отдельные потоки окрашены в белый, светло-серый и белый цвета. Расширяющиеся области поперечной диффузии между каналами обозначены красным цветом. Вставка показывает флуоресцентное изображение соседних потоков жидкости при 10-кратном увеличении с флуоресцентно-мечеными ДНК-шариковыми комплексами в нижнем потоке и буфером только в верхнем потоке. Белые пятна в верхнем потоке снимают шум с ПЗС-камеры. (B) Профиль потока (светло-фиолетовый) в пластинчатых проточных ячейках является параболическим. Проточная ячейка просматривается сбоку и направление потока указывается над каждой ячейкой. Самые быстрые скорости жидкости происходят в проточной ячейке, расположенной в центре, в то время как самые медленные скорости жидкости происходят рядом с поверхностями проточных клеток. Следовательно, для оптически захваченного комплекса ДНК-шарик, расположенного в центре проточной клетки, поток жидкости растягивает молекулу ДНК бактериофага λ (48 504 bp) до 16 мкм (B-форма), так что можно сделать четкую визуализацию (левое изображение). Напротив, та же молекула, расположенная вблизи поверхности проточной ячейки, испытывает низкие скорости потока и не может быть растянута. (C) Один комплекс БУСИН ДНК расположен внутри проточной клетки. Можно использовать ячейки различной глубины потока, но в каждом случае выравнивание пучка может быть установлено таким образом, чтобы оптимальное улавливание происходило на 10-20 мкм над поверхностью покрова, что устраняет поверхностные эффекты и имеет стабильный поток, так что молекулы ДНК могут быть растянуты до B-формы. Как указано на левом изображении в (C), ДНК растягивается для обеспечения четкой визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Управление потоком и реакцией оптически захваченной ДНК внутри проточной клетки на стадии микроскопа. (А) Сопряжение проточной клетки со шприцевым насосом. Представлена фотография трехканальной проточной ячейки, подключенной к шприцевому насосу с помощью трехходовых переключающих клапанов. Проточная ячейка удерживается на месте на моторизованной ступени в перевернутом микроскопе. Проточная ячейка соединена с отработанной линией (слева) и переключающими клапанами (пунктирный голубой круг) через оранжевую трубку размером 500 мкм (обозначена зеленой лентой). Клапаны стабильно установлены на специально изготовленном коллекторе, адаптированном к шприцевому насосному аппарату, в котором находятся газонепроницаемые шприцы объемом 1 мл (желтые стрелки разграничивают плунжеры). Линии отходов используются для удаления пузырьков воздуха, которые могут быть захвачены в переключающем клапане во время смены шприца. (B) Крупный план трехканальной проточной ячейки. Чтобы облегчить визуализацию потоков жидкости, внешние были окрашены пищевым красителем с центральным потоком, содержащим только воду. Увеличенная область показывает, как оптически захваченный молекулярный комплекс шарик-ДНК переводится из одного потока жидкости в другой (синяя стрелка), переводя стадию перпендикулярно потоку (черная стрелка). С) Схемы трехходовых переключающих клапанов с указанием их рабочего положения. Буквенные обозначения F, S и W соответствуют направлению жидкости и могут течь в проточную ячейку, шприц и отходы соответственно. Один порт постоянно закрыт, как указано в черной вилке в верхней части каждой схемы. В открытом или рабочем положении (левая панель) поток жидкости проходит непосредственно через переключающий клапан от шприца (S) к проточной ячейке (F). В закрытом положении (правая панель) циферблат поворачивается таким образом, чтобы проточная ячейка была изолирована от окружающей среды. В этом положении поток направляется на отходы, и шприцы могут быть выключены без введения пузырьков воздуха в проточную ячейку. Поскольку клапаны имеют мертвый объем 6 мкл, очень мало раствора тратится впустую при продувке линий перед возвратом к открытой конфигурации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Движение шарика и противоположная сила зависят от потока жидкости. (A) Линейная скорость шарика зависит от скорости насоса и концентрации сахарозы. (B) На противоположную силу на шарике влияет вязкость раствора. (C) Диаметр шарика влияет на силу на бусины под потоком. Во всех экспериментах использовались флуоресцентные бусины (Dragon green). В (A) и (B) использовались бусины диаметром 0,97 мкм, а в (C) использовались бусины разного диаметра. Растворы сахарозы изготавливали в сверхчистой воде, фильтровали через фильтры 0,2 мкм и показатель преломления, измеренный с помощью ручного рефрактометра, с вязкостью, определяемой в сантипуазе с использованием таблиц ISCO и, наконец, преобразованной в единицы СИ в мПа.с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Расход (мкл/ч)b | Время на шаг (мин) | Объем дозированный (мкл) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 или более | 1 или более |
| a. Это скорость потока жидкости, рассчитанная программным обеспечением шприцевого насоса и уникальная для каждого используемого диаметра шприца. Скорость потока обеспечивает быстрое заполнение линий и проточной камеры (800 мкл/ч) с последующим постепенным снижением до идеальной скорости потока для улавливания и визуализации | ||
| b. Шприцевым насосом можно управлять с клавиатуры или с помощью программного обеспечения, предоставленного поставщиком. | ||
Таблица 1: Скорость потока жидкости для минимизации пузырьков и достижения стабильного улавливания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тщательная сборка системы потока имеет решающее значение для успешного исхода экспериментов 4,6. Одним из наиболее сложных аспектов протокола является прикрепление разъемов к поверхности стекла. Для этого мы используем следующие два подхода: прижимные подгонки трубных разъемов и нанопортовые сборки. Прижимные разъемы легко прилипают к стеклу с последующим проталкиванием трубки из PTFE в предварительно сформированные отверстия с помощью щипцов. Когда требуется более стабильное крепление, предпочтительно склеивание нанопортовых сборок. При тщательном использовании и очистке одна стеклянная проточная ячейка с постоянными сборками может использоваться более 1 года. Если проточные ячейки необходимо выключать чаще, можно использовать проточные ячейки PDMS, поскольку они являются отличной и более дешевой альтернативой. Они могут быть повторно использованы, но PDMS подвержена отеку, который может со временем изменить поведение потока жидкости.
Как стеклянные, так и PDMS проточные ячейки не являются неразрушимыми. В лаборатории используется максимальный расход 800 мкл/ч. Если это превышено ежедневно и/или в течение длительных периодов времени, может произойти деформация проточных ячеек (стеклянных проточных ячеек) и искажение PDMS. Хотя первоначальная процедура смачивания метанолом и водой требует времени, она того стоит, так как все пузырьки устранены, а также могут быть обнаружены утечки в соединителях. Описанные здесь проточные ячейки обеспечивают гибкость проводимых экспериментов. Используя эти подходы различных проточных ячеек, трубок и крепления различных разъемов, экспериментальные условия могут быть легко адаптированы и быстро оптимизированы для обеспечения получения оптимальных данных. Представлены Y-образные канальные проточные ячейки, но существует широкий спектр микрофлюидных конструкций устройств от нескольких компаний как без, так и с подключенными разъемами. Это обеспечивает исследователю еще большую гибкость в экспериментальном проектировании.
Использование четырехходовых переключающих клапанов является простым и эффективным методом, который гарантирует, что после сборки и тестирования системы потока она фактически становится закрытой средой, где загрязнение минимально, а пузырьки устраняются. Последнее имеет решающее значение, поскольку пузырьки имеют тенденцию сжиматься и распаковываться случайным образом во время эксперимента, и это нарушает поток жидкости, заставляя захваченные молекулы ДНК двигаться неожиданным образом и даже ломаться. Следует проявлять большую осторожность, чтобы гарантировать, что они не образуются в системе.
Наконец, система, описанная здесь, оптимизирована для визуальной биохимии, где может быть выполнен тщательный анализ ДНК, бусин, прикрепленных к белкам, или флуоресцентно-помеченных белков. Хотя система не предназначена для измерения силы с помощью двойных ловушек и добавления квадрантных фотоприемников, силы могут быть измерены путем присоединения шариков разного диаметра к моторным белкам ДНК, например, и запроса двигателя тянуть эту бусину против потока жидкости. Изменяя вязкость раствора, поток жидкости и диаметр шарика, можно приложить большой диапазон противоположных сил, чтобы обеспечить детальное понимание функции моторного белка (рисунок 5). Это простой и недорогой способ измерения сил, связанных с биологическими транзакциями, но ему не хватает точности, связанной с более чувствительными подходами. Когда визуальный биохимический подход сочетается с чувствительными методами обнаружения силы, могут быть предоставлены более полные картины биохимических реакций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Bianco поддерживаются грантами NIH GM100156 и GM144414 P.R.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M.
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
